RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Summary

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

Abstract

A técnica de criação de perfil ribossomo (RIBO-seq) é atualmente a ferramenta mais eficaz para estudar o processo de síntese proteica in vivo. A vantagem deste método, em comparação com outras abordagens, é sua capacidade de monitorar a tradução mapeando precisamente a posição e o número de ribossomos em uma transcrição mRNA.

Neste artigo, descrevemos as etapas consecutivas de coleta e preparação da amostra para o método RIBO-seq em bactérias, destacando os detalhes relevantes para o planejamento e execução do experimento.

Uma vez que o RIBO-seq conta com ribossomos intactos e mRNAs relacionados, o passo chave é a rápida inibição da tradução e a desintegração adequada das células. Assim, sugerimos filtração e congelamento de flash em nitrogênio líquido para colheita celular com um pré-tratamento opcional com clororamfenícol para prender a tradução em bactérias. Para a desintegração, propomos moer células congeladas com argamassa e pilão na presença de óxido de alumínio para interromper mecanicamente a parede celular. Neste protocolo, não é necessária uma almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação gradiente de sacarose para purificação monossótil. Em vez disso, a separação mRNA usando eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) seguida pela excisão da pegada ribossômica (banda 28-30 nt) é aplicada e fornece resultados satisfatórios. Isso simplifica em grande parte o método, bem como reduz os requisitos de tempo e equipamento para o procedimento. Para a preparação da biblioteca, recomendamos usar o kit RNA pequeno disponível comercialmente para sequenciamento de illumina da New England Biolabs, seguindo as diretrizes do fabricante com algum grau de otimização.

As bibliotecas cDNA resultantes apresentam quantidade e qualidade adequadas para o sequenciamento de próxima geração (NGS). O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com os resultados do protocolo descrito em leituras mapeadas exclusivamente por amostra fornece dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é rápido e relativamente fácil e pode ser realizado com equipamentos de laboratório padrão.

Introduction

A técnica de perfil ribossomo (RIBO-seq) foi desenvolvida no laboratório de Jonathan Weissman na Universidade da Califórnia, São Francisco¹. Em comparação com outros métodos usados para estudar a expressão genética no nível translacional, RIBO-seq concentra-se em cada ligação ribossosome ao mRNA e fornece informações sobre sua localização e o número relativo de ribossomos em uma transcrição. Permite monitorar o processo de síntese proteica in vivo e pode fornecer resolução e precisão de códon único permitindo a medição da densidade ribossomo em ambos, o mRNA individual e ao longo de todo o transcriptome na célula. Na base da técnica RI....

Protocol

1. Coleta de amostras

1. Prepare uma cultura bacteriana. Recomendamos um volume cultural de 100 mL por amostra.
2. Preparar equipamentos e reagentes para coleta de amostras: duas scoopulas por amostra, filtros de membrana de ésteres de celulose mista (MCE) de 0,45 μm, tubos estéreis de 50 mL, nitrogênio líquido, 50 mg/mLram clorofenicol em 70% (vol/vol) de etanol (opcional). Puna a tampa de tubos de 50 mL para permitir a evaporação de nitrogênio líquido e evitar a explosão de tubos fechados. Descontaminar scoopulas com detergente de laboratório e 70% de etanol.
3. Pré-aquecimento do equipamento de filtragem e uma das scoopulas à temperatura de cre....

Results

Os resultados exemplares aqui apresentados foram obtidos em estudo que examinou a regulação da tradução na esporosulação das células subtilis WT Bacillus. As culturas durante a noite foram diluídas para OD₆₀₀ igual a 0,1 em 100 mL de médio rico e incubadas a 37 °C com agitação vigorosa até OD₆₀₀ atingir 0,5-0,6. O meio rico foi então substituído por meio mínimo para induzir processo de esporulação e a incubação foi continuada por até quatro horas. As células eram colhidas a cada hora começa.......

Discussion

O principal desafio técnico do perfil ribossomo é a necessidade de inibir rapidamente a tradução para capturar um instantâneo de ribossomos em mRNAs em um determinado estado fisiológico de interesse. Para isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. A aplicação de antibióticos é opcional, pois podem causar artefatos. Chloramphenicol é uma droga comumente usada para prender ribossomos alongamentos em RIBO-seq bacteriana. No entanto, não impede a iniciaçã.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (pó)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoetanol, 99%, puro	Acros Organics	125472500
Adenosina 5'-Trifosfato (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Óxido de alumínio calcinado puro p.a.	Chempur	114560600
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Cloranfenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrador -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinante, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA sal dissódico	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Aparelho de filtração	VWR Collection	511-0265	aparelho de filtração todo em vidro, com funil, fundo fritado, tampa, 47 mm Ø grampo de mola e frasco de junta retificada
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Corante de Carregamento de Gel, Azul, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosina 5′-[β,&gama;-imido]trifosfato sal trissódico hidrato	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& A Biotecnologia	040-500
Acetato de magnésio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrana fiter	Tecnologia Alfatec	M47MCE45GWS	tamanho dos poros: 0.45um
MICROBExpress Purificação de mRNA bacteriano	Invitrogen	AM1905
Conjunto de preparação de biblioteca de RNA pequeno multiplex para Illumina	New England Biolabs	E7300S
Água Nuclease-livre	Ambion	AM9937
acetato de potássio anidro puro P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Carga Rápida pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrador -25	Zymo Research	R1018
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Carbonato de sódio	Sigma-Aldrich	223530-500G
Hidrogenocarbonato de sódio puro p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold ácido nucleico gel mancha	Life Technologies	S11494
T4 Polinucleotídeo Quinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Tampão de Reação de Polinucleotídeo Quinase	New England Biolabs	B0201S
TBE-Ureia Tampão de Amostra (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hidroximetil)aminometano, ultrapuro, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Ureia G.R.	lach:ner	40096-AP0