Quantificação de Densidades Celulares e Propriedades Antigênicas usando Levitação Magnética

Summary

Este artigo descreve um método baseado em levitação magnética que pode detectar especificamente a presença de antígenos, solúveis ou ligados à membrana, quantificando mudanças na altura de levitação das contas de captura com densidades fixas.

Abstract

O método descrito foi desenvolvido com base nos princípios da levitação magnética, que separa células e partículas com base em sua densidade e propriedades magnéticas. Densidade é um tipo de célula que identifica propriedade, diretamente relacionada à sua taxa metabólica, diferenciação e status de ativação. A levitação magnética permite uma abordagem de um passo para separar, imagem e caracterizar com sucesso as células sanguíneas circulantes, e detectar anemia, doença falciforme e células tumorais circulantes com base na densidade e propriedades magnéticas. Esta abordagem também é favorável à detecção de antígenos solúveis presentes em uma solução usando conjuntos de contas de baixa e alta densidade revestidas com anticorpos de captura e detecção, respectivamente. Se o antígeno estiver presente na solução, ele fará a ponte entre os dois conjuntos de contas, gerando um novo complexo de contas de contas, que levitará entre as fileiras de contas revestidas de anticorpos. O aumento da concentração do antígeno alvo na solução gerará um número maior de complexos de contas de contas quando comparados com menores concentrações de antígeno, permitindo assim medições quantitativas do antígeno alvo. A levitação magnética é vantajosa para outros métodos devido ao seu tempo de preparação amostral reduzido e à falta de dependência dos métodos clássicos de leitura. A imagem gerada é facilmente capturada e analisada usando um microscópio padrão ou dispositivo móvel, como um smartphone ou um tablet.

Introduction

Levitação magnética é uma técnica desenvolvida para separar, analisar e identificar os tipos celulares^1,2,3, proteínas^4,5 e opioides 6 baseadas^apenas em sua densidade específica e propriedades paramagnéticas. A densidade celular é uma propriedade única e intrínseca de cada tipo celular diretamente relacionada à sua taxa metabólica e ao estado de diferenciação^7,8,9,10,....

Protocol

O protocolo experimental utilizado neste estudo foi aprovado pelo Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Configuração do instrumento

NOTA: As células levitando de imagem requer dois ímãs de neodímio de terras raras magnetizados no eixo z para serem colocados com o mesmo polo voltados um para o outro para gerar um campo magnético. A distância entre os ímãs pode ser personalizada dependendo da intensidade do campo magnético e da densidade dos alvos. Neste caso, os ímãs são separados por um espaço de 1mm suficiente para a inserção de um tubo capilar de vidro quadrado de 1x1 mm de com....

Results

A levitação magnética concentra objetos de diferentes densidades em diferentes alturas de levitação, dependendo da densidade do objeto, sua assinatura magnética, a concentração de solução paramagnética e a força do campo magnético criado por dois ímãs fortes e de terras raras. À medida que os dois ímãs são colocados em cima um do outro, as amostras levitando só podem ser vistas, mantendo a iluminação de Köhler, usando um microscópio virado de lado(Figura 1). A altura final de levitação alcan.......

Discussion

Centrifugação gradiente é atualmente a técnica padrão para isolar componentes subcelulares com base em suas densidades únicas. Essa abordagem, no entanto, requer o uso de meios de gradientes especializados, bem como equipamentos de centrífuga. A abordagem de levitação magnética aqui apresentada permite uma investigação detalhada das propriedades morfológicas e funcionais das células circulantes, com mínimo, se alguma manipulação das células, proporcionando um acesso quase in vivo às células circulantes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hidrato de ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); componente do tampão de ativação
50x2,5x1 mm ímãs, niquelado (Ni--Ni), grau N52, magnetizado através de 5 mm (0,197 ") de espessura	K & J Magnetics		Custom Magnets usados para o dispositivo de levitação magnética
Selante de tubo capilar (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Usado para tampar as extremidades dos tubos capilares
Filtros de tubo de centrífuga (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Usado para lavar contas
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Usado para ajustar o dispositivo de levitação magnética
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190-144	Solução para suspensões de contas
Etanolamina	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Usado durante uma etapa de lavagem para contas
Mancha de membrana plasmática fluorescente (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Usado para corar células Rh+
Injeção de Gadoteridol	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolínio (Gd3+); solução magnética usada para suspender células
HBSS++	Gibco	14025-092	Solução para preparação de amostras
Complexo C5b humano,6	Complement Technology, Inc	A122	Usado para gerar RBC Evs
Proteína C7 humana	Complement Technology, Inc	A124	Usado para gerar RBC
Evs Proteína C8 humana	Complement Technology, Inc	A125	Usado para gerar RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Usado para gerar RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Usado para fixar o dispositivo de levitação magnética para tomadas de laboratório
Cloridrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); usado na reação de acoplamento de anticorpos
Controle	normal de IgG de coelhoR& D Systems	AB-105-C	Usado para revestir grânulos como condição de controle
Solução salina tamponada com fosfato (solução 10X, pH 7,4)	Boston Bioproducts	BM-220	Componente do tampão de acoplamento, usado para etapas de lavagem
Polissorbato 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Componente do tampão de ativação
Poliestireno Carboxil Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Grânulos de densidade superior (1,05 g/mL), usados para acoplamento de anticorpos
Anticorpo Policlonal RhD de Coelho	Invitrogen	PA5-112694	Usado para revestir grânulos para a detecção do fator Rh em glóbulos vermelhos
Microscópio de Grau de Pesquisa	Olympus	Provis AX-70	Microscópio usado para montar dispositivo de levitação magnética e visualizar células levitando
Pés de Amortecimento de Borracha	Thorlabs	RDF1	Usado para apoiar a mesa de placa de ensaio
Tubulação quadrada de Boro	VitroTubes	8100-050	Tubo capilar usado para carregar amostras em Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Usado na reação de acoplamento de anticorpos
Estágio Translacional	Thorlabs	PT1	Usado para focalização e para escaneamento de tubo capilar