Fremstilling af humant væv indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse til massespektrometrianalyse

Summary

Sphingolipider er bioaktive metabolitter med veletablerede roller i menneskelig sygdom. Karakterisering af ændringer i væv med massespektrometri kan afsløre roller i sygdomsætiologi eller identificere terapeutiske mål. OCT-forbindelsen, der anvendes til kryopræservering i biorepositorier, interfererer imidlertid med massespektrometri. Vi skitserer metoder til at analysere sphingolipider i humant væv indlejret i OCT med LC-ESI-MS / MS.

Abstract

Sphingolipider er cellulære komponenter, der har veletablerede roller i menneskelig metabolisme og sygdom. Massespektrometri kan bruges til at bestemme, om sphingolipider ændres i en sygdom og undersøge, om sphingolipider kan målrettes klinisk. Imidlertid kan korrekt drevne prospektive undersøgelser, der erhverver væv direkte fra den kirurgiske suite, være tidskrævende og teknisk, logistisk og administrativt udfordrende. I modsætning hertil kan retrospektive undersøgelser drage fordel af kryopræserverede humane prøver, der allerede er tilgængelige, normalt i stort antal, ved vævsbiorepositorier. Andre fordele ved at skaffe væv fra biorepositorier omfatter adgang til information forbundet med vævsprøverne, herunder histologi, patologi og i nogle tilfælde klinikopatologiske variabler, som alle kan bruges til at undersøge korrelationer med lipidomics-data. Imidlertid er tekniske begrænsninger relateret til inkompatibiliteten af optimal skæretemperaturforbindelse (OCT), der anvendes i kryopræservering og massespektrometri, en teknisk barriere til analyse af lipider. Vi har dog tidligere vist, at OCT let kan fjernes fra humane biorepositoriprøver gennem cyklusser med vask og centrifugering uden at ændre deres sphingolipidindhold. Vi har også tidligere fastslået, at sphingolipider i humant væv kryopræserveret i OCT er stabile i op til 16 år. I denne rapport skitserer vi trinene og arbejdsgangen til analyse af sphingolipider i humane vævsprøver, der er indlejret i OCT, herunder vaskevæv, vejning af væv til datanormalisering, ekstraktion af lipider, forberedelse af prøver til analyse ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS), massespektrometridataintegration, datanormalisering og dataanalyse.

Introduction

Sphingolipider er bioaktive metabolitter kendt for deres roller i human metabolisme og sygdom ^1,2. De regulerer komplekse cellulære processer såsom cellemigration, celleoverlevelse og død, cellebevægelse, vesikulær handel, cellulær invasion og metastase, angiogenese og produktion af cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i reguleringen af sphingolipidmetabolisme bidrager til initiering og progression af kræftformer, bestemmer, hvor aggressive kræftformer er, og hvordan kræft reagerer på og udvikler resistens over for terapi ^3,10. På grund af disse brede indvirkninger på sygdommens ætiologi er analysemetoder, der præcist kan etablere sygdomsspecifikke sphingolipidændringer, derfor vigtige værktøjer. Massespektrometri (MS) er den mest nøjagtige og pålidelige metode til at analysere sphingolipidændringer.

Humane prøver, der kan bruges til analyse af sphingolipidændringer, kan opnås prospektivt fra den kirurgiske suite eller retrospektivt fra vævsbiorepositorier. Friske væv fra kirurgi er fordelagtige, fordi de kan analyseres direkte ved MS eller andre analysemetoder. Imidlertid har erhvervelse af væv fremadrettet administrative, tekniske og logistiske forhindringer, og det kan være udfordrende at indsamle tilstrækkelige prøver til at nå statistisk magt. At få væv fra biorepositorier er fordelagtigt, fordi de kan erhverves retrospektivt i stort antal, og biorepositorier bekræfter histologi og patologi, bruger standardprocedurer til kryogent at bevare og opbevare væv og kan levere klinikopatologiske data, der kan bruges til korrelationsanalyser. For at bevare molekylære og strukturelle træk kan biorepositorier imidlertid kryopræservere væv ved at indlejre dem i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse, som vi har vist interfererer med datanormaliseringsassays og kvantificering af sphingolipider ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS)¹¹ . Det har også vist sig, at polyvinylalkohol og polyethylenglycol, de primære komponenter i OCT-forbindelse, resulterer i ionundertrykkelse i andre MS-analyseplatforme^12,13,14,15. Derfor skal OCT-forbindelsen fjernes fra væv inden sphingolipidomisk analyse af MS.

I en tidligere rapport har vi valideret en protokol til fjernelse af OCT-forbindelse fra humane prøver til LC-ESI-MS / MS-analyse 11 og den metode, der anvendes til vejning af væv til datanormalisering¹¹. Her beskriver vi trinene i den sphingolipidomiske OCT-forbindelsesfjernelsesprotokol (sOCTrP) og viser repræsentative data fra humane lungeadenocarcinomtumorer og normale tilstødende ikke-involverede væv.

Protocol

Afidentificerede humane lungevæv blev opnået fra Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core under en intern review board (IRB) godkendt protokol (#HM2471). Brugen af mus til forskning og høst af musevæv blev godkendt af VCU institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg (IACUC).

1. Forberedelse af materialer

BEMÆRK: Disse trin skal udføres en dag før vævsvask.

1. Foretiketter og vejer 1,5 ml polypropylencentrifugerør med kortfattede, men klare identifikationskoder for hver prøve, der behandles den næste dag. Brug en kemisk resistent permanent markør (se Materialefortegnelse), der ikke falmer under den gentagne rørhåndtering.
2. Åbn et elektronisk regneark, og mærk fortløbende kolonner med følgende kolonneoverskrifter: røridentifikator (ID), rør alene, rør med væv og total væv. Indtast de røridentifikatorer, der skal behandles, i kolonnen mærket rør-id.
3. Forkalibrer og nul en analytisk skala. Placer en ren 10 ml Erlenmeyer-kolbe i midten af balancepladen (kolben fungerer som rørholder). Luk døren til vejekammeret, og træk vægten med kolben.
4. Vej 1,5 ml centrifugerør. Anbring forsigtigt røret i kolben, og luk døren til vejekammeret. Lad vægten stabilisere sig, og registrer vægten i kolonnemærket rør alene.
   BEMÆRK: Undgå at flytte 10 ml Erlenmeyer-kolben ved vejning af rør. Hvis kolben flyttes, skal kolben centreres igen og balancen igen. Placer de lukkede rør i et stativ og opbevar, indtil det er nødvendigt.
5. Formærke 13 x 100 mm skrueglasrør og hætter med identifikationskoderne og fyld dem med 2 ml LC-MS methanol. Anbring dem i et rørstativ, dæk rørene, og opbevar dem i køleskab (4 °C) indtil brug.
   BEMÆRK: Brug en flasketopopløsningsmiddeldispenser (se Materialetabel). Hvis en sådan ikke er tilgængelig, skal du bruge glaspipetter for at undgå brug af plast, når du udleverer organiske opløsningsmidler.
6. Pre-label 13 x 100 mm glas reagensglas. Dæk og opbevar reagensglassene ved stuetemperatur.
7. Præ-label autoinjektorhætteglas med identifikatorkoder. Dæk og opbevar hætteglassene med autoinjektor ved stuetemperatur indtil brug.
8. Forbered vævstørringsvæger.
   1. Begynd med at rengøre kirurgisk saks ved at nedsænke dem i LC-MS methanol i 5 minutter, og tør dem derefter af med et rent laboratoriekvalitetsvæv.
   2. Brug pulverfrie handsker til at dreje enden af et væv af laboratoriekvalitet (se Materialetabel), indtil der dannes en fint tilspidset 30-40 mm væge.
   3. Brug methanolrenset saks til at skære vægen i den tykke ende. Læg væger i en ren carboard kasse. Lav dobbelt så mange væger, end det vil være nødvendigt for at behandle alle prøverne.
9. Forbered forkortede 1 ml pipettespidser. Brug en metanolrenset kirurgisk saks til at klippe 4-5 mm af spidsen af en 1 ml pipettespids, og læg spidsen tilbage i spidsholderen. Forbered dobbelt så mange tip som prøver, der skal behandles.
   BEMÆRK: Disse vil blive brugt til hentning af vasket væv fra rør. Rør ikke ved enden af spidsen.
10. Pre-chill molekylærbiologi grade phosphat buffered saltvand (PBS) til 4 ° C (0,5 L er tilstrækkeligt). Dette vil blive brugt til at hente prøver. For hver prøve, der skal behandles, forkøles (4 °C) 60 ml ultrarent deioniseret vand.
11. Forbered interne standarder for massespektrometri. Følgende lipider opløses i ethanol:methanol:vand (7:2:1; v/v/v) i en koncentration på 25 nmol/ml: d17:1-sphingosin, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol; d17:1-sphingosin-1-phosphat, heptadecasphing-4-enin-1-phosphat; C12-Ceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enin; C12-sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enin-1-phosphocholin; C12-glucosylceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine; C12-lactosylceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene.

2. Vask af væv

BEMÆRK: At gennemføre alle trin i afsnit 1 en dag før giver en dygtig forsker mulighed for at behandle op til 40 prøver om dagen og nybegyndere ~ 10-15 prøver om dagen. Begynd tidligt om morgenen, og stop ikke, før alle trin i afsnit 2.1-3.8 er afsluttet.

1. På den dag, hvor vævene skal behandles, skal du forberede biosikkerhedskabinettets arbejdsområde ved at udstyre det med en hvirvel, en fuldt opladet serologisk pipettor og en isbakke. For alle trin i dette afsnit skal du bære passende PPE, herunder en laboratoriefrakke, et dobbelt lag handsker og beskyttelsesbriller. FORSIGTIG: Humant væv og væsker bør overvejes og behandles som biofarlige materialer.
2. Pre-chill (4 °C) en svingende spandcentrifuge, eventuelle adaptere, der er nødvendige til at holde 15 ml koniske centrifugerør, og centrifuge biocontainment låg. Forkøling (4 °C) en fastvinklet centrifuge, der kan rumme 1,5 ml centrifugerør.
3. Hvis væv ikke aliquoted i 15 ml polypropylencentrifugerør, skal du bruge en methanolrenset spatel (ren for hver ny vævsprøve) til at overføre dem til præmærkede 15 ml polypropylenrør. Mærk også 15 ml hætter.
   1. Placer et rørstativ, der kan rumme 15 ml centrifugerør, i en isbakke, og fyld bakken med is. Optøningsvæv, der vil blive behandlet den dag ved at placere dem i stativet på is.
      BEMÆRK: Der skal anmodes om mindst 3-4 mg væv fra biodepotet til behandling, da det tidligere har vist sig, at vævsvask- og vejeprotokoller er nøjagtige og pålidelige ved disse vægte¹¹.
4. Flyt isbakken med prøverne ind i biosikkerhedsskabet.
5. Udfør tre sOCTrP-cyklusser¹¹ som beskrevet nedenfor (dvs. udfør trin 2.5.1-2.5.5 tre gange).
   1. Tilsæt 10 ml iskoldt ultrarent deioniseret vand til hvert rør og dæk dem tæt. Lad rørene inkubere i 10 min.
   2. Virtex kraftigt hvert rør i 10-20 s, eller indtil alt væv, der er deponeret på rørets vægge eller en vævspiller, er fuldstændig resuspenderet.
      BEMÆRK: I sOCTrP-cyklus 2-3 er det afgørende, at pelleten suspenderes igen, så enhver OCT i pelleten fortyndes i vaskeopløsningen.
   3. Rørene overføres til den forkølede (4 °C) svingende spandcentrifuge. Centrifugeprøver ved 4.000-5.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Undgå generering af og eksponering for biofarlige aerosoler, der genereres under centrifugering, ved at forsegle centrifugebærerne med et biocontainment-låg (se Materialetabel).
   4. Hent prøver fra centrifugen og overfør til isbakken. Anbring bakken i et biosikkerhedsskab, og løsn rørene. Gem hætterne.
   5. Opsæt forsigtigt vaskeopløsningen. Undgå at opsuge vævsmaterialet i pelleten ved at efterlade ~ 0,5 ml supernatant i røret. Dæk rørene og undgå krydskontaminering ved at matche mærkede hætter med rør.
      BEMÆRK: Vaskeopløsningen (supernatanten) i trin 2.5.5 er et biofarligt materiale; håndtere og bortskaffe det i overensstemmelse med biosikkerhedsretningslinjer, der er passende for enheder af menneskelig oprindelse.

3. Vævsvejning (til normalisering af data)

1. Efter den sidste sOCTrP-vaskecyklus skal du forsigtigt opsuge det meste af vaskeopløsningen, men undgå at forstyrre pelleten. Efterlad ~0,5 ml vaskeopløsning i røret.
2. Ved hjælp af de forkortede pipettespidser (forberedt i trin 1.9) optages 500 μL iskold PBS, og der tilsættes det til røret.
   1. Brug den samme spids til forsigtigt at suspendere pelleten og hente alt væv. Undgå turbulent pipettering for at mindske vævstab ved dets vedhæftning til rør- og pipettespidsvæggene.
3. Tilsæt det resuspenderede væv til dets tilsvarende præmærkede og forvejede 1,5 ml centrifugerør, og læg røret på is. Gentag for alle væv i datasættet.
4. Rørene på 1,5 ml anbringes i en forkølet centrifuge, og vævene pelleteres ved 7.000 x g i 5-7 minutter og 4 °C.
   1. Hent rør, og opsug forsigtigt så meget af PBS som muligt uden at forstyrre pelleten. Placer røret tilbage på is.
5. Centrifugerør i yderligere 3 minutter ved 7.000 x g for at sikre, at vævet er godt pelleteret. Overfør rørene til is.
   BEMÆRK: Det ekstra centrifugeringstrin er vigtigt for at forhindre vævstab, når du fjerner al vaskeopløsning og transportering. Hvis der behandles mere end fem prøver, gentages centrifugeringstrinnet på 3 min, 7.000 x g , efter at hver femte prøve er behandlet for at sikre, at vævet forbliver pelleteret.
6. Brug vægerne, der er fremstillet i trin 1.8, til forsigtigt at fjerne eventuel resterende vaskeopløsning. Brug en ren væge til hver prøve. Det er acceptabelt at duppe vævet forsigtigt med vægen, hvilket vil hjælpe med at fjerne det meste af vaskeopløsningen, men undgå at miste væv ved at klæbe til vægen. Luk røret og læg det på is.
7. Vej hvert rør i den nyligt kalibrerede, tjærede og nulstillede analytiske vægt.
   1. Anbring hvert rør i glaskolben og luk kammerdøren. Når vægten er stabiliseret, skal du registrere den i den elektroniske regnearkskolonne mærket rør med væv.
   2. Efter vejning skal du placere røret tilbage på is.
8. Der tilsættes 300 μL iskold PBS. Ved hjælp af en forkortet pipettespids (trin 1.9) skal du forsigtigt hente alt væv og deponere i et præmærket skrueglasrør (fremstillet i trin 1.5), der indeholder 2 ml iskold LC-MS-methanol (tilsæt vævet til methanolen, ikke til siden af røret).
9. Beregn mængden af væv, der blev vasket ved at trække røret alene fra røret med vævsværdi. Optag dette nummer i den samlede vævskolonne. Den samlede vævsværdi vil blive brugt til at normalisere massespektrometridata i trin 6.12.
10. Prøverne opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til at udføre trin 4.1-4.15.
    BEMÆRK: Dette er et godt stoppunkt, og prøverne kan opbevares sikkert i et par uger ved -80 °C. For andre vævsnormaliseringsmetoder, såsom proteinkoncentration eller lipidphosphatindhold, henvises til Rohrbach et ^al.11.

4. Lipidekstraktion

BEMÆRK: Det er vigtigt at begynde disse trin om morgenen, især når mange prøver vil blive behandlet. Før du starter, forvarm et vandbad eller inkubator til 48 ° C.

1. Prøverne fremstillet i trin 3.8 og MS-lipidstandarderne (fremstillet i trin 1.11) hentes fra fryseren. Lad dem balancere til stuetemperatur i 20 min.
2. Vortex og nedsænk den interne standardopløsning i et ultralydsvandbad (se Materialetabel) i 2-3 minutter, eller indtil MS-lipidstandarderne er helt opløst inden dispensering i prøver. Dette vil undgå fejl i data normalisering.
3. Ved hjælp af en gentagende pipette tilsættes 250 pmol (10 μL fra 25 nmol/ml opløsningen fremstillet i trin 1.11) af interne massespektrometristandarder til hvert rør. Dæk rørene let igen.
4. For at lette homogeniseringen skal du justere methanolvolumenet til 2 ml. Brug kun methanol af LC-MS/MS-kvalitet.
5. Arbejd et rør ad gangen, brug en homogenisator til at triturere vævet, indtil der ikke er synlige klumper (typisk 5-20 s). Flyt homogenisatorspidsen i en cirkulær bevægelse, og tryk forsigtigt mod rørvæggen for at hjælpe trituration. Dæk røret igen.
   BEMÆRK: At sikre, at alle væv er fint tritureret, maksimerer lipidekstraktion. Tilsæt ikke chloroform til prøver før homogenisering, da engangshomogenisatorspidserne er lavet af plast, der opløses i opløsninger indeholdende chloroform.
6. Nedsænk røret i en 45 ° vinkel i et ultralydsvandbad i 5-10 s.
   1. Hvis der ikke dannes vævsklumper ved nedsænkning i ultralydsbadet, skal du dække det og gå videre til det næste rør.
   2. Hvis vævsklumper dannes, når røret er nedsænket i ultralydsbadet, homogeniseres igen og målretter klumperne.
   3. Gentag denne proces (homogenisering / nedsænkning i et ultralydsbad) iterativt, indtil alle store vævsklumper er brudt op.
7. I en røghætte tilsættes LC-MS-kvalitet chloroform og methanol til hvert rør (brug en flasketopdispenser) for at opnå et forhold på 2: 1: 0.1 methanol: chloroform: vand. Brug rene hætter til at forsegle rørene tæt og lade dem stå på bordpladen indtil slutningen af dagen.
   1. For væv, der vejer 50 mg eller derunder, anvendes et samlet ekstraktionsvolumen på 4 ml, og justeres ved hjælp af dette forhold (50 mg: 4 ml ekstraktionsopløsning) til større prøver.
8. Før du forlader den aften, skal du placere de tætlukkede rør i et 48 ° C vandbad eller inkubator og inkubere dem natten over.
   BEMÆRK: Det er afgørende, at rørene er tæt lukket, så opløsningsmiddelforholdene ikke ændres på grund af fordampning.
9. Næste morgen hentes prøverne fra 48 °C vandbadet, og eventuelt opløsningsmiddeluopløseligt affald pelleteres ved centrifugering ved 4.000-5.000 x g ved 4 °C i 20 min.
10. Ved at arbejde i en røghætte dekanteres supernatanten forsigtigt i de præmærkede 13 x 100 mm borosilikatglasreagensglasrør. Vip 13 x 100 mm røret i en vinkel på 30-45° for at lette dekantering.
    BEMÆRK: Hvis du behandler mere end 12 prøver, må de centrifugerede rør ikke sidde i længere tid, da pellets blødgør, og uopløseligt snavs overføres ved udførelse af trin 4.10. For at undgå dette skal du kun tage 12 rør ud af centrifugen ad gangen og fortsætte med at centrifugere de andre rør, indtil du er klar til at dekantere dem.
11. Overfør rørene til en vakuumkoncentrator, der kan rumme 13 x 100 mm rør. Alt opløsningsmiddel inddampes med et indledende opvarmningstrin på 1 time (40 °C), og der køres under maksimalt vakuum.
12. Fjern rør fra vakuumkoncentratoren, og tilsæt 500 μL LC-MS-methanol (brug en flasketopdispenser) til hvert rør.
13. Resuspender de tørrede lipidekstrakter ved hvirveldannelse i 5-10 s, efterfulgt af nedsænkningsrør i en 45 ° vinkel i et ultralydsvandbad i 2 minutter, mens røret drejes. Re-vortex i 5 s og nedsænk i ultralyd vandbad i yderligere et minut.
    BEMÆRK: Dette er et kritisk skridt for at sikre maksimal genopretning af ekstraherede lipider. Gå ikke videre, før alt det tørrede materiale på rørets væg er blevet resuspenderet.
14. 13 x 100 mm rørene anbringes i en forkølet centrifuge (4 °C), og eventuelt uopløseligt affald fjernes ved centrifugering ved 4.000-5.000 x g ved 4 °C i 20-30 min.
15. Dekantér forsigtigt den klargjorte supernatant til et formærket autoinjektorhætteglas. Vipning af autoinjektorhætteglasset i en vinkel på 30-45° letter dekantering. Sørg for, at hele indholdet af 13 x 100 mm røret dekanteres i hætteglasset med autolæsseren.
16. Rør lukkes tæt, og rørene opbevares ved -80 °C, indtil de analyseres af LC-ESI-MS/MS.

5. LC-ESI-MS/MS-analyse

BEMÆRK: Følgende procedure bruger et binært pumpesystem koblet til en autoinjektor, degasser og LC-MS / MS-system, der fungerer i en triple-quadrupole-tilstand. Søjletemperaturen blev opretholdt ved hjælp af en søjleovn. Se materialeoversigten for detaljer om det anvendte udstyr.

1. Der fremstilles mobil fase A1 (_CH3OH:H₂O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, med 5 mM ammoniumformiat) og mobil fase B1 (_CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, med 5 mM ammoniumformat). Brug kun opløsningsmidler af LC-MS-kvalitet, vand og reagenser.
2. For hvert sæt prøver skal du forberede fire tomme autoloaderhætteglas, der indeholder 500 μL methanol af LC-MS-kvalitet.
3. For hvert sæt prøver fremstilles to hætteglas med intern standard (etiket som IS) ved at fortynde 10 μL (250 pmol i alt hver standard) af den interne standardopløsning fremstillet i trin 1.11 i 500 μL methanol af LC-MS-kvalitet.
4. Søjleovnens temperatur indstilles til 60 °C og ionkildetemperaturen til 500 °C.
5. Til MS / MS-analysen skal du bruge spektrometerets triple-quadrupole-tilstand. Indstil den første quadrupole (Q1) til at passere forløberioner, mens den tredje quadrupole (Q3) indstilles til at passere molekylært karakteristiske produktioner (eller en scanning på tværs af flere m / z i Q1 eller Q3) ved hjælp af N2 til kollisionsmæssigt inducere dissociationer i quadrupole 2 (Q2), som forskydes fra Q1 med 30-120 eV.
6. Indstil multireaktionsovervågningspar (MRM) detektionsvindue til 120 s med en målscanningstid på 1,0 s. Se tabel 1 for en liste over MRM-par, ioniseringsenergier og kollisionsenergier.
7. Brug følgende parametre til at løse sphingolipider i LC-trinnet: Ved hjælp af en strømningshastighed på 0,7 ml/min ækvilibreres en 2,1 (i.d) x 50 mm C18 omvendt fasekolonne i 0,5 minutter med en opløsningsmiddelblanding af 95% mobil fase A1 og 5% mobil fase B1.
   1. Efter prøveinjektion opretholdes den mobile fase A1/B1-ratio ved 95/5 i 2,25 min. efterfulgt af en lineær gradient til 100% B1 over 1,5 min, som derefter holdes ved 100% B1 i 5,5 min, efterfulgt af en 0,5 minutters gradientretur til 95/5 A1/B1.
   2. Efter kørslen skal søjlen re-ligevægtes med en blanding af 95/5 A1/B1 i 0,5 min.
8. Brug følgende indstillinger for autoloaderen til prøven: skyllevolumen, 500 μL; nåleslag, 52 mm (dette skal justeres afhængigt af hætteglassets størrelse og volumen i hvert hætteglas); skyllehastighed, 35 μL/s; prøveudtagningshastighed, 5,0 μL/s; skyl dyppetid, 2 s; skylletilstand, før og efter aspiration; skylletid,2 s.
9. Prøver, der er fremstillet i trin 4.15, anbringes på en autoloaderbakke i følgende rækkefølge: Blank; ER; Hvid; Prøver fremstillet i trin 4.15; Tom, ER, Tom.
10. Analyser 5-10 μL af hver prøve ved hjælp af LC-ESI-MS/MS. Analyser det samme volumen for alle prøver i datasættet.

6. Databehandling, integration og normalisering

BEMÆRK: Selvom følgende trin skitserer en procedure for specifik software (se Materialetabel), kan lignende procedurer på ækvivalente LC-MS-instrumenter og software bruges til at integrere MRM-par til de analyserede lipidklasser og tilsvarende interne standarder.

1. Åbn kvantificeringssoftwaren. På fanen Quantitate skal du dobbeltklikke på guiden Quantitation. I pop op-vinduet i arbejdsområdet længst til venstre skal du navigere til det korrekte datasæt og venstreklikke på det. De tilgængelige eksempler vises i det midterste arbejdsområde.
2. Fremhæv de prøver, der skal analyseres, og klik derefter på højre pil for at føje prøver til arbejdsområdet Valgte prøver . Klik på Næste for at navigere til indstillings- og forespørgselsskærmen, hvor standardindstillingerne typisk bruges.
3. Tryk på Næste for at navigere til skærmbilledet til valg af integrationsmetode. Vælg en passende integrationsmetode, der indeholder MRM-overgangspar til lipider, der skal analyseres. Se tabel 1 for MRM-overgangspar. Tryk på Afslut.
   BEMÆRK: Opbevaringstider varierer afhængigt af instrumentering og individuelle indstillinger og skal derfor verificeres for hver enkelt opsætning.
4. I navigationslinjen skal du klikke på ruden Peak Review , så MRM-par kan inspiceres. For at lette gennemgangen skal du højreklikke på ruden Peak Review , ændre automatisk zoom til 100% af største top og et zoomvindue på 1,00 - 2,00 minutter.
5. Højreklik på vinduet Quantitation Display , og vælg Analyte og det ønskede sphingolipid, der skal undersøges. Kontrollér, at der ikke er toppe i de tomme prøver, og at den korrekte top er integreret i IS-prøverne.
6. Begynd at integrere ukendte prøver. Arbejder en sphingolipid klasse ad gangen, inspicere retentionstiden for MRM-parret i den interne standard (dvs. C12: 0 ceramid) og sikre, at softwaren har integreret den korrekte top.
7. Fortsæt på analysanderne i samme lipidklasse (dvs. C14:0 ceramid, C16:0-ceramid osv.), begyndende med det korteste kædelængdelipid i klassen. Kontroller for hvert kædelængdelipid, at softwarerutinen har integreret den korrekte MRM-partop.
8. Når alle analytter er integreret, skal du oprette et elektronisk regneark for hver analyseret sphingolipidart (f.eks. Ceramider, sphingomyeliner osv.). Mærk kolonneoverskrifter, så de svarer til rækkefølgen af analysanderne og kædelængderne i LC-MS/MS-kvantitetssoftwaren. Medtag også en kolonneoverskrift til prøve-id og prøvenormaliseringsvægte bestemt i trin 3.9.
   BEMÆRK: Som tidligere beskrevet¹¹ inkluderer andre almindelige normaliseringsforanstaltninger det samlede lipidphosphatindhold eller proteinmængde.
9. Eksporter eller kopier spidsområderne for alle analytter og interne standarder til det elektroniske regneark.
10. Normaliser data ved at dividere det integrerede topområde for hver kædelængdeart for en given sphingolipidklasse med topområdet for dets tilsvarende interne standard. For eksempel C14:0 ceramid, C16:0 ceramid, C18:1 ceramid osv. skal hver divideres med C12:0 ceramid internt standard peak område.
11. Konverter topareal til mol af lipid genvundet ved at multiplicere det normaliserede topareal (beregnet i trin 6.10) med mængden af intern standard i picomoler, der blev tilføjet til prøven i trin 4.3. I denne protokol er dette beløb 250 pmol.
12. For at opnå den relative mængde lipid i hver prøve divideres picomolerne af hver lipidkædelængde med vævsvægten bestemt i trin 3.9. Dette vil give enheder af picomoler af lipid pr. Mg væv.

Representative Results

I denne protokol beskriver vi detaljeret en metode til at fjerne OCT fra kryokonserverede humane væv og veje vævene til analyse af LC-ESI-MS / MS. De materialer, der kræves til denne procedure, er angivet i Materialefortegnelse. Vist i figur 1 er resultaterne af et typisk eksperiment, hvor 10 humane lungeadenocarcinomtumorer og 10 normale tilstødende væv blev vasket for at fjerne OCT og analyseret af LC-ESI-MS / MS. Det er vigtigt, som vi tidligere har vist¹¹, at der er forskellige kædelængdearter af ceramider (figur 1A) og monohexosyl-ceramider (figur 1B), der er signifikant forhøjet i lungeadenocarcinomtumorer sammenlignet med normale tilstødende ikke-involverede væv.

I kontrolforsøg til vurdering af virkningen af OCT på lipidekstraktionstrinnene beskrevet i afsnit 4 blev 200 mg muselever (C57BL6; hanner; 14-16 uger gamle) resuspenderet i 2 ml fosfatbufferet saltvand og homogeniseret, indtil det blev fint tritureret. Den resulterende fine leversuspension blev derefter grundigt sonikeret med en sondesonikator (tre runder af 1 min sonikering på is, 1 min hvile på is, 60% effekt; mikrotip). Fra denne opløsning blev der fremstillet seks 300 μL leverhomogenatreplikater. Til tre replikater blev der tilsat 200 mg OCT (gennemsnitlig mængde fundet i biorepositoriprøver¹¹), og 200 μL vand blev tilsat til de tre andre. Prøverne blev derefter behandlet parallelt efter de trin, der er beskrevet i afsnit 4. Det er vigtigt at bemærke, at efter centrifugering af enfaset Bligh-Dryer-opløsning var prøver, der indeholdt OCT, uklare, mens kontrolprøverne indeholdende vand var klare (figur 2A). Uklarheden i enfaset lipidekstraktionsopløsning fortsatte selv efter øget centrifugering og omfattende sonikering (ikke vist). Efter at opløsningsmidlet var fordampet, havde prøver indeholdende OCT store pellets (figur 2B), som ikke kunne rekonstitueres i methanol selv under kraftig hvirveldannelse og omfattende sonikering. Prøver indeholdende OCT viste også et stort tab af signal for interne standarder for alle analyserede arter (figur 3A-G). Vi har også tidligere vist, at prøver indeholdende OCT viste tab af signal for mange af de analyserede sphingolipider¹¹.

Typisk forventes det, at sphingolipidstandarderne vil eluere sekventielt som vist i figur 4 i følgende rækkefølge: d17:1 sphingosin, d17:1 sphingosin-1-phosphat, C12:0 lactosyl-ceramid, C12:0 monohexosyl-ceramid, C12:0 sphingomyelin og C12:0 ceramid. For hver af disse sphingolipidarter vil der ved hjælp af gradient- og instrumenteringsindstillingerne beskrevet i afsnit 5 og^{tidligere 11} være ca. et +0,15 minutters skift i retentionstiden for hver 2-kulstofforøgelse i kædelængde. Som vist i figur 5 vil C14:0-ceramid (figur 5B) f.eks. eluere ca. +0,15 minutter senere end C12:0-ceramid (figur 5A). En dobbeltbinding i fedtsyren resulterer ofte i et -0,15 skift i retentionstid, så C16:0-ceramid (figur 5C) vil have en retentionstid svarende til C18:1-ceramid (figur 5D). Imidlertid kan lipider med længere kædelængde (dvs. C24: 0, C26: 0) have større retentionstidsskift (henholdsvis figur 5I, K).

Figur 1: Sphingolipidprofiler af lungeadenocarcinomer og tilstødende ikke-involverede lungevæv. Væv blev kryogent opbevaret i OCT, optøet, behandlet med tre sOCTrP-cyklusser, vejet og analyseret af LC-ESI-MS / MS. Niveauer er i pmol pr. Mg væv. De angivne acylkædelange arter af ceramid (A), monohexosylceramid (B), sphingomyelin (C), lactosylceramid (D) og sphingosin (E; Sph), sphingosin-1-phopshate (F; S1P), dihydro-Sph (E) og dihydro-S1P (F) blev kvantificeret. n = 10 tumorer og n = 10 tilstødende ikke-involverede væv. Box plots viser medianer (sort linje) og whiskers af min til max. , s≤0,005; , s. ≤ 0,0005. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Repræsentative billeder af udtrukne prøver med og uden OCT. Muselever blev homogeniseret og sonikeret, opdelt i seks identiske prøver: 200 mg OCT blev tilsat til tre prøver og vand til de andre tre. (A) Efter at methanol og chloroform blev tilsat for at opnå et forhold på 2:1:0,1 methanol:chloroform:vand (v:v:v), inkubation natten over ved 48 °C efterfulgt af centrifugering, var supernatanterne af prøver, der indeholdt OCT, uklare og kunne ikke afklares ved sonikering, hvirveldannelse eller centrifugering. (B) Efter fordampning af opløsningsmiddel blev en stor pellet genvundet fra prøver indeholdende OCT, der ikke kunne rekonstitueres fuldt ud i 0,5 ml methanol efter omfattende sonikering og hvirveldannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: LC-ESI-MS/MS kvantificering af sphingolipidstandarder i nærvær eller fravær af OLT. Muselever blev homogeniseret, sonikeret og opdelt i seks identiske prøver. Til tre ud af de seks prøver blev der tilsat 200 mg OCT, mens der til de tre andre blev tilsat vand. Efter tilføjelse af interne standarder, methanol og chloroform blev prøver behandlet identisk, og ekstraherede lipider blev analyseret af LC-ESI-MS / MS. Vist er multiple reaction monitoring (MRM) par af de angivne lipider (A-F) og tilsvarende integrerede topområder (G). Forkortelser: Sph, sphingosin; S1P, sphingosin-1-phosphat. Sorte pile peger på det korrekte MRM-par for det angivne sphingolipid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Relative retentionstider for LC-ESI-MS/MS flere reaktionsovervågningspar af sphingolipidstandarder. Muselever blev homogeniseret og sonikeret; interne standarder, methanol og chloroform tilsat; og lipider ekstraheret og analyseret af LC-ESI-MS / MS. Vist er retentionstider for flere reaktionsovervågningspar af de angivne lipider (A-F). Bemærk den relative rækkefølge, hvori lipider elueres under væskekromatografigradienten. Forkortelser: Sph, sphingosin; S1P, sphingosin-1-phosphat; SM, sphingomyelin. X-aksen er MRM-parretentionstid i minutter. Y-aksen er signalintensitet for MRM-parrene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Acyl-kædelængdeafhængigt skift i retentionstid for LC-ESI-MS/MS MRM-par. Muselever blev homogeniseret og sonikeret; interne standarder, methanol og chloroform tilsat; og lipider ekstraheret og analyseret af LC-ESI-MS / MS. Vist er retentionstider og MRM-par af de angivne lipider. Bemærk skiftet i retentionstid med stigende acylkædelængde for forskellige lipider (A-K), hvilket typisk svarer til en +0,15 minutters retentionstid pr. 2-kulstofforøgelse. En dobbeltbinding vil resultere i et -0,15 minutters retentionstidsskift (D,H,J). For lipider med længere kæde kan den relative stigning i retentionstid imidlertid være længere (G-K). X-aksen er MRM-parretentionstid i minutter. Y-aksen er signalintensitet for MRM-parrene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: MRM-par, ioniseringsparametre og kollisionsenergier til LC-ESI-MS/MS-analyse. DP, de-clustering potentiale; CE, kollisionsenergi. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

OCT er et almindeligt langsigtet kryokonserveringsmiddel, der anvendes i biorepositorier. OCT kan dog resultere i ionundertrykkelse, når væv analyseres af forskellige massespektrometriplatforme^12,13,14,15, eller resultere i tab af signal, når prøver analyseres af LC-ESI-MS / MS ¹¹. OCT i kryopræserveret væv kan også forstyrre vævsnormaliseringsmetoder såsom vejning og proteinkvantificeringsassays som Bradford og BCA¹¹. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til fjernelse af OCT fra humant væv og analyseres efterfølgende ved massespektrometri. Protokollen kan ændres til at bruge andre vævskilder, der ikke er lunge, eller fra musevæv, som vi tidligere har beskrevet¹¹. Derudover kan andre massespektrometridatanormaliseringsstrategier anvendes, herunder dem, vi tidligere har beskrevet¹¹, samt andre validerede metoder.

En vigtig begrænsning af denne protokol er, at den ikke er tilstrækkelig til analyse af væv, der tidligere er blevet fastgjort med formaldehyd eller et andet fikseringsmiddel. Det er kun tilstrækkeligt for væv, der ikke er blevet fastgjort og er blevet kryopræserveret i OCT. Derudover er denne metode ikke tilstrækkelig til behandling af væv, der vejer mindre end 1-2 mg, da der altid er noget vævstab under sOCTrP-trinene og overførsler mellem rør. Det vil være vanskeligt at veje så små væv ved hjælp af en standard analytisk vægt, og eventuelle resterende PBS, der ikke fjernes under transportfasen, vil bidrage meget til den eksperimentelle fejl. Nedenfor er andre vigtige overvejelser, når du vasker væv for at fjerne OCT med denne metode.

For at sikre en problemfri udførelse af denne protokol, især hvis mange prøver vil blive behandlet, skal trin, der er beskrevet i afsnit 1, udføres på forhånd, herunder formærkning og forvejning af 1,5 ml rør, formærkning af 13 x 100 mm skruehætterør og hætter, 13 x 100 mm kulturrør og autoinjektorhætter, forberedelse af alle væger, forforkortelse af 1 ml pipettespidser, og forkøling af vaskeløsninger. Dette vil forhindre, at tidskrævende procedurer skal udføres den dag, hvor væv vaskes, hvilket kan føre til forsinkelser. Generelt finder vi, at hvis mange af disse trin udføres dagen før, kan en erfaren forsker vaske 30-40 prøver på en normal arbejdsdag. Men fordi det første foreslåede stoppunkt er, efter at alt væv er blevet vasket, vejet og anbragt i methanol og opbevaret ved -80 ° C, vil ikke at udføre 1,5 ml forvejning og mærkning på forhånd påvirke effektiviteten og forlænge den tid, der kræves for at vaske 30-40 væv.

Vævsvejning er et af de vigtigste skridt, da fejl eller skødesløshed vil påvirke datakvaliteten, da de overføres til datanormalisering. Det er afgørende, at den analysevægt, der anvendes til vejning, kalibreres, nulstilles korrekt og tariseres. Når du bruger væger, er det derfor vigtigt at fjerne så meget af vaskeopløsningen som muligt, især for væv, der vejer mindre end 5 mg. Ved disse vævsvægte vil overskydende vaskeopløsning gøre vejning unøjagtig med en stor procentdel og overføres som en fejl i datanormalisering. Når vi fjerner vaskeopløsning, finder vi ud af, at væv forsigtigt kan røres med vægen i flere sekunder for at fjerne så meget vaskeopløsning som muligt uden at føre til betydelige tab af væv ved vedhæftning til vægen. Hver vævstype, der vaskes, skal dog testes for vedhæftning til væger, og disse trin i protokollen justeres i overensstemmelse hermed.

For at lette arbejdsgangen for vævsvask anbefales det, at der anmodes om vævspåner fra biodepotet i 15 ml polypropylenrør. Dette vil reducere håndteringen af væv inden vask.

Ved vask af væv, hvis der observeres et gellignende materiale i bunden af et rør efter den tredje sOCTrP-cyklus, er dette tegn på, at ikke alt OCT er fjernet, og at der er behov for flere sOCTrP-cyklusser. Hold styr på, hvor mange cyklusser der er behov for, og for konsistens skal du udføre det samme antal sOCTrP-cyklusser i alle prøver i datasættet. Vi har tidligere evalueret op til 9 sOCTrP-cyklusser og fandt ingen effekt på udtømning af sphingolipider i væv¹¹.

Når du bruger væger til at fjerne vaskeopløsningen, vil forsigtig dubling af vævet sikre, at al vaskeopløsning fjernes. Dette øger nøjagtigheden af vævsvægtestimering. Der skal dog udvises stor forsigtighed med meget små væv, da disse kan klæbe til vægen og resultere i tab af prøve. Det er nyttigt at bruge flere væger til det samme rør for at fjerne så meget opløsning som muligt. For at forhindre krydsprøvekontaminering skal du altid bruge en ny og ren væge til hver prøve. Når du fremstiller væger, skal du bruge væv af laboratoriekvalitet (se Materialetabel), da vi tidligere testede disse og viste os at indeholde en ubetydelig mængde forurenende sphingolipider¹¹. Væger fra andre materialer kan anvendes, hvis de testes som beskrevet¹¹.

Ved hentning af prøver fra 1,5 ml rør efter vejning er det afgørende, at alt væv genvindes. Hvis du ikke gør det, vil det resultere i fejl i datanormalisering. Hvis der er behov for mere PBS for at genvinde alt vævet, tilsættes den tilsvarende mængde PBS, der anvendes, til alle andre rør for at undgå forskelle i ekstraktionseffektivitet, der kan opstå som følge af prøver, der indeholder forskellige mængder PBS. Juster chloroform- og methanolvolumener for at tage højde for enhver stigning i vandvolumen for at opretholde et forhold på 2: 1: 0.1 methanol: chloroform: vand.

Ved optøning af prøver er det vigtigt, at dette trin udføres på is for at undgå nedbrydning af labile lipider såsom sphingosin-1-phosphat. Fuldstændig optøning af prøver, indtil OCT er i flydende tilstand, vil også lette fjernelsen, da det lettere vil blive opløst i koldvaskeopløsningen i stedet for at forblive som en pellet under tidlige vasketrin.

Lejlighedsvis, især når man vasker lungevæv, vil der være fragmenter, der ikke pelleterer og vil flyde oven på vaskeopløsningen efter centrifugering. Med omhu kan nedsænkning af den aspirerende spids under det flydende væv for at fjerne vaskeopløsningen forhindre tab under aspiration.

Tilsæt ikke chloroform til prøver før homogenisering, da engangshomogenisatorspidserne er lavet af plast og opløses i opløsninger indeholdende chloroform. Dette kan påvirke LC-MS / MS-kvantificeringen af lipider i prøverne betydeligt. Derfor bør brugen af plast, der ikke er resistent over for opløsningsmidler, generelt undgås, når chloroform og methanol udleveres. Disse opløsningsmidler er også giftige og skal håndteres i en passende røghætte. Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af opløsningsmidler såsom methanol og chloroform.

Humant væv skal behandles i et passende biosikkerhedsskab (f.eks. klasse II). Brugerne bør uddannes i håndtering af biofarlige materialer og væsker af menneskelig oprindelse og følge sikkerhedsprotokoller såsom brug af passende personlige værnemidler og dekontaminering af enhver overflade eller udstyr, der kommer i kontakt med prøver. Brugere bør grundigt desinficere (se materialetabellen for foreslået dekontaminant) enhver overflade eller udstyr (centrifuger, centrifugebærere og adaptere, pipettere, hvirvler, røghætteoverflader, vægte, glasvarer, isbakker, computertastaturer, computermus osv.), Der anvendes under vaskeproceduren. Laboratoriemedlemmer bør ikke bruge udstyr eller hætter, der bruges til vævsvask, før de er blevet grundigt desinficeret. Undgå brug af blegemiddel på ståloverflader og elektronik.

Når du behandler mange prøver, skal du være forsigtig for at forhindre krydskontaminering ved hjælp af rene hætter i re-capping trin under lipidekstraktionstrinnene. Hætter kan også genbruges, hvis de er mærket. I praksis finder vi imidlertid, at markører skiller sig dårligt ud på de sorte hætter, og klæbende etiketter falder af rør under natten 48 ° C inkubation.

Sphingolipider er demonstreret vigtige aktører i ætiologien af sygdom og humane kræftformer. Derfor er der stor interesse for præcist at definere sphingolipidmetabolismeændringerne i disse sygdomme, da de kan afsløre terapeutiske mål. Imidlertid er mange af de væv, der er let tilgængelige for forskere, kryopræserveret i OCT, hvilket ikke er kompatibelt med massespektrometrianalyse. Således vil den detaljerede protokol, der er beskrevet her, udvide repertoiret af væv, der er tilstrækkeligt til kvantitativ sphingolipidomisk analyse, og dermed bidrage til at øge vores forståelse af biologien af lipidmetabolismeændringer i menneskelig sygdom og kræft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	581300-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400