Obtenção de macrófagos de monócitos humanos para avaliar a taxa de infecção por Leishmania braziliensis e a resposta imune inata do hospedeiro

Resumo

Este protocolo descreve o processo de obtenção de macrófagos humanos a partir de monócitos para infecção por Leishmania braziliensis. Também permite que os pesquisadores avaliem a taxa de infecção e a viabilidade do parasita, a produção de ROS por microscopia de fluorescência e a produção de mediadores inflamatórios em sobrenadantes de cultura para investigar a resposta dos macrófagos à infecção.

Resumo

Os macrófagos são células multifuncionais essenciais para o funcionamento do sistema imunológico e a principal célula hospedeira na infecção por Leishmania braziliensis (Lb). Essas células são especializadas no reconhecimento e fagocitose de microrganismos, mas também ativam outras células imunes e apresentam antígenos, além de promover inflamação e reparo tecidual. Aqui, descrevemos um protocolo para obter células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis para separar monócitos que então se diferenciam em macrófagos. Essas células podem então ser infectadas in vitro em diferentes concentrações de Lb para avaliar a capacidade de controlar a infecção, bem como avaliar a resposta imune da célula hospedeira, que pode ser medida por vários métodos. As PBMCs foram primeiro isoladas por centrifugação com gradiente Ficoll-Hypaque e depois semeadas para permitir que os monócitos aderissem às placas de cultura; As células não aderentes foram removidas por lavagem. Em seguida, as células aderentes foram cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) por 7 dias para induzir a diferenciação de macrófagos. Sugerimos o plaqueamento de 2 x 10⁶ células por poço em placas de 24 poços para obter 2 x 10⁵ macrófagos. Macrófagos totalmente diferenciados podem então ser infectados com Lb por 4 ou 24 horas. Esse protocolo resulta em uma porcentagem significativa de células infectadas, que podem ser avaliadas por microscopia óptica ou de fluorescência. Além do índice de infecção, a carga parasitária pode ser medida contando o número de parasitas dentro de cada célula. Outros ensaios moleculares e funcionais também podem ser realizados em sobrenadantes de cultura ou dentro dos próprios macrófagos, o que permite que este protocolo seja aplicado em uma variedade de contextos e também adaptado a outras espécies de parasitas intracelulares.

Introdução

O protozoário parasita intracelular do gênero Leishmania é o agente causador de um complexo de doenças negligenciadas conhecido como leishmaniose¹. Essas doenças tropicais apresentam uma ampla gama de manifestações clínicas que podem variar desde lesões cutâneas até complicações decorrentes da forma visceral da doença, que podem ser fatais se não tratadas. A leishmaniose cutânea (LC) é a forma mais frequente de leishmaniose e é caracterizada por uma ou poucas lesões cutâneas ulceradas com inflamação crônica exacerbada². O desenvolvimento da doença é dependente da espécie Leishmania, além de uma combinação de fatores associados à resposta imune do hospedeiro, que definem os desfechos clínicos ^3,4. Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora de LC no Brasil, com casos relatados em todos os estados do país⁵. A resposta imune contra L. braziliensis é considerada protetora, pois restringe o parasito ao local de inoculação, e envolve vários tipos de células imunes, como macrófagos, neutrófilos e linfócitos ^4,6,7.

Os macrófagos são células multifuncionais essenciais para o sistema imunológico, uma vez que são especializados na detecção e fagocitose de microrganismos, podendo apresentar antígenos e ativar outros tipos celulares. Os macrófagos são capazes de regular processos desde a inflamação até o reparo tecidual e a manutenção da homeostase ^8,9. Essas células desempenham um papel essencial na resposta imune precoce contra parasitas intracelulares, como Leishmania, sendo importantes para sua eliminação 10,11,12.

Durante a infecção por L. braziliensis, os macrófagos podem responder por meio de diferentes mecanismos para eliminar o parasita, como a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e mediadores inflamatórios^13,14. As respostas imunes podem ser guiadas pela produção de citocinas pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias, que contribuem para um estado inflamatório exacerbado ou processos de reparo tecidual ^6,15,16. A plasticidade dos macrófagos é fundamental para a imunopatogênese da LC, bem como para a interação parasito-hospedeiro, e essas células são consideradas cruciais para a elucidação dos mecanismos da doença e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Como a LC é uma doença complexa, as investigações exigem que os pesquisadores explorem tipos de células que imitam as encontradas em humanos. As respostas imunes observadas em diferentes modelos experimentais podem variar e produzir resultados que não refletem a resposta imune observada em humanos naturalmente infectados. Assim, o protocolo aqui apresentado foi desenhado para possibilitar o estudo de macrófagos humanos e suas respostas imunes durante a LC causada por L. braziliensis.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Instituto Gonçalo Moniz (Fundação Oswaldo Cruz-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brasil) (número do protocolo: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Isolamento de PBMCs humanas

1. Certifique-se de que as amostras de sangue, gradiente de densidade de 1.077 g/mL (por exemplo, Ficoll-Histopaque) e solução salina estejam em temperatura ambiente.
2. Dilua amostras de sangue com solução salina na proporção de 1:1.
3. Transfira 10-12 mL de gradiente de densidade para tubos de 50 mL.
4. Cubra cuidadosamente até 40 mL da amostra de sangue diluída no topo do gradiente de densidade. Separe as camadas de gradiente de sangue e densidade.
5. Primeira centrifugação: tubos de centrífuga contendo camadas de sangue e gradiente de densidade a 400 x g por 30 min a 24 ºC.
   NOTA: Desligue o freio antes de ligar a centrífuga.
6. Remova o plasma acima do anel PBMC com uma pipeta (a camada de revestimento leucocitário está localizada entre as camadas de plasma e gradiente de densidade; abaixo disso estão os glóbulos vermelhos / granulócitos).
7. Transferir a camada de PBMC em forma de nuvem (camada de revestimento leucocitário) com uma pipeta para um tubo de 15 ml e encher com solução salina fria (mantida no gelo ou a 4 °C).
8. Segunda centrifugação: tubos de centrífuga a 300 x g durante 10 min a 4 °C com o travão ligado.
9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet enchendo o tubo com solução salina fria.
10. Terceira centrifugação: tubos de centrifugação a 250 x g durante 10 min a 4 °C com o travão ligado.
11. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet, enchendo o tubo com solução salina fria.
12. Quarta centrifugação: centrifugar o tubo a 200 x g durante 10 min a 4 °C com o travão ligado.
13. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 1 ml de meio RPMI frio.
14. Conte as células para determinar o número de células obtidas.

2. Diferenciação em macrófagos humanos

NOTA: Para uma placa de 24 poços, calcule a quantidade total de células necessárias para plaquear 2 x 10⁶ células por poço, o que produzirá 2 x 10⁵ macrófagos. Este rendimento é baseado em uma média de 10% de monócitos no sangue humano. Alternativamente, os monócitos também podem ser liberados por métodos não enzimáticos e depois contados para plaqueamento.

1. Em uma placa de 24 poços, coloque lamínulas de vidro redondas de 13 mm no fundo de cada poço. Placa o equivalente a 2×10⁶ células em 1 mL de RPMI incompleto por poço.
   NOTA: Limite o número de células em cada poço, pois quantidades superestimadas podem dificultar a adesão celular e comprometer a cultura. Além disso, todas as lamínulas devem estar limpas e estéreis.
2. Incubar as placas por 30 min a 37 ºC sob 5% de CO₂ para adesão celular.
3. Remova os sobrenadantes e lave uma vez com solução salina a 0,9% em temperatura ambiente para remover quaisquer células não aderentes.
4. Após a lavagem, remova a solução salina e adicione 250 μL de meio RPMI suplementado à temperatura ambiente (10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 50 ng/mL M-CSF) a cada poço.
5. Incubar as células durante 7 dias a 37 ºC sob 5% de CO₂.
   1. Adicione 125 μL de meio RPMI suplementado a cada poço a cada dois dias. No final da diferenciação celular, o volume final será de 500 μL por poço.
   2. Para analisar a viabilidade celular, realize outra cultura em paralelo em uma placa de 96 poços (2 x 10⁵ por poço).
   3. Após a diferenciação em macrófagos (7 dias), adicionar 20 μL de reagente AlamarBlue.
   4. Após 7 horas de incubação, ler as placas num espectrofotómetro nos comprimentos de onda de 570 nm e 600 nm.

3. Cultura e infecção por Leishmania

NOTA: Promastigotas de L. braziliensis de duas cepas diferentes (MHOM/BR/01/BA788 e MHOM/BR88/BA-3456) foram utilizadas neste ensaio.

1. Conte os parasitas Lb e calcule o volume para obter 5 x 10⁵ / mL de parasitas.
2. Prepare o meio Schneider's Insect suplementado (10% FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina).
3. Incubar parasitas em um volume total de 5 mL em uma incubadora a 24 ºC até atingir a fase estacionária (4 a 6 dias).
   NOTA: Conte os parasitas todos os dias para avaliar o crescimento.
4. Depois de atingir a fase estacionária, centrifugar culturas de Leishmania a 100 x g por 10 min a 4 ºC para remover quaisquer parasitas mortos (precipitados no fundo do tubo).
5. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 1.800 x g durante 10 min a 4 ºC para recuperar os parasitas viáveis. Descarte o sobrenadante.
6. Ressuspenda o pellet com 1 mL de meio RPMI suplementado para contar os parasitas.
7. Calcule o volume de parasitas para obter uma proporção de 10:1 parasita:célula. Transfira parasitas para placas de cultura contendo macrófagos previamente cultivados em meio RPMI suplementado (~ 300 μL / poço) à temperatura ambiente.
8. Remover o sobrenadante de cada alvéolo que contenha macrófagos diferenciados.
   NOTA: Assim que possível, substitua o meio em cada poço para evitar que as células passem longos períodos sem meio. Sugerimos remover e substituir o meio em três poços de cada vez.
9. Transfira a quantidade calculada de Lb para cada poço contendo macrófagos diferenciados.
10. Infectar as células por 4 ou 24 horas a 37 ºC sob 5% de CO₂.
    1. Após 4 horas, lave os macrófagos 3 vezes com solução salina em temperatura ambiente para remover quaisquer parasitas não internalizados.
    2. Durante o período de infecção de 24 horas, adicione 300 μL de meio RPMI suplementado a cada poço após a lavagem e, em seguida, reincube por mais 20 horas a 37 ° C sob 5% de CO₂.
11. Remova o sobrenadante para medir os mediadores inflamatórios usando um ensaio imunoenzimático (ELISA) seguindo as instruções do fabricante.
    1. Centrifugue o sobrenadante coletado a 1.800 x g por 10 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Este procedimento é realizado para remover quaisquer parasitas não internalizados. Os sobrenadantes podem ser congelados e mantidos a -80^oC até o momento da análise futura.
       NOTA: As células podem ser usadas para avaliar a taxa de infecção, a viabilidade do parasita ou a produção de ROS.

4. Avaliação da infecção

1. Quantificação da taxa de infecção
   1. Adicione 300 μL de metanol a cada poço após remover o sobrenadante. Aguarde 15 minutos para fixar as células aderidas às lamínulas.
   2. Remova as lamínulas dos poços e coloque em um suporte para mergulhar na solução de coloração celular (por exemplo, Quick Panoptic 2) por 1 min.
   3. Mergulhe as lamínulas duas vezes na solução de coloração celular (por exemplo, Quick Panoptic 3) e espere até secar.
   4. Coloque 15 μL de meio de montagem (por exemplo, Entellan) nas lâminas e, em seguida, coloque lamínulas sobre o meio.
      NOTA: Todos os macrófagos presos às lamínulas devem estar em contato com o meio de montagem.
   5. Conte 100 células aleatoriamente sob um microscópio óptico usando uma objetiva de 100x para quantificar a taxa de infecção e o número de amastigotas internalizadas.
2. Viabilidade do parasita
   1. Após 4 horas de infecção, lave as células com solução salina em temperatura ambiente 3 vezes.
   2. Adicione 300 μL de meio Schneider's Insect suplementado.
   3. Incubar em incubadora a 24 ºC.
   4. Quantifique o crescimento do parasita após 48, 72, 96 e 120 horas.

5. Avaliação da produção de ROS por microscopia de fluorescência

1. Após o período de infecção, remova o sobrenadante e lave as células com 500 μL de solução salina.
2. Adicione 300 μL do reagente de sonda fluorogênica (por exemplo, CellROX Green Reagent a 5 μM) a cada poço.
3. Incubar células por 30 min a 37 ºC e 5% de CO₂.
4. Lave as células 3x com 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
5. Fixe as células com 300 μL de formaldeído a 3,7% e deixe descansar por 15 min.
   NOTA: Meça o sinal de florescência em 24 horas.
6. Adicione 5 μL de agente de coloração DAPI (por exemplo, antifade DAPI ProLong Gold) para coloração celular. Coloque a lamínula com a superfície contendo macrófagos em contato direto com o agente de coloração DAPI.
7. Analisar o sinal de florescência por microscopia de fluorescência a um comprimento de onda de excitação de 485/520 nm.
8. Calcule a fluorescência total corrigida da célula (CTCF) de 30 células para cada lamínula usando o ImageJ.
   CTCF = Densidade Integrada (Área de uma célula selecionada x Fluorescência média das leituras de fundo)

6. Análise estatística

1. Use o teste de Mann-Whitney para comparar dois grupos com amostras não pareadas. Realize as análises estatísticas usando o GraphPad Prism 7.0. Considera-se diferenças estatisticamente significativas quando p < 0,05.

Resultados

A compreensão da interação entre parasitas e células hospedeiras é crucial para elucidar os mecanismos envolvidos na patogênese de diversas doenças. Embora as células humanas cultivadas sejam menos utilizadas devido às limitações da cultura celular em comparação com as linhagens celulares, o protocolo aqui apresentado mostra uma diferenciação robusta e reprodutível de macrófagos humanos. Este protocolo permite a análise de vários aspectos da resposta imune e da biologia celular, desde a produção de mediadores inflamatóri...

Discussão

O protocolo aqui apresentado para a diferenciação de monócitos humanos em macrófagos seguida da infecção por duas cepas de L. braziliensis permite a avaliação de vários aspectos da interação parasito-célula. Essas ferramentas podem ser cruciais para elucidar questões não respondidas sobre a LC. Com o estabelecimento desse protocolo, nosso grupo pôde desvendar alguns aspectos da resposta imune de macrófagos obtidos de indivíduos com diabetes e LC¹⁴.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AlamarBlue Reagente de Viabilidade Celular	Invitrogen	DAL1100
Frasco de Cultura de Células 25 cm²	SPL	70125
CellROX Green Reagent	Invitrogen	C10444
Círculos de lamínula 13 mm	Perfecta	10210013CE
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	ThermoFisher	D1306
Suporte descartável para coleta de sangue	BD Vacutainer	364815
Agulha de coleta de sangue Eclipse 21 g x 1.25 in	Vacutainer	368607
Entellan	Sigma Aldrich	107961
Falcon, tubos cônicos	Sigma Aldrich	CLS430791-500EA
mL, 50 mL	StemCell Technologies	100-0090
Soro bovino fetal	Gibco	A4766801
formaldeído 3,7%	Merck	252549
Lâmina de vidro  25,4x76,2mm	Perfecta	0200
Histopaque	Sigma Aldrich	10771
Kit ELISA IL-6 Humano	RD	DY206
Proteína Recombinante Humana M-CSF	PeproTech	300-25
Kit ELISA TNF-a Humano	RD	DY210
Leucotrieno B4 Kit ELISA	Cayman
Metanol	Merck	MX0482
Penilicina-Sreptomicina-Glutamina (100x)	ThermoFisher	10378-016
Solução salina tamponada com fosfato pH 7,2 (10x)	Gibco	70013032
, 158 unidades USP de heparina sódica (revestida por spray)	BD Vacutainer	367874
Quick H& Kit de coloração E (hematoxilina e eosina)	abcam	ab245880
RPMI 1640 Médio	Gibco	11875093
Inseto Schneider's Médio	Sigma Aldrich	S0146
Placa de cultura de tecidos de 24 poços	TPP	Z707791-126EA
Trypan Blue	Gibco	15250061

Tubos cônicos BD de 15520111Tubo de plasma