Imunofenoftipagem e Triagem celular de MKs humanos de fontes primárias humanas ou in vitro diferenciados de progenitores hematopoiéticos

Resumo

Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.

Resumo

A diferenciação de megacariócito (MK) abrange uma série de ciclos endomitóticos que resultam em uma célula altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N) e extremamente grande (40-60 μm). Ao contrário do rápido crescimento do conhecimento em megacaripoiesis na biologia celular e no nível molecular, a caracterização da megacariopoiese por citometria de fluxo limita-se à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos da linhagem, enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping que permite a identificação de estágios sucessivos de diferenciação de MK, com status ploidy crescente, em fontes primárias humanas ou culturas in vitro com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK. Apesar de seu tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando o painel acima mencionado e enriquecidos pela triagem celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal. Essa abordagem facilita estudos multi-Omics, com o objetivo de entender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas em humanos. Uma melhor caracterização da megacaritopoiese pode representar fundamental no diagnóstico ou prognóstico de patologias e malignidade relacionadas à linhagem.

Introdução

Os megacariócitos (MKs) desenvolvem-se a partir de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) seguindo um processo complexo chamado megacariiopoiese, que é orquestrado principalmente pelo hormônio trombopoietina (TPO). A visão clássica da megacaripoiese descreve a jornada celular dos HSCs através de uma sucessão de estágios hierárquicos de progenitores comprometidos e células precursoras, levando finalmente a um MK maduro. Durante a maturação, os MKs experimentam múltiplas rodadas de endomitose, desenvolvem um intrincado sistema de membrana intracelular (DMS), que fornece superfície de membrana suficiente para a produção de plaquetas, e produzem e embalam eficientemente a infinidade de fatores que estão contidos nos diferentes grânulos herdados pelas plaquetas maduras^1,2,3. Como resultado, MKs maduros são células grandes (40-60 μm) caracterizadas por um núcleo altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N). Estudos recentes sugerem rotas alternativas pelas quais os HSCs se diferenciam em MKs contornando os pontos de verificação tradicionais de compromisso de linhagem em resposta a certas condições fisio-patológicas^{4,5,6,7,8,9,10,11}. Esses achados destacam que a diferenciação hematopoiética em relação ao MK maduro é um processo contínuo e adaptativo que responde às necessidades biológicas.

Com o crescente conhecimento sobre a biologia celular e os aspectos moleculares caracterizando a megacariopoiese¹², a maioria das pesquisas dedicadas ao estudo do processo por citometria de fluxo estão limitadas à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja, CD42A/B, CD41/CD61), enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Documentamos anteriormente uma estratégia para encenar megacaripoiesis em medula óssea de camundongos e culturas MK derivadas da medula óssea^13,14, que adaptamos e aplicamos aos humanos¹⁵. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteca que permite a caracterização da megacariiopoiese, dos HSCs aos MKs maduros, em fontes primárias humanas (medula óssea -BM e sangue periférico -PB-) ou culturas in vitro utilizando um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT e CD71, entre outros). Apesar de seu grande tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando os marcadores de superfície celular acima mencionados e enriquecidos pela classificação celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal para minimizar a ruptura celular e/ou danos. Essa técnica facilita abordagens multi-Omics, com o objetivo de compreender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas na saúde humana e na doença. Vale ressaltar que será uma ferramenta útil para auxiliar o diagnóstico e o prognóstico em um contexto clínico de crescente demanda.

Neste manuscrito documentamos uma estratégia para encenar megacaripoiesis humanas com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK de fontes primárias ou gerados in vitro. Além disso, fornecemos um protocolo para classificar, com um classificador celular ativado por fluorescência, as frações preferidas e MKs maduros(Figura 1). Este passo não é popular, pois é tecnicamente difícil devido ao grande tamanho e fragilidade dos MKs. No entanto, tem sido empregado tanto em amostras de camundongos quanto de medula óssea humana anteriormente, e devido ao avanço tecnológico, com melhor resultado a cada vez^16,17,18. Fontes primárias humanas onde mks ou precursores mk podem ser estudados incluem medula óssea, sangue do cordão umbilical e sangue periférico, entre outros. O processamento adequado da amostra para isolar a fração celular relevante para análise em cada amostra é de importância. Os procedimentos padrão são incorporados, com algumas considerações a serem consideradas ao mirar no estudo da megacaripoiese.

Protocolo

Amostras de sangue e medula óssea inteiras foram obtidas e processadas de acordo com a Declaração de Helsinque de 1964. Amostras de sangue integrais foram obtidas de doadores saudáveis após o consentimento informado (ISPA), dentro de um estudo aprovado pelo nosso comitê de ética médica institucional (Hospital Universitário Central de Astúrias -HUCA-). Amostras de medula óssea foram obtidas a partir do material de descarte aspirado de medula óssea de pacientes administrados no Departamento de Hematologia do Hospital Clínico São Carlos (HCSC).

Figura 1: Representação esquemática do protocolo documentado neste manuscrito. As principais fontes humanas ou culturas primárias onde a diferenciação de MK pode ser encenada usando imunofenofoteping são indicadas. Essa estratégia de imunofenofoteping pode ser aplicada ao estudo do processo em diferentes patologias relacionadas à linhagem ou malignidade em fontes primárias. Além disso, torna possível a classificação celular de MKs e precursores com um classificador celular ativado por fluorescência, o que permite uma análise mais aprofundada de frações enriquecidas. As imagens utilizadas fazem parte da Servier Medical Art (SMART) da Servier e são licenciadas sob CC BY 3.0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Processamento total de sangue e medula óssea antes da imunofenofoteping

1. Ao usar sangue inteiro (WB) de doações como fonte primária, isole opcionalmente o componente do fábula mononuclear de sangue periférico (PBMC). Isso pode ser alcançado usando centrifugação diferencial padrão combinada com separação de células gradientes de densidade, como descrito anteriormente¹⁵.
   1. Resumindo, centrífuga sangue a 193 x g por 15 min (freio 3) à temperatura ambiente. Descarte a fração de plasma superior e colete o anel de buffy. Diluir 1:1 com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS)/Dihidrato citrato de trisódico (38 g/L, pH 7) tampão e pipeta cuidadosamente um volume de 25 mL em cima de 15 mL de uma solução de gradiente de densidade (1,076 g/mL) em tubos de 50 mL.
   2. Centrifugar por 20 min a 1114 x g (acelerador 3, freio 3, temperatura ambiente). Descarte a fração de plasma e colete o anel de buffy contendo PBMCs. Lave adicionando o mesmo volume de PBS, centrífuga a 435 x g por 5 min e resuspend em PBS para uso posterior.
2. Alternativamente, use uma amostra de WB (cerca de 100 μL) para imunofenofonping após a linchação dos glóbulos vermelhos (RBCs) e lavagem completa.
   1. Em suma, diluir 1:1 no tampão de lise RBC frio (4,15 g de NH₄Cl, 0,5 g de KHCO₃ e 18,5 mgs de EDTA (triplex III) a 500 mL de H₂O, pH 7.1-7.4). Aguarde até que a suspensão celular fique vermelha (3-5 min).
   2. Centrifugar a 435 x g por 5 min, a 4 °C, e resuspensar as células em PBS. Repita o procedimento quantas vezes for necessário para obter uma pelota de célula branca.
3. Da mesma forma, processe diretamente as amostras obtidas a partir da medula óssea (aspiração) com tampão de lise RBC (ver ponto 1.2) e lavagem completa, para começar com uma suspensão unicelular clara(Figura 1).
   1. Evite o uso de vórtice para misturar amostras durante o processamento, pois pode danificar os MKs frágeis. Misture piscando ou invertendo o tubo.
      NOTA: O gradiente de densidade para obter PBMCs pode resultar em uma fração celular mais rica e limpa em comparação com o WB rbc-lysed. No entanto, devemos ter em mente que MKs maduros de alta densidade podem ser perdidos na fração "neutrófilo". Isso será discutido nos resultados representativos.

2. Diferenciação in vitro de MK dos PBMCs

NOTA: Os MKs podem ser diferenciados in vitro de precursores anteriores, como células CD34⁺ presentes em diferentes fontes primárias(ou seja, WB/PBMCs, sangue do cordão umbilical, medula óssea) e de iPSCs. Existem diferentes protocolos que foram aplicados a este fim. Aqui, utilizamos um método de cultura desenvolvido por nós que permite a diferenciação de MK dos PBMCs, sem a necessidade de enriquecer para CD34⁺ precursores^{15,19,20,21,22}.

1. Este protocolo consiste em três fases culturais, onde a concentração de trombopoietina (TPO) aumenta gradualmente em detrimento de fatores de crescimento que favorecem a proliferação de precursores anteriores (ou seja,SCF, EPO), que gradualmente diminuem (Figura 2)¹⁵.
   1. Para o meio base, utilize StemSpan SFEM complementado com 0,4% de mistura lipídica rica em colesterol e 1% penicilina/estreptomicina.
      1. Para o meio de fase I, utilize o meio de base suplementado com SCF (100 ng/mL), Eritropoietina (EPO, 0,5 U/mL) e Trombopoietina (TPO, 30 ng/mL). O meio de fase II é o médio-base suplementado com SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) e TPO (50 ng/mL). Para o meio da Fase III, utilize o meio de base suplementado com TPO (100 ng/mL).
   2. CULTURA PBMCs em fase I médio. No dia 6-8, coloque os PBMCs em média fase II, e no dia 9-12 coloquem os PBMCs na Fase III do meio.
   3. Substitua o meio por centrifugadores de células a 435 x g por 5 min à temperatura ambiente da Fase I à Fase II, e a 95 x g por 5 min à temperatura ambiente da Fase II à Fase III, e resumem-nas em meio fresco.
   4. Células de cultura em uma incubadora a 37 °C, 5% CO₂. Nessas culturas primárias, a diferenciação de MK dura de 10 a 14 dias, e as amostras podem ser sorteadas em diferentes momentos ao longo do período cultural, para acompanhar a diferenciação de MK.

Figura 2: Representação esquemática do método de cultura MK derivado do PBMC. Os PBMCs de doadores saudáveis foram cultivados de acordo com o protocolo trifásico desenvolvido por nós para gerar MK in vitro (esquema adaptado de Salunkhe et al). ¹⁵ Fotos tiradas no dia 10 e dia 13 de cultura são mostradas. As fotos são tiradas com um objetivo de 20X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Coleta de amostras: Lave as células aplicando centrifugação de baixa velocidade por 5 min (95 x g) e resuspense-as em PBS ou PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA). Para imunofenofoteping, a densidade ideal é de 10⁵-10⁶ células/100 μL (ver ponto 3.1). Dependendo do estado das culturas (ou seja, a presença de células mortas, detritos, etc.), podem ser necessárias 1 ou 2 lavagens. Colete suas células nos pontos de interesse durante a cultura.

3. Imunofenoftipagem da diferenciação MK - incubação com um painel de anticorpos marcados

1. Incubar as amostras de células com um painel de anticorpos marcados seguindo os procedimentos padrão, prestando atenção à centrífuga em baixa velocidade (95 x g) ao processar megacariócitos. Normalmente incubamos as amostras com 1% de BSA em PBS em volumes de 100 μL a 4 °C, 20 min, com uma faixa de 10⁵-10⁶ células.
2. Aumente quando necessário.
3. Após a incubação, adicione 5 mL de 1% de BSA no PBS, centrífuga em baixa velocidade (95 x g), aspire o supernasal e resuspense a amostra em 2% BSA no PBS para preservar a viabilidade MK (2 mL). Adicione 1-5 mM EDTA para interromper agregados de células celulares (que são naturalmente vistos nas culturas MK).
4. Transfira amostras para um tubo de fundo redondo de 12 x 75 mm (tubo FACS) ou placa, mantendo-as no escuro até a análise da citometria de fluxo ou a classificação celular.
5. Preparação das misturas de anticorpos e anticorpos únicos; configuração do citómetro de fluxo:
   1. Titular os anticorpos antes de seu uso para determinar a concentração ideal nos painéis de anticorpos. A concentração ideal de anticorpos é a menor concentração que separa claramente positivo das células negativas (e permite a distinção dos níveis intermediários de expressão). Como exemplo, a maioria dos anticorpos são usados em uma diluição de 1:200 (estoque de 100 μg/mL) a menos que de outra forma titulado ou indicado pelo fabricante.
   2. Uma vez determinada a titulação do anticorpo, prepare uma diluição de 10x de cada anticorpo. Estas diluições são usadas para os controles de cor única e para o preparo das misturas do painel. As diluições e misturas de painel são boas para uso mesmo um mês após a preparação (armazenadas a 4 °C, a menos que as indicações do fabricante impeçam essas condições de armazenamento). Isso permite a coloração de amostras com o mesmo painel durante um período de tempo.
   3. Use 10 μL por 100 μL da diluição de 10x tanto para os controles de cor única quanto para a mistura do painel.
      1. Para os controles de cor única, use contas de afinidade de anticorpos, que podem ser medidas diretamente após a adição do anticorpo. Os controles de cor única devem ser medidos a cada experimento, para permitir o ajuste adequado da compensação (e ajuste fino pós-medição com o software de análise).
      2. Alternativamente, realize os controles de cor única com amostras de células. No entanto, as contas permitem a medição rápida de um determinado número de eventos, que, dependendo do marcador de anticorpos/superfície, pode não ser possível obter em complexas fontes celulares primárias ou cultivadas. Também aconselhamos executar amostras de células manchadas com misturas de painel "Fluorescence Minus One" (FMO) para configurar as configurações de compensação apropriadas (antes de executar experimentos). Isso é relevante para identificar cuidadosamente problemas de compensação e, especialmente, em MKs cultos, identificar interferências de autofluorescência (que estarão presentes se usarem meio de cultura contendo vermelho fenol).
   4. Prepare o volume suficiente da mistura do painel, dependendo do número de amostras, contendo os anticorpos do painel projetado. A maioria dos nossos painéis inclui seis anticorpos (painéis de 6 cores, ver Tabelas 1-2).
   5. Para estes painéis, utilize lasers de 488 nm e 633 nm do citômetro de fluxo, no entanto, os painéis podem ser adaptados a outros cenários técnicos. Além disso, as considerações de compensação podem ser obviadas ao usar citometria de fluxo baseada em especttrometria de massa ou citómetros com tecnologia de foco acústico.
      1. Corantes para medir a viabilidade podem dar informações falsas sobre MKs, especialmente quando amadurecem. MKs são células de uptaking muito ativas, e a positividade com Hoechst, 7-AAD ou PE, pode nem sempre refletir a morte celular real. Uma alternativa (se for necessária a medição da morte celular) pode ser o uso de manchas de mitocôndrias (CMX Ros) ou corantes reativos de amina (corantes zumbis ou fantasmas).

Tabela 1: Notas sobre marcadores de superfície celular da linhagem megacariocítica Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Painéis de anticorpos Clique aqui para baixar esta Tabela.

4. Análise de ploidy combinada com painéis de 6 cores

1. Para análise ploidy, em combinação com um painel de anticorpos de 6 cores, proceda com fixação e permeabilização das células após a incubação com o painel de anticorpos. Essa estratégia permitirá a preservação da coloração do marcador de superfície, permitindo a coloração do DNA das células. Usamos hoechst 33342 para manchar DNA, pois pode ser visualizado com o laser violeta 405 nm disponível.
2. Para 10⁵-10⁶ células, após a incubação com o painel de anticorpos, células centrífugas (95 x g por 5 min), resuspend em 200 μL de tampão de fixação e incubar 10 min à temperatura ambiente (RT).
3. Células centrífugas como indicado acima, resuspensadas pela segunda vez em 200 μL tampão de fixação, e incubar outros 10 min no RT.
4. Prepare o tampão de permeabilização, contendo 0,1% Triton X-100, 200 mg/mL RNase e 20 mg/mL Hoechst 33342 (permeabilização Hoechst MIX).
5. Centrífugas como acima, resuspenque-as em 300 μL da permeabilização Hoechst MIX e incubar 30 min a 37 °C. Esse passo é muito importante, pois, para obter uma medição de ploidy limpa, o RNA tem que ser degradado.
6. Após o tempo de incubação, meça amostras diretamente com um citómetro de fluxo. Caso contrário, mantenha as amostras a 4 °C, no escuro. Meça-os prontamente. No entanto, como essas amostras são fixas, a medição pode ser adiada até mesmo de 24 a 48 horas. Certifique-se de que a amostra é bem vista antes da medição, ou passada através de um coador de células, para garantir uma única suspensão celular.
   1. Parâmetros morfométricos como Forward e Side Scatter não são mantidos após a fixação celular. O gráfico dispersão para frente/lado mostrará um encolhimento da distribuição celular após a fixação. No entanto, a coloração do marcador de superfície é principalmente preservada, e a estratégia de gating é mal alterada, permitindo a análise do status ploidy nos diferentes estágios de diferenciação definidos por combinações de marcadores de superfície.

5. Análise de diferenciação mk

NOTA: Vimos que a combinação de CD31/CD71 permite definir uma série de portões que correspondem a diferentes estágios de diferenciação de MK. Mais retrocesso com marcadores específicos de MK permite a separação de MKs maduros e imaturos. Além disso, em amostras frescas, back-gating para verificar a presença de outros marcadores utilizados, ou para colocar as populações nos eixos de dispersão dianteira/lateral, refina a avaliação dos estágios de diferenciação de MK e permite descartar outros tipos de células que poderiam estar presentes nas mesmas populações.

1. Use um painel de anticorpos que inclui marcadores precursores iniciais (KIT, CD34), marcadores precursores comuns (CD31, CD71) e marcadores de linhagem, alguns deles específicos (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, etc) (ver Tabelas 1-2). O uso do coquetel Lineage (Lin) (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 e CD56), também permite "filtrar" células hematopoiéticas maduras que podem adicionar ruído à análise (ao selecionar o Lin^- população). Como exemplo, passaremos pela análise de MKs em PBMCs, medula óssea e através de culturas celulares derivadas do PBMC nos resultados representativos.

6. Classificação de células precursoras MK e MK

NOTA: As células manchadas foram analisadas e classificadas em um classificador de células ativado pela fluorescência FACS Aria IIu equipado com lasers de estado sólido padrão de 488 nm e 633 nm usando o software FACSDiva; os dados foram ainda analisados e apresentados utilizando-se o software FlowJo e o Cytobank (análise viSNE). A pureza das frações classificadas foi confirmada pela análise de citometria de fluxo de cada uma das frações classificadas (pureza acima de 85%).

1. Realize a triagem celular o mais rápido possível ou dentro de 1 hora após a incubação de anticorpos, a fim de evitar a deterioração celular.
2. Filtre a amostra com um filtro de célula de 100 μm para garantir a suspensão de célula única e a integridade de MK grande.
3. Use um bocal cerâmico de 130 μm, uma pressão de baia definida para 11 libras por polegada quadrada (PSI) e a frequência de unidade de gota definida para 12 kHz para quebrar o fluxo em gotas.
4. Antes da triagem, esterilize as linhas de bocal, bainha e amostra, realizando uma aquisição de 30 minutos com penicilina/estreptomicina diluída 1:5 em água estéril, seguida por uma aquisição de 10 minutos com água estéril para remover o descontaminante restante.
5. Uma vez estabilizado o fluxo, ajuste o drop-delay com contas recomendadas, a fim de classificar no modo de sintonia fina mais de 97,5% das quedas refletidas a uma taxa de fluxo de 400-1200 eventos por segundo.
6. Prepare a coleta de tubos FACS com 500 μL de 2% de BSA em PBS. O percentual de BSA pode ser aumentado em até 5-10%.
7. Gere o modelo de experimento com os parâmetros adequados da matriz de compensação.
8. Carregue o tubo FACS no citômetro.
9. Realize uma medição da amostra para definir os portões desejados e a pureza das populações celulares-alvo. Mantenha o registro ativado para mostrar até 200.000 eventos nos portões da população selecionada durante a triagem celular.
10. FACS Aria IIu permite a separação de até 4 populações celulares diferentes ao mesmo tempo. Crie um novo layout de classificação e selecione o dispositivo de coleta (4 tubos) e o modo de precisão apropriado (recomenda-se máscara intermediária de pureza e recuperação). Por fim, adicione a população de interesse a cada campo de localização de classificação(Figura 3).

Figura 3: Representação esquemática do princípio da classificação celular ativada pela fluorescência (FACS). As partículas passam pelo bocal de 130 μm e são forçadas a se dividir em um fluxo de gotículas regulares devido à aplicação de vibração no bocal. Em seguida, as gotículas são interrogadas pelo laser (ponto de análise) e os sinais são processados para dar a "decisão do tipo" aplicando uma carga a essas gotículas. Quando uma gotícula de carga passa por um campo eletrostático de alta tensão (placa de detecção), ela é desviada e coletada no tubo de coleta correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

11. Carregue os tubos de coleta e comece a classificar as populações-alvo.
12. Centrifugar os tubos de coleta por 5 minutos a 95 x g e resuspensar a pelota celular no volume apropriado de 2% de BSA em PBS.
13. Meça novamente uma fração de cada amostra classificada, para calcular a pureza.
14. Armazene células adequadamente para uso posterior. As células classificadas podem ser utilizadas para análises citológicas e moleculares, ou podem ser reeducinadas com o objetivo de estudar o processo de diferenciação de uma população celular selecionada.

7. Preparação da amostra pós-classificação

1. Preparando citospins para análise citológica com um citocentrifuge
   1. Leve células classificadas para um volume de trabalho fácil de lidar de 100-200 μL. Leve em consideração que a densidade celular dependerá do rendimento populacional ordenado em cada caso.
   2. Coloque um slide limpo no suporte de metal e coloque uma parte superior do filtro. Lembre-se de rotular o slide e o filtro para evitar misturar amostras.
   3. Adicione 100 PBS μL no orifício do filtro contra o slide, para que o filtro seja umidificado na borda do orifício.
   4. Coloque o funil, feche o suporte de metal e coloque-o em seu local na centrífuga.
   5. Adicione a amostra (100-200 μL) dentro do funil.
   6. Centrifugar a 36 x g por 5 minutos. Os slides de citospin podem ser autorizados a secar no RT (devidamente coberto para evitar poeira) e podem ser mantidos em RT por 1 semana antes da imunostaining ou histoquímica.
2. Para imunostaining
   1. Corrija slides em 2% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS e incubar durante 5min.
      1. Pode-se utilizar uma faixa de 0,5-4% de PFA no PBS. Em nossas mãos, usamos 4% para obter a fixação adequada de tecidos ou alguns tipos de células, e 0,5% pfa em PBS é suficiente para plaquetas. Ao configurar essa técnica, a porcentagem certa de PFA requer otimização por tipo/fonte celular.
   2. Incubar 5 min na PBS.
   3. Incubar 5 min em 50% de etanol (EtOH).
   4. Incubar 5 min em 70% EtOH.
   5. Armazenar em 70% EtOH a -20ºC.
   6. Ao realizar a imunostainação, reidratar e seguir procedimentos padrão (permeabilização, lavagem, bloqueio, incubações de anticorpos primários e secundários, preservação, etc).
3. Para citoquímica:
   NOTA: Os slides podem ser manchados com a coloração may-Grünwald Giemsa ou a mancha conveniente para cada finalidade.
4. Para exame de morfologia imediata
   1. Adicione uma gota de meio de montagem no ponto contendo célula do citospin e coloque uma mancha de cobertura.
   2. Mantenha slides a 4 °C não mais do que uma semana, a menos que selado, o que permite armazenamento a longo prazo mesmo no RT. A fixação média de montagem permite o armazenamento a longo prazo no RT.

Resultados

Medula Óssea e Ploidy
Na Figura 4, mostramos uma análise representativa de imunofenofoteping de megacaripoiese em amostras de BM (aspiração) de pacientes. Ao traçar a fração celular contra CD71 e CD31, temos fechado seis populações principais: CD31^- CD71^- (vermelho), CD31^- CD71⁺ (azul), CD31⁺ CD71^- (laranja), CD31⁺ CD71^mid (verde claro), CD31⁺ CD71⁺

Discussão

A maior parte da pesquisa com foco no estudo da megacariopoiese por citometria de fluxo é até hoje limitada à identificação de subconjuntos MK usando apenas marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja,CD42A/CD42B, CD41/CD61), enquanto estágios anteriores de diferenciação de MK foram mal examinados. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteping para abordar uma caracterização abrangente da citometria de fluxo da megacariopoiese humana. No geral, gostaríamos de destacar a utilidade...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bico de 130 mícrons	BD	643943	necessário para classificação MK
5810R Centrífuga	Eppendorf		Isolamento de células e lavagens
A-4-62 Rotor de balde oscilante	Eppendorf		Isolamento de células e lavagens
Aerospray Pro Hematology Blade Stainer / Cytocentrifuge	ELITech Group		Dispositivo de citologia automatizado, onde as lâminas são coradas com Mat-Gr& uuml; nwald Giemsa
CO2 Incubadora Galaxy 170 S	Eppendorf		Cell Incubation
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific		Para preparar cytospins
FACSAria IIu classificador	BD		Lasers 488-nm e 633-nm
FACSCanto II citômetro de fluxo	BD		Lasers 488-nm , 633-nm e 405-nm
Microscópio Olympus BX 41	Microfotografias	Olympus
Microscópio Olympus BX 61	Microfotografias Olympus
Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Microfotografias
Para obter PBMCs
Lipídios Colesterol Rico a partir de soro bovino adulto	Sigma-Aldrich	L4646	ou similar
Lymphoprep	Stem Cell Technologies	#07801	ou
similar Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	ou similar
Eritropoietina humana recombinante (EPO)	R& D Systems	287-TC-500	ou similar
Fator de Célula-Tronco Humano Recombinante (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco & trade;	PHC2115	ou similar
Trombopoetina humana recombinante (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	Agonistas do	receptor PHC9514 ou TPO
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
			citometria de fluxo Albumina
de soro bovino	Merck	A7906-100G	ou similar
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Conjunto de partículas de compensação de controle negativo BD		552843	Os anticorpos para células humanas são geralmente de camundongos.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	ou similar
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Mouse anti-humano
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Mouse anti-humano
CD41 PE BD		555467	Mouse anti-humano
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	camundongo anti-humano
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	Observamos ligação inespecífica... que precisa ser avaliado
CD42A PE	BD		Camundongo anti-humano
CD42B PerCP	Biolegend	303910	Camundongo anti-humano
CD49B PE	BD		Camundongo anti-humano
CD61 FITC	BD	555753	Rato anti-humano
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Rato anti-humano
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human BD Fc Block	BD	564219	Fc blocking - control
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	Mouse anti-human
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Mouse anti-human
RNAse	Merck	R6513	ou similar
Triton X-500	Merck	93443-500ML	ou similar
Filtros de células para classificação
Filtros CellTrics 100 micrômetros	Sysmex	04-004-2328	Filtros de células
Nota: não especificamos reagentes/químicos gerais (PBS, EDTA, etc) ou descartáveis (tubos, etc), ou reagentes especificados em protocolos publicados anteriormente e padrão  - a menos que especificado de outra forma.