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Immunology and Infection

हीमोफिलस इन्फ्लुएंजा के लिए श्वसन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा श्वसन पथ में सूजन लाता है। यह लेख इस जीवाणु के जवाब में फागोसाइट्स और लिम्फोसाइटों द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करेगा।

Abstract

हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा (एचआई) एक प्रचलित जीवाणु है जो श्वसन स्थितियों की एक श्रृंखला में पाया जाता है। इस जीवाणु के लिए श्वसन प्रतिरक्षा / भड़काऊ प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए विभिन्न परखों / तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति-आधारित प्रौद्योगिकियां हैं जो जैविक प्रतिक्रियाओं के विस्तृत लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं। हाय एंटीजन के विभिन्न रूपों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें सेल दीवार घटक, मारे गए / निष्क्रिय तैयारी और जीवित बैक्टीरिया शामिल हैं। हाय एक तेज़ जीवाणु है जिसे समृद्ध मीडिया की आवश्यकता होती है लेकिन आमतौर पर मानक प्रयोगशाला सेटिंग्स में बढ़ना आसान होता है। हाय के साथ उत्तेजना के लिए ऊतक के नमूने परिधीय रक्त, ब्रोंकोस्कोपी, या निकाले गए फेफड़े (जैसे, फेफड़ों के कैंसर के इलाज के लिए सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों में) से प्राप्त किए जा सकते हैं। मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन को विभिन्न मापदंडों के साथ प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके व्यापक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें फागोसाइटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां और इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन शामिल हैं। लिम्फोसाइट फ़ंक्शन (जैसे, टी सेल और एनके सेल फ़ंक्शन) को विशेष रूप से फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है, मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन के लिए। हाय संक्रमण न्यूट्रोफिल (एनईटी) और मैक्रोफेज (एमईटी) दोनों द्वारा बाह्य जाल उत्पादन का एक शक्तिशाली प्रेरक है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी यकीनन नेट और एमईटी अभिव्यक्ति का आकलन करने का सबसे इष्टतम तरीका है, जिसका उपयोग प्रोटीज गतिविधि का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। हेमोफिलस इन्फ्लूएंजा के लिए फेफड़ों की प्रतिरक्षा का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है।

Introduction

हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा (हाय) एक सामान्य कॉमेंसल जीवाणु है जो अधिकांश स्वस्थ वयस्कों के ग्रसनी में मौजूद है। हाय में एक पॉलीसेकेराइड कैप्सूल (प्रकार ए-एफ, जैसे, टाइप बी या एचआईबी) हो सकता है या कैप्सूल की कमी हो सकती है और नॉनटाइपेबल (एनटीएचआई)1 हो सकता है। इस जीवाणु के साथ म्यूकोसा का औपनिवेशीकरण बचपन में शुरू होता है, और विभिन्न उपनिवेश उपभेदों का कारोबार होताहै। यह जीवाणु ऊपरी और निचले श्वसन पथ दोनों के आक्रमण में भी सक्षम है; इस संदर्भ में, यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सूजन3,4 के सक्रियण को प्रेरित कर सकता है। यह भड़काऊ प्रतिक्रिया नैदानिक बीमारी का कारण बन सकती है और साइनसाइटिस, ओटिटिस मीडिया, ब्रोंकाइटिस, सिस्टिक फाइब्रोसिस, निमोनिया और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) सहित विभिन्न महत्वपूर्ण श्वसन स्थितियों में योगदान कर सकती है। इनमें से अधिकांश स्थितियां एनटीएचआई उपभेदों2 के कारण हैं। यह लेख फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हाय के लिए श्वसन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करेगा।

नीचे वर्णित विधियों को अच्छी तरह से स्थापित तकनीकों से अनुकूलित किया गया है जिन्हें हाय के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए संशोधित किया गया है। हाय के एक उपयुक्त एंटीजेनिक रूप का चयन इस मूल्यांकन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। एंटीजेनिक तैयारी सेल दीवार घटकों से लेकर जीवित बैक्टीरिया तक होती है। परख स्थापित करने और मानकीकृत करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों का उपयोग शुरू में बहुत उपयोगी हो सकता है।

फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर स्तर पर एक नमूने से विभिन्न मापदंडों और कार्यात्मक परखों के माप को सक्षम बनाता है। इस तकनीक का लाभ यह है कि एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) या ईएलआईस्पॉट जैसे अन्य अधिक सामान्य तरीकों की तुलना में विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं (जैसे, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) या इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन का उत्पादन) का मूल्यांकन किया जा सकता है।

एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप न्यूट्रोफिल (एनईटी) 5,6,7 और मैक्रोफेज (एमईटी) 8 जैसे अन्य कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाते हैं। वे तेजी से एक महत्वपूर्ण भड़काऊ प्रतिक्रिया के रूप में पहचाने जाते हैं, खासकर फेफड़ों में संक्रमणमें 9। उनका मूल्यांकन कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। यह तकनीक एनईटी / एमईटी की निश्चित पहचान की अनुमति देती है और उनकी अभिव्यक्ति को कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों से अलग करतीहै।

फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दोनों फ्लोरेसेंस-आधारित परख हैं। उनकी सफलता जैविक नमूनों के इष्टतम तनाव प्रोटोकॉल पर निर्भर है। इन विधियों को सीखने में कुछ समय लगता है और उचित पर्यवेक्षण विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसमें शामिल उपकरण खरीदने और चलाने दोनों के लिए महंगे हैं। उनके उपयोग के लिए इष्टतम सेटिंग में प्रमुख विश्वविद्यालय और तृतीयक रेफरल अस्पताल शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली विधियां श्वसन रोग में शामिल अन्य समान जीवों के अध्ययन के लिए हस्तांतरणीय हैं (उदाहरण के लिए, मोक्सारेला कैटरहालिस और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया)। एनटीएचआई अन्य सामान्य श्वसन बैक्टीरिया10 के साथ भी बातचीत करता है।

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Protocol

इस काम को मोनाश हेल्थ की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. एंटीजेनिक तैयारी

नोट: हाय के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए तीन अलग-अलग एंटीजेनिक तैयारी का उपयोग किया जा सकता है। ये 1) एक उपकोशिकीय घटक (आमतौर पर जीवाणु कोशिका भित्ति से) हैं; 2) मारे गए और निष्क्रिय बैक्टीरिया; और 3) जीवित बैक्टीरिया। किसी भी प्रयोग की शुरुआत से पहले प्रत्येक एंटीजेनिक तैयारी के उपयोग को निर्धारित करें।

  1. उपकोशिकीय घटक
    1. स्रोतों से उपकोशिकीय घटक प्राप्त करें, जिसमें वाणिज्यिक तैयारी, इन-हाउस विकसित घटक और / या अन्य जांचकर्ता शामिल हैं।
      नोट: आमतौर पर जीवाणु कोशिका भित्ति से उपकोशिकीय घटकों का उपयोग किया जा सकता है और इसमें पी 6 और लिपोलिगोसैकराइड (एलओएस) 11,12 जैसे बाहरी झिल्ली प्रोटीन शामिल हैं। ये उपकोशिकीय घटक आमतौर पर विशेष केंद्रों में प्राप्त होते हैं। वे कैसे बनाए जाते हैं इसका विवरण इस लेख के दायरे से परे है। इन घटकों को प्राप्त करने के लिए इस क्षेत्र के विशेषज्ञों के साथ सीधे संपर्क की सिफारिश की जाती है।
  2. मारे गए/ निष्क्रिय बैक्टीरिया
    1. उपयुक्त नमूने (जैसे, थूक या ब्रोंकोस्कोपी) से बैक्टीरिया प्राप्त करें। एक उपयुक्त माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला का उपयोग करके एच इन्फ्लूएंजा के रूप में तनाव की पुष्टि करें। इन्फ्लूएंजा नमूनों की टाइपिंग करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि वे गैर-टाइपेबल हैं (एक विशेषज्ञ माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला द्वारा)।
    2. एक प्रतिनिधि एंटीजन प्राप्त करने के लिए, एक पूल एंटीजन बनाने के लिए कई एनटीएचआई उपभेदों (कम से कम 5, लगभग समान राशि का प्रत्येक) का उपयोग करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ग्लिसरॉल शोरबा में -70 डिग्री सेल्सियस पर उपभेदों को स्टोर करें।
      नोट: इस प्रयोग में, दस अलग-अलग उपभेदों का उपयोग किया गया था।
    3. चॉकलेट एगर प्लेटों पर उपभेदों (एक समय में एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब) को पिघलाएं और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर बढ़ते हैं। फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 500 μL में बैक्टीरिया जोड़ें और उन्हें दो बार धोएं (5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें)। 10 8 एमएल (5 एमएल कंटेनर या समकक्ष का उपयोग करके) की एकाग्रता के लिए एलिकोट एनटीएचआई के लिए मैकफारलैंड मानक 10 या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर13 का उपयोग करें।
    4. गर्मी बैक्टीरिया को 10 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर पानी के स्नान में रखकर निष्क्रिय कर देती है।
    5. 30 सेकंड के लिए कम-से-मध्यम रेंज की गति पर एक निरंतर सोनिकेशन सेटिंग का उपयोग करके बैक्टीरिया को सोनिकेट करें।
    6. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में नमूनों की उचित मात्रा को एलिकोट करें। 108 एमएल के नमूने के लिए, 50 μL (यानी, 20 नमूने प्रति एमएल) के एलिकोट का उपयोग करें, उन्हें आवश्यक14 तक -70 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  3. जीवित बैक्टीरिया
    1. सबसे पहले, चरण 1.2.1 में उल्लिखित जीवित बैक्टीरिया को चिह्नित करें। एक अच्छी तरह से विशेषता वाले तनाव का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि तनाव को ग्लिसरॉल शोरबा में -70 डिग्री सेल्सियस पर रिजर्व के रूप में भी संग्रहीत किया जाता है।
    2. बैक्टीरिया को समृद्ध मीडिया जैसे चॉकलेट अगर प्लेटों या शोरबा में उगाएं।
      1. चॉकलेट एगर प्लेटों का उपयोग करने के लिए, बाँझ स्प्रेडर के साथ कम से कम हर 3-4 दिनों के लिए बैक्टीरिया फैलाएं।
      2. वैकल्पिक रूप से, बैक्टीरिया को विकसित करने के लिए एक्स (हेमिन) और वी (β-निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड) कारकों से समृद्ध ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (बीएचआई) शोरबा का उपयोग करें। बीएचआई शोरबा के 5-10 एमएल में रात भर की प्लेटों से एनटीएचआई को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हेमिन और β-निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (दोनों 10 डिग्री सेल्सियस / एमएल) और कल्चर दोनों के साथ पूरक किया जाता है।
        नोट: इसमें प्रजनन क्षमता, उच्च कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गिनती का लाभ है, और सभी बैक्टीरिया लॉग विकास के समान चरण में हैं (प्लेटों पर, बैक्टीरिया की व्यवहार्यता संस्कृति में स्थिति के आधार पर अधिक हो सकती है)13,15।
    3. सेलुलर व्यवहार्यता बनाए रखते हुए एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए एक सेल में 100 बैक्टीरिया के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता का उपयोग करें। बैक्टीरिया की संख्या का आकलन करने के लिए मैकफारलैंड मानक10 या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर13 का उपयोग करें।
    4. सुनिश्चित करें कि लाइव एनटीएचआई परख के लिए उपयोग किया जाने वाला मीडिया किसी भी मानव सीरम से मुक्त है, क्योंकि यह बैक्टीरिया को मार देगा। पशु सीरम नमूने (जैसे, भ्रूण बछड़े का सीरम) आमतौर पर किसी भी समस्या का कारण नहीं बनते हैं।
      नोट: परिधीय रक्त, ब्रोंकोस्कोपी नमूने (विशेष रूप से ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज (बीएएल)), और फेफड़ों के ऊतकों जैसे मानक ऊतक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए नीचे वर्णित तरीकों का उपयोग करें। 10 मिनट से 24 घंटे या उससे अधिक तक हाय एंटीजन के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।

2. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फागोसाइटिक फ़ंक्शन का आकलन

नोट: इस परख को समाधान में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है और आमतौर पर पूरे रक्त में या बीएएल द्रव का उपयोग करके किया जाता है। इस परख को निष्क्रिय स्टेफिलोकोकस ऑरियस तैयारी और पैंसोर्बिन 17 के उपयोग के आधार पर पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित कियागया है। निष्क्रिय पूरे रक्त और निश्चित एच इन्फ्लूएंजा को पैंसोर्बिन17 के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है।

  1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 100 μg/mL पर प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) के साथ मारे गए, निष्क्रिय NTHI (1.2) को मिलाएं। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 450 x g पर, और फिर पीबीएस के 500 μL में धो लें। 5 मिनट के लिए 450 x g पर स्पिन करें और पीबीएस के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. 5 एमएल ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए एच इन्फ्लूएंजा लेबल वाले निष्क्रिय पीआई के 50 μL के साथ परिधीय रक्त (मानव विषय के वेनेपंक्चर से) के 450 μL को इनक्यूबेट करें।
  3. पानी के स्नान से नमूने निकालें और 5 μL डाइहाइड्रोरोडामाइन -1,2,3 (डीएचआर) जोड़ें। 10 सेकंड के लिए भंवर, और फिर इसे 10 मिनट के लिए पानी के स्नान में वापस रखें।
  4. पानी के स्नान से नमूने निकालें और एरिथ्रोसाइट्स (चरण 2.2 में ऊपर सूचीबद्ध मात्रा का 500 μL) को 0.8% अमोनियम क्लोराइड (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3, और 0.1 mM EDTA) के 10: 1 (यानी, 5 mL) के साथ लाइस करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, क्यू-प्रेप जैसे एक स्वचालित सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है।
  5. एक घंटे के भीतर प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने का विश्लेषण करें। प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने से न्यूनतम 3,000-5,000 कोशिकाओं (ब्याज के प्रत्येक उप-समूह से) का विश्लेषण करें (चित्रा 1)।
    1. फागोसाइटोसिस के लिए नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, लेबल किए गए बैक्टीरिया वाले कोशिकाओं के अनुपात को निर्धारित करें (फ्लोरोसेंट दाग वाली कोशिकाओं के अनुपात को मापें)।
    2. डीएचआर के ऑक्सीकरण द्वारा आरओएस की मात्रा निर्धारित करें, जिसके परिणामस्वरूप एक फ्लोरोसेंट सिग्नल होता है (औसत प्रतिदीप्ति में बदलाव की तुलना बेसलाइन और उत्तेजित नमूनों के बीच की जाती है)।
      नोट: न्यूट्रोफिल अधिक दानेदार होते हैं और इसमें अधिक साइड स्कैटर होता है, जबकि मैक्रोफेज बड़े होते हैं और इसमें अधिक आगे का फैलाव होता है।
    3. न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज को उनके आकार (मैक्रोफेज बड़े होते हैं) और ग्रैन्यूलैरिटी (न्यूट्रोफिल अधिक दानेदार होते हैं) द्वारा एक दूसरे से रूपात्मक रूप से अलग करें।
      नोट: न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के लिए विशिष्ट मार्करों का आमतौर पर उपयोग नहीं किया जाता है, हालांकि सीडी 14 का उपयोग रक्त मोनोसाइट्स को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग संभावित रूप से मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज (जैसे, एम 1 और एम 2 उपसमुच्चय) 18 के विभिन्न कार्यात्मक रूपों के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है।
  6. परख को उपयुक्त रूप से संशोधित करें (उदाहरण के लिए, फागोसाइट्स को उत्तेजित करने और डीएचआर दरार द्वारा आरओएस अभिव्यक्ति को मापने के लिए लाइव अनलेबल एनटीएचआई का उपयोग करें)।
    1. घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करें। घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए निर्दिष्ट बहुलक पर रक्त को परत करें और 30 मिनट के लिए 2300 x g पर घूमें। पिपेट का उपयोग करके मोनोन्यूक्लियर परत को हटा दें, इसे पीबीएस के साथ दो बार धोएं और पीबीएस में कोशिकाओं को 106 कोशिकाओं प्रति एमएल पर फिर से निलंबित करें।
    2. एक विकल्प के रूप में, बीएएल मैक्रोफेज का उपयोग करें।
    3. कल्चर मीडियम (आरपीएमआई) में 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज को निलंबित करें। चरण 1.3 में वर्णित 1 घंटे के लिए 100: 1 के एमओआई पर लाइव एनटीएचआई के साथ उन्हें संक्रमित करें।
    4. 10 मिनट के लिए चरण 2.3 में वर्णित निलंबन में डीएचआर जोड़ें। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके आरओएस के लिए विश्लेषण करें।

3. परिधीय रक्त में लिम्फोसाइट फ़ंक्शन का आकलन

  1. फ्लो साइटोमेट्री परख14 के लिए पूरे रक्त या मोनोन्यूक्लियर सेल की तैयारी का उपयोग करें।
  2. वेनेपंक्चर द्वारा प्रत्येक विषय से नमूने प्राप्त करें। लिथियम हेपरिन ट्यूब में एक परिधीय नस से 4 एमएल रक्त एकत्र करें और नियंत्रण और एंटीजन उत्तेजना के लिए नमूनों को एलिकोट में विभाजित करें।
  3. दोनों नमूनों में कोस्टिमुलेटरी एंटीबॉडी (एंटी-सीडी 28 और सीडी 49 डी, 1 μL / mL) जोड़ें। एंटीजन नमूने में एनटीएचआई जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। मारे गए एनटीएचआई तैयारी के लिए, 2 एमएल रक्त में एंटीजन के 200 μL जोड़ें। लाइव एनटीएचआई के लिए, सफेद कोशिकाओं (हेमोसाइटोमीटर द्वारा मापा गया) में 100: 1 के एमओआई पर जीवित एनटीएचआई कोशिकाओं को जोड़ें।
  4. गोल्गी-ब्लॉकिंग एजेंट ब्रेफेल्डिन ए (10 μL / mL) को नमूनों में जोड़ें और उन्हें 5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: गोल्गी तंत्र को अवरुद्ध करना साइटोकिन्स को सेल के बाहर निर्यात करने से रोकता है।
  5. यदि पूरे रक्त का उपयोग किया जाता है, तो समाधान में केवल ल्यूकोसाइट्स छोड़ने के लिए एरिथ्रोसाइट्स को 0.8% अमोनियम क्लोराइड (चरण 2.4) के साथ लाइस करें। 1 घंटे के लिए 1% -2% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 μL का उपयोग करके ल्यूकोसाइट्स को ठीक करें।
  6. हेमोसाइटोमीटर द्वारा कोशिकाओं की गणना करें, 15 मिनट के लिए 0.1% सैपोनिन के 100 μL के साथ 106 कोशिकाओं को प्रतिस्थापित करें और फ्लोरोसेंट-लेबल एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को धोएं और प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट-लेबल एंटीबॉडी की मात्रा प्रत्येक साइटोकिन के लिए विशिष्ट होगी। निर्माताओं के निर्देशों का पालन करें। आमतौर पर, 100 μL समाधान में 106 कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए दाग दिया जाएगा। अधिकांश व्यावसायिक रूप से प्राप्त एंटीबॉडी 25-100 परीक्षण करने के लिए पर्याप्त होंगे।
  7. प्रासंगिक लिम्फोसाइट आबादी (कोशिकाओं को सीडी 45 द्वारा गेट किया जाता है, फिर सीडी 3, और बाद में सीडी 4 या सीडी 8 अभिव्यक्ति द्वारा) को गेट करके एंटीजन प्रतिक्रिया कोशिकाओं का अनुपात निर्धारित करें जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। विश्लेषण किए जाने वाले सभी साइटोकिन्स के लिए गैर-उत्तेजित कोशिकाओं पर पृष्ठभूमि धुंधला करें। उत्तेजित कोशिकाओं और नियंत्रण दोनों के लिए प्रत्येक साइटोकिन का विश्लेषण करने के लिए 100,000 कोशिकाओं को स्क्रीन करें।

4. फेफड़ों के ऊतकों में लिम्फोसाइट फ़ंक्शन / भड़काऊ मध्यस्थों का आकलन

  1. ब्रोंकोस्कोपी से पर्याप्त लिम्फोसाइट्स प्राप्त करना आमतौर पर संभव नहीं है; इसलिए, लोबेक्टोमी नमूनों से फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करें। फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों के अनुकूलन के लिए शारीरिक विकृति सेवा के साथ घनिष्ठ संपर्क की आवश्यकता होती है। सुनिश्चित करें कि ऊतक में ट्यूमर से कम से कम 3 सेमी का मार्जिन है और महत्वपूर्ण वातस्फीति के बिना सेलुलर ऊतक है (जैसा कि रोगविज्ञानी द्वारा निर्धारित किया गया है)।
  2. प्रवाह साइटोमेट्री परख के लिए उपयोग किए जाने से पहले फेफड़ों के ऊतकों को सेलुलर निलंबन में तोड़ दें। फेफड़ों के ऊतकों को रासायनिक रूप से पचाएं (उदाहरण के लिए, कोलेजनेज के साथ) या इसे यांत्रिक रूप से अलग करें।
    नोट: ऊतक के यांत्रिक विघटन को प्राथमिकता दी जा सकती है क्योंकि यह कोशिकाओं की बेहतर सतह धुंधलापन (जैसे, सीडी 3/4 लेबलिंग) के साथ जुड़ा हुआ है।
    1. एक रोगविज्ञानी से लोबेक्टोमी नमूने प्राप्त करें (आमतौर पर फेफड़ों के कैंसर के इलाज से गुजरने वाले रोगियों से प्राप्त)। नमूने के लगभग 20-40 ग्राम को 3-5 मिमी3 वर्गों में स्लाइस करें। एक उपयुक्त डिसएग्रीगेटर का उपयोग करके यांत्रिक रूप से खंडित होने से पहले उन्हें बाँझ 50 μL कक्ष के अंदर रखें।
    2. ऊतक विघटन के बाद, चरण2.4में उल्लिखित 0.8% एनएच 4 सीएल के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करें।
    3. बाँझ आरपीएमआई में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (मात्रा सेल संख्या पर निर्भर करेगी और आम तौर पर 10-20 एमएल है), और फिर उन्हें 100 μm बाँझ नायलॉन जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  3. एनटीएचआई संक्रमण परख
    1. फेफड़ों की कोशिकाओं को 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल प्रति ट्यूब (नियंत्रण और उत्तेजित नमूने) की अंतिम कोशिका एकाग्रता में पुन: निलंबित करें।
    2. (नकारात्मक) नियंत्रण ट्यूब के लिए आरपीएमआई के 1 एमएल में 4 x 106-6 x 10 6 कोशिकाओं के निलंबन का उपयोग करें। एनटीएचआई ट्यूब के लिए समान राशि का उपयोग करें (किसी भी अतिरिक्त नमूने का उपयोग एसईबी के साथ सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है)। प्रति सेल 100 बैक्टीरिया के एमओआई पर एनटीएचआई ट्यूब में कोशिकाओं को संक्रमित करें। ट्यूबों में गैस हस्तांतरण की अनुमति देने के लिए टोपी को आधा रोटेशन ढीला करें।
    3. कोशिकाओं को एक ट्यूब रोटेटर में रखें और उन्हें 12 आरपीएम पर घूमते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. साइटोकिन्स के बाह्य निर्यात को रोकने के लिए, उत्तेजना के 1 घंटे बाद सेल निलंबन में 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए एक गोल्गी ब्लॉकर (ब्रेफेल्डिन ए) जोड़ें। रोटेशन (चरण 4.3.3) पर इनक्यूबेशन 16-22 घंटे के लिए सेल निलंबन वापस करें।
    5. सेल सस्पेंशन को 500 μL PBS के साथ धोएं जिसमें 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.01% NaN3 शामिल हैं। क्रमशः चरण 3.5 और चरण 3.6 में वर्णित कोशिकाओं को ठीक और स्थिर करें।
    6. इंट्रासेल्युलर साइटोकिन स्टेनिंग के लिए एंटीबॉडी जोड़ें (एंटीबॉडी की पसंद अन्वेषक द्वारा निर्धारित की जानी है, जैसा कि चरण 3.6 में नोट में सूचीबद्ध है)। विशिष्ट मानव लिम्फोसाइट सेल-सतह मार्करों (जैसे, सीडी 45, सीडी 3, आदि) के लिए सेल निलंबन को 1 घंटे के लिए दाग दें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, चरण 3.5-3.6 में वर्णित के रूप में उन्हें ठीक करें और उन्हें स्थिर करें।
    7. इंट्रासेल्युलर साइटोकिन स्टेनिंग एंटीबॉडी (जैसे, आईएफएन-γ और टीएनएफ-α या आईएल -13 और आईएल -17 ए) के साथ कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: पहले सतह मार्करों को दागने की सिफारिश की जाती है, फिर इंट्रासेल्युलर निर्धारण के रूप में सतह प्रोटीन में विरूपण परिवर्तन हो सकता है जिसमें एंटीबॉडी बंधते हैं।
    8. कोशिकाओं को पीबीएस के 500 μL के साथ धोएं और प्रवाह साइटोमीटर पर डेटा अधिग्रहण से पहले पीबीएस के 100 μL में पुन: निलंबित करें।
  4. चरण 3.2 में वर्णित सुपरनैटेंट का विश्लेषण करने के लिए संयोजन के रूप में एक मोती सरणी परख का उपयोग किया जा सकता है (ब्रेफेल्डिन ए के बिना इसे निष्पादित करें)। यह विभिन्न भड़काऊ मध्यस्थों (संभावित रूप से 40-50 मध्यस्थों तक) की एक विस्तृत विविधता के विश्लेषण की अनुमति देता है। सतह पर तैरने वाले को 100 μL एलिकोट में इकट्ठा करें और विश्लेषण के लिए तैयार होने तक -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, कोई मल्टीप्लेक्स केमिलुमिनेसेंट एसेस20 का उपयोग कर सकता है।
    1. पिघले हुए नमूनों का विश्लेषण करने के लिए मल्टीप्लेक्स बीड सरणी का उपयोग करें। निर्माता के निर्देशों के बाद साइटोकिन उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए संग्रहीत सुपरनैटेंट का उपयोग करें।
    2. प्रवाह साइटोमीटर पर मल्टीप्लेक्स बीड सरणी का अधिग्रहण करें। डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण करने के लिए प्रासंगिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
      नोट: यह मोती सरणी परख परिधीय रक्त और / या बीएएल नमूनों से सतह पर तैरने वाले पर भी किया जा सकता है।

5. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा फेफड़ों के प्रोटियोलिसिस का आकलन

नोट: फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मानार्थ है और इसका उपयोग प्रोटीज और आरओएस भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। एनईटी और एमईटी जैसे एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप अन्य भड़काऊ मध्यस्थों के साथ बाह्य क्रोमैटिन (डीएनए) से बने होते हैं, विशेष रूप से प्रोटीज जैसे न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस (एमएमपी)। उन्हें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बीएएल और फेफड़ों के ऊतकों में मूल्यांकन किया जा सकता है, और यह पहले शर्मा, आर एट अल 21 द्वारा वर्णित किया गया है।

  1. फेफड़ों के ऊतकों में प्रत्यक्ष प्रोटीज अभिव्यक्ति का आकलन करें (जैसा कि चरण 4.2.1 में वर्णित है) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और सीटू ज़िमोग्राफी15,17 का उपयोग करके।
    1. या तो ताजा या जमे हुए अनिर्धारित फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करें। सुपरफ्रॉस्ट/आसंजन स्लाइड्स पर 4 μm की मोटाई तक काटे गए अनुभागों को माउंट करें। 5 मिनट के लिए 1x प्रतिक्रिया बफर में अनुभागों को पूर्व-गर्म करें।
    2. मेटालोप्रोटीनेस की कार्रवाई के माध्यम से प्रोटियोलिसिस को मापने के लिए सीधे अलग-अलग स्लाइड्स पर फ्लोरेसिन-लेबल जिलेटिन सब्सट्रेट (30 μg / mL प्रति अनुभाग) जोड़ें।
    3. स्लाइड्स को क्षैतिज स्थिति में रखें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हल्के-संरक्षित, ह्यूमिडिफ़ायर चैंबर में इनक्यूबेट करें।
    4. चढ़ने से पहले 1x प्रतिक्रिया बफर में अनुभागों को कुल्ला करें।
    5. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, खंडों में फ्लोरोसेंट जिलेटिन के बिना केवल प्रतिक्रिया बफर जोड़ें।
    6. परीक्षा द्वारा सब्सट्रेट के लाइसिस की परख करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रोटियोलिसिस के सबूत के साथ फेफड़े के क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए इमेजजे का उपयोग करें। इसके लिए, फेफड़ों के क्षेत्र को मापें जिसमें बुझे हुए नमूने की पृष्ठभूमि के ऊपर धुंधलापन है। एक अन्य नियंत्रण के रूप में, बिना फ्लोरोसेंट जिलेटिन के फेफड़ों केऊतकों का उपयोग करें।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए न्यूनतम 10 उच्च शक्ति क्षेत्रों (एफओवी) पर यह निष्पादित करें।
  2. 3-नाइट्रोटायरोसिन (एक विषाक्त ऑक्सीडेटिव तनाव उत्पाद) 13 के लिए विकृति द्वारा फेफड़ों के ऊतकों में बाह्य आरओएस अभिव्यक्ति को मापें।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि एनटीएचआई के लिए भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन / मात्रा प्रवाह साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कैसे किया जा सकता है। परिणामों की व्याख्या का एक महत्वपूर्ण हिस्सा नियंत्रण और उत्तेजित नमूनों के बीच प्रतिदीप्ति में तुलना है। नमूनों के धुंधलापन को अनुकूलित करने के लिए आमतौर पर कई प्रारंभिक प्रयोगों की आवश्यकता होती है। एक साथ कितने अलग-अलग रंगों की जांच की जा सकती है, यह प्रवाह साइटोमीटर / कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध चैनलों की संख्या पर निर्भर करेगा। परिणाम 1) आरओएस उत्पादन, 2) मानव फेफड़ों के ऊतकों के इंट्रासेल्युलर साइटोकिन धुंधला होने, और 3) फेफड़ों के प्रोटियोलिसिस को मापने के लिए सीटू ज़िमोग्राफी में मूल्यांकन के लिए दिखाए गए हैं।

चित्र 1 मोनोसाइट्स द्वारा आरओएस उत्पादन का प्रतिनिधित्व दिखाता है। आरओएस का माप प्रतिदीप्ति का उत्पादन करने के लिए डीएचआर 123 के ऑक्सीकरण द्वारा होता है। कोशिकाओं को गेट किया जाता है, और उनकी औसत प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। उत्तेजित नमूने की औसत प्रतिदीप्ति की तुलना नियंत्रण से की जाती है।

चित्रा 2 मानव फेफड़ों के ऊतकों से प्राप्त लिम्फोसाइटों द्वारा साइटोकिन्स के इंट्रासेल्युलर उत्पादन को दर्शाता है। भड़काऊ मध्यस्थ उत्पादन का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री परख किए जाने से पहले फेफड़ों के ऊतकों को एकल-कोशिका निलंबन में तोड़ने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, लिम्फोसाइटों द्वारा साइटोकिन उत्पादन। फेफड़ों के ऊतकों को यांत्रिक रूप से तोड़ा जा सकता है या रासायनिक रूप से पचाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कोलेजनेज द्वारा। यांत्रिक टूटने के तरीके बेहतर परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं, विशेष रूप से सेल सतह धुंधला (जैसे, सीडी 3 और सीडी 4) को बनाए रखने के संदर्भ में। मलबे को बाहर करने के लिए नमूनों की फ़िल्टरिंग महत्वपूर्ण है जो विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकती है।

चित्रा 3 प्रोटीज गतिविधि की अभिव्यक्ति को दर्शाता है जैसा कि सीटू ज़िमोग्राफी द्वारा मापा जाता है। प्रोटीज गतिविधि का आकलन करने के लिए अनिर्धारित ऊतक का उपयोग किया जाता है। ये नमूने आमतौर पर विश्लेषण तक -70 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होते हैं। ऊतक का क्षेत्र जिसमें प्रोटीज प्रतिदीप्ति होती है, मापा जाता है, और परिणामों की तुलना नियंत्रण और उत्तेजित नमूनों के बीच की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: मोनोसाइट्स द्वारा आरओएस उत्पादन। (ए) पैनल परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के लिए गेटिंग रणनीति दिखाता है, जिसमें फागोसाइट आबादी को परिभाषित करने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर और साइड स्कैटर का उपयोग किया जाता है। पैनल (बी) में, फागोसाइट आबादी को मोनोसाइट्स को लेबल करने के लिए सीडी 14 अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है। इस मोनोसाइट आबादी का विश्लेषण नियंत्रण (सी) और उत्तेजित नमूने (डी) में डीएचआर प्रतिदीप्ति के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फेफड़ों के ऊतकों में साइटोकिन उत्पादन। कोशिकाओं को पहले प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ल्यूकोसाइट मार्कर सीडी 45 (ए) की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जाता है। इस आबादी को फिर सीडी 3 अभिव्यक्ति (बी) और सीडी 4 / सीडी 8 अभिव्यक्ति (सी) के लिए आगे विश्लेषण किया जाता है। सीडी 3 / सीडी 4 + कोशिकाओं का मूल्यांकन नियंत्रण (डी) और एनटीएचआई-उत्तेजित नमूने (ई) में इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीटू ज़िमोग्राफी में फेफड़े। पैनल (ए) फेफड़ों के ऊतकों के वर्गों में क्रोमैटिन / डीएपीआई की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। पैनल (बी) फ्लोरोसेंट धुंधला दिखाता है, जो एमएमपी गतिविधि की उपस्थिति का संकेत देता है। पैनल (सी) विलय की गई छवि दिखाता है जो दर्शाता है कि एमएमपी गतिविधि क्रोमैटिन की अभिव्यक्ति के साथ सह-स्थानीयकृत भी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां सूचीबद्ध विधियां फ्लोरेसेंस-आधारित फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करती हैं जिनका उपयोग हाय के लिए भड़काऊ फेफड़ों की प्रतिक्रिया के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

उपयोग किए जाने वाले हाय के उपयुक्त एंटीजेनिक फॉर्मूलेशन की स्थापना महत्वपूर्ण है, और इस संबंध में माइक्रोबायोलॉजिस्ट से विशिष्ट इनपुट लेना उचित है। लाइव हाय एक मजबूत प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, जबकि मारे गए हाय तैयारी और हाय घटक अधिक मानकीकृत होते हैं और स्टोर करना आसान होता है। पीआई केवल मृत बैक्टीरिया22 लेबल करेगा; अन्य रंगों जैसे कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सक्सिनिमिडिलेस्टर (सीएफएसई) का उपयोग फागोसाइटोसिस परख23 के लिए जीवित बैक्टीरिया को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। उपयुक्त एंटीजन को अनुकूलित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों की एक श्रृंखला की जानी चाहिए। लाइव एनटीएचआई का उपयोग करने के लिए, 100: 1 का एमओआई इष्टतम है; एक कम एमओआई एक स्पष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं कर सकता है, जबकि एक उच्च एमओआई कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है। हालांकि, एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उपयोगी जानकारी दे सकता है और बहुत मूल्यवान हो सकता है, खासकर तकनीक24 के प्रारंभिक अनुकूलन के साथ। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, निष्क्रिय स्टेफिलोकोकस ऑरियस एंटीजन के व्यावसायिक रूप से प्राप्त रूप का उपयोग किया जा सकता है, जिसे आरओएस / फागोसाइटोसिस परख के लिए ऊपर के रूप में पीआई के साथ भी लेबल किया गया है। टी सेल परख के लिए, स्टेफिलोकोकल सुपरएंटीजन ई (एसईबी) के साथ उत्तेजना का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण19,25 के रूप में किया जा सकता है।

बीएएल और / या फेफड़ों के ऊतकों के नमूने प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से स्थापित करने की आवश्यकता है। बीएएल नमूने विभिन्न ऑपरेटरों के बीच काफी परिवर्तनशील हो सकते हैं। दाएं मध्य लोब लैवेज के लिए एक हाथ से पकड़ी जाने वाली सिरिंजअच्छे परिणाम उत्पन्न करती है। लोबेक्टोमी नमूनों से फेफड़ों के ऊतकों का नमूना प्राप्त करने के लिए एक रोगविज्ञानी के साथ सहयोग की स्थापना की आवश्यकता होती है। फेफड़ों के ऊतकों के नमूने में ट्यूमर से कुछ मार्जिन होना चाहिए (आदर्श रूप से कम से कम 3-4 सेमी)। बड़े नमूने (जैसे, कम से कम 25-50 ग्राम) अधिक कोशिकाओं का उत्पादन करेंगे, साथ ही नमूने जो स्पष्ट वातस्फीति के बिना अधिक समीपस्थ हैं। फेफड़ों के ऊतकों का यांत्रिक विघटन समय लेने वाला होता है और आम तौर पर प्रत्येक नमूने19,27 के लिए कम से कम 2-3 घंटे लगेंगे।

फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए विभिन्न फ्लोरोफोरे के धुंधलापन को अनुकूलित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग किए जाने चाहिए। जिन क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित किया जाना है उनमें व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए सर्वोत्तम धुंधला पैनल की पहचान करना, धुंधला/संकेंद्रण और कोशिकाओं/ऊतकों का उपचार शामिलहै। फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग रक्त या बीएएल जैसे अन्य द्रव नमूनों की तुलना में अधिक ऊतक मलबे से जुड़ा हो सकता है, और इसका प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विभिन्न सेलुलर आबादी के भेदभाव पर कुछ प्रभाव पड़ सकता है। एंटीबॉडी का उचित विकल्प प्रारंभिक प्रयोगों में निर्धारित और अनुकूलित करने की आवश्यकता है। लिम्फोसाइटों की सतह लेबलिंग के लिए, एंटी-सीडी 3 और सीडी 4 का उपयोग टी हेल्पर कोशिकाओं के लिए, एंटी-सीडी 3 और सीडी 8 साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं के लिए और एंटी-सीडी 3 और सीडी 56 एनके कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है। अध्ययन किए जाने वाले इंट्रासेल्युलर साइटोकिन्स की पसंद रुचि के मध्यस्थों और मापदंडों / रंगों की संख्या पर निर्भर करती है जिनका विश्लेषण प्रवाह साइटोमीटर29 पर किया जा सकता है। फेफड़ों के ऊतकों में मैक्रोफेज के साथ काम करने की एक विशिष्ट चुनौती उनके उच्च स्तर की ऑटोफ्लोरेसेंस30 है; इस समस्या को पृष्ठभूमि नियंत्रण के साथ उत्तेजित कोशिकाओं की तुलना करके और प्रोटीज और हिस्टोन जैसे सूजन के लिए विशिष्ट मार्करों को जोड़कर निपटा जा सकता है।

इन तकनीकों की एक सीमा प्रयोगों को करने के लिए उचित रूप से प्रशिक्षित और कुशल कर्मचारियों की आवश्यकता है। अच्छी तरह से स्थापित प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी सुविधाओं की भी आवश्यकता है। मानव ऊतक के नमूनों का उपयोग विशेष रूप से फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करते समय महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता से जुड़ा हुआ है; इसके लिए परख को अनुकूलित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों की एक श्रृंखला की आवश्यकता हो सकती है (विशेष रूप से पृष्ठभूमि धुंधला होने के मुद्दों के साथ)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस काम के साथ उनकी सहायता के लिए मोनाश हेल्थ में क्लिनिकल इम्यूनोलॉजी के कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

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References

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Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

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