Um protocolo para bypass gástrico Roux-en-Y em ratos usando grampos lineares

Resumo

O bypass gástrico Roux-en-Y (RYGB) é realizado para tratar obesidade e diabetes. No entanto, os mecanismos subjacentes à eficácia do RYGB não são totalmente compreendidos, e os estudos são limitados pela dificuldade técnica que leva à alta mortalidade em modelos animais. Este artigo fornece instruções sobre como executar RYGB em ratos com altas taxas de sucesso.

Resumo

O bypass gástrico Roux-en-Y (RYGB) é comumente realizado para o tratamento de obesidade grave e diabetes tipo 2. No entanto, o mecanismo de perda de peso e mudanças metabólicas não são bem compreendidos. Acredita-se que múltiplos fatores desempenham um papel, incluindo redução da ingestão calórica, diminuição da absorção de nutrientes, aumento da saciedade, liberação de hormônios promotores da saciedade, mudanças no metabolismo do ácido biliar e alterações na microbiota intestinal.

O modelo RYGB de ratos apresenta uma estrutura ideal para estudar esses mecanismos. Trabalhos anteriores em modelos de camundongos tiveram altas taxas de mortalidade, variando de 17 a 52%, limitando sua adoção. Modelos de ratos demonstram mais reserva fisiológica ao estímulo cirúrgico e são tecnicamente mais fáceis de adotar, pois permitem o uso de grampeadores cirúrgicos. Um desafio com os grampeadores cirúrgicos, no entanto, é que eles muitas vezes deixam uma grande bolsa gástrica que não é representativa do RYGB em humanos.

Neste protocolo, apresentamos um protocolo RYGB em ratos que resultam em uma pequena bolsa gástrica usando grampeadores cirúrgicos. Utilizando dois incêndios grampeador que removem oomaca florestal do rato, obtemos uma bolsa gástrica menor semelhante à que segue um típico RYGB humano. O grampeamento cirúrgico também resulta em melhor hemostasia do que divisão afiada. Além disso, o forestomach do rato não contém glândulas e sua remoção não deve alterar a fisiologia do RYGB.

A perda de peso e as alterações metabólicas na coorte RYGB foram significativas em comparação com a coorte falsa, com tolerância significativamente menor à glicose em 14 semanas. Além disso, este protocolo tem uma excelente sobrevida de 88,9% após o RYGB. As habilidades descritas neste protocolo podem ser adquiridas sem experiência microcirúrgica prévia. Uma vez dominado, este procedimento fornecerá uma ferramenta reprodutível para estudar os mecanismos e efeitos do RYGB.

Introdução

A obesidade e o diabetes tipo 2 tornaram-se epidemias mundiais¹. Embora a perda de peso médico possa melhorar o diabetes em pacientes, aqueles com diabetes grave se beneficiam mais da cirurgia bariátrica. A cirurgia bariátrica tem se mostrado segura e eficaz na perda de peso e na melhoria ou cura do diabetes tipo^{2 ,3}, mesmo naqueles com doença de longa data⁴. Procedimentos bariátricos metabólicos, como a atual cirurgia de bypass gástrico Roux-en-Y (RYGB), induzem melhorias rápidas e sustentadas na homeostase de glicose, ao mesmo tempo em que reduzem a necessidade de medicamentos diabéticos^5,6,7.

Após o RYGB, a melhora da homeostase da glicose ocorre rapidamente e é independente da perda de peso⁸. Duas teorias importantes foram propostas para explicar as mudanças metabólicas associadas à remissão do diabetes que ocorrem após a cirurgia metabólica. Primeiro, a hipótese hindgut postula que, após o bypass, maiores concentrações de nutrientes não digeridos atingem o intestino distal aumentando a liberação de hormônios como o GLP-1. Por outro lado, a hipótese do foregut sugere que contornar o intestino proximal reduz a secreção de hormônios anti-incretina. Ambos os efeitos podem levar à melhora precoce do metabolismo da glicose⁹.

Modelos animais têm o potencial de ser uma ferramenta poderosa para estudar esses mecanismos. No entanto, uma grande barreira na utilização de modelos de ratos ou ratos é a dificuldade técnica na realização desses procedimentos. A maioria dos estudos tem se apoiado nos modelos de ratos ou ratos^10,11,12. Os modelos de mouse têm sido difíceis, pois o estômago do mouse é muito pequeno para usar dispositivos grampeador¹¹, e as taxas de mortalidade são inaceitáveis, variando de 17 a 52%¹³. Em ratos, alguns protocolos permanecem tecnicamente difíceis de realizar devido à complexa ligadura de vasos gástricos antes de dividir o estômago^12,14. Outros modelos dividem o estômago usando um grampeador, mas deixam uma bolsa grande não consistente com a anatomia humana pós RYGB¹¹. Neste modelo, fornecemos instruções detalhadas sobre como executar RYGB usando grampeadores lineares em um modelo de rato resultando em uma bolsa gástrica mais de acordo com a anatomia humana. No geral, este procedimento foi associado a excelentes taxas de sobrevivência e desfechos metabólicos.

Protocolo

Os protocolos de uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da Universidade de Alberta (AUP00003000). Consulte a Figura 1 para um diagrama demonstrando a anatomia RYGB.

1. Bypass gástrico Roux-en-Y

1. Preparação de animais e configuração operacional
   1. Uma semana antes da cirurgia, forneça aos ratos terapia de reidratação oral e dieta líquida, além de sua dieta sólida e água para aclimatá-los a esta nova dieta.
   2. Ratos rápidos com acesso apenas à água por 12-18 h antes da cirurgia.
      1. Certifique-se de que os ratos estão em jejum em uma plataforma de fio elevada para que eles não possam consumir material de cama.
   3. Injete ratos com buprenorfina longa subcutânea (RS) a uma dose de 1 mg/kg imediatamente antes da cirurgia.
   4. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, toalhas e cortinas.
   5. Limpe a superfície de operação, a almofada de aquecimento e o cone do nariz anestésico com 70% de etanol.
   6. Configure a superfície de operação com um microscópio operacional, máquina anestésica e suprimentos de uma maneira ergonômica para o cirurgião operacional.
   7. Use uma almofada de aquecimento regulada pela temperatura e estafina para 37 °C.
   8. Coloque uma cortina estéril ou toalha sobre a almofada de aquecimento.
   9. Encha um tubo cônico estéril de 50 mL com 0,9% de soro fisiológico.
2. Indução e preparação anestésicos
   1. Induzir anestesia utilizando 4% de isoflurane conforme protocolos previamente estabelecidos¹⁵.
   2. Aplique pressão no pé traseiro dos quatro membros para garantir que não haja resposta à dor.
   3. Verifique se há anestesia adequada e taxa respiratória após cada 5 minutos.
   4. Aplique lubrificante em ambos os olhos para evitar a secagem.
   5. Raspar o cabelo do abdômen.
   6. Limpe o abdômen com uma solução povidone-iodo. Deixe a solução secar e se transforme em luvas estéreis.
   7. Drape o rato com uma abertura na cortina para expor o abdômen.
   8. Coloque instrumentos, suturas, cotonetes de algodão e uma seringa de 10 mL em um local que permita fácil acesso durante o procedimento.
3. Laparotomia mediana
   1. Faça uma incisão de 3 cm na linha média superior do abdômen usando um bisturi, logo abaixo do processo xifoide como um marco.
   2. Usando tesoura, divida a fáscia e o peritônio, com o cuidado de ficar na linha média na linha alba para reduzir o sangramento do reto abdominus. Se houver sangramento, controle-o com térmica ou eletrocauteria.
4. Mobilizando o estômago
   1. Usando dois cotonetes de algodão molhado, disseco sem rodeios os acessórios gástricos.
   2. Ao encontrar aderências densas, use cautery térmico para dividir os acessórios gástricos com cuidado para evitar cauterizar o estômago. Divida bruscamente o ligamento entre o estômago e o lobo hepático acessório para reduzir o risco de ruptura hepática com mobilização estomacal.
   3. Para vasos sanguíneos maiores, especialmente nas artérias gástricas curtas, ligadura usando sutura de polipropileno 6-0.
   4. Crie uma janela no lado distal direito do esôfago, mas proximal à artéria gástrica esquerda. Certifique-se de que um cotonete pode alcançar esta área posteriormente. O estômago é adequadamente mobilizado quando pode ser exteriorizado fora do abdômen.
5. Identifique e divida o jejunum
   1. Identifique o ligamento de Treitz seguindo o jejunum proximally até observá-lo é apego ao mesocólon transversal.
   2. Meça 7 cm distally, identifique um local entre vasos mesenéricos e divida o intestino com micro tesoura. Evite as manchas de Peyer ao dividir o intestino. Tome cuidado para dividir apenas o intestino e não o mesentery.
   3. Coloque uma esponja limpa e salina encharcada antes de dividir o intestino para minimizar a contaminação.
   4. Verifique a presença de um pequeno navio de travessia na mesenteria na borda do intestino delgado e divida isso com cauteria para evitar sangramento.
   5. Continue a dividir o mesentery 1 cm em direção à base mesentérica.
   6. Identifique o jejunum proximal e distal. Coloque o jejunum proximal sob uma gaze molhada à direita do rato e o jejunum distal à esquerda do rato.
6. Grampeando o estômago
   1. Insira um grampeador linear de 45 mm com altura de grampo de 3,5 mm através da linha branca do forestomach para criar uma bolsa menor. Espere por 10 s antes de disparar o grampeador.
   2. Coloque a pressão usando gaze nas linhas de grampo por 1 minuto para garantir hemostasia. Se a hemostasia não for alcançada apenas com pressão, o sangramento ao longo da linha de grampo é overdelo usando 6-0 figura de polipropileno de oito suturas.
   3. Realize um segundo fogo básico através do estômago na janela criada anteriormente. Espere por 10 s antes de disparar o grampeador. A pressão é mantida ao longo da linha de grampo para garantir a hemostasia, e pode ser necessário ovais.
7. Gastrojejunostomia
   1. Faça uma gastrotomia imediatamente depois de grampear o estômago. Atrasos nisso podem causar distensão gástrica e aspiração, pois o estômago é descontínuo após o segundo grampo gástrico.
   2. Usando um bisturi de 11 lâminas, crie uma gastrotomia na bolsa distal. Expresse conteúdo gástrico através da gastrotomia. Isso é importante para evitar a distensão gástrica e a aspiração. Alonge esta gastrotomia usando micro tesoura para aproximadamente 5 mm. A gastrotomia é feita grande o suficiente para a ponta do cotonete de algodão só para caber.
   3. Mobilize a extremidade distal do jejunum adjacente à gastrotomia e coloque de tal forma que a mesenteria não seja torcida.
   4. Enquanto sutura a anastomose, certifique-se de que o intestino seja mantido úmido, cobrindo-o com gaze salina e reaplicando salino regularmente.
   5. Usando 6-0 polidioxina ou sutura de polipropileno, coloque uma sutura de permanência na margem inferior da anastomose e retraia suavemente usando um estalo. Amarre com três nós.
   6. Coloque uma sutura de permanência na margem superior da anastomose e retraia suavemente usando um estalo. Amarre com seis nós.
   7. Suturar o lado anterior da anastomose de forma contínua, levando mordidas de 1 mm de largura e 1 mm de distância com cuidado para evitar tomar o traseiro.
   8. Uma vez que a sutura tenha atingido a sutura inferior, amarre-as com mais seis nós.
   9. Uma vez que o lado anterior esteja completo, vire o intestino e o estômago e passe a sutura inferior através do defeito mesentérico. Reaplique o snap e retraia-se inferiormente.
   10. Para o lado posterior da anastomose, coloque a espessura total interrompida 6-0 suturas, 1 mm de largura e espaçada 1 mm de distância, com cuidado para evitar tomar o traseiro. Estes estão empatados com seis nós cada.
       NOTA: O lado anterior da anastomose é suturado de forma contínua, enquanto o lado posterior é feito de forma interrompida. Isso evita uma restrição potencial ou estenose associada a um fechamento circunferencial contínuo.
   11. Verifique se há vazamento empurrando suavemente conteúdo luminal através da anastomose. Se houver áreas com vazamento, reforce-as cuidadosamente com suturas interrompidas. Tome cuidado para evitar tomar a parede de trás ao reforçar com suturas extras.
8. Jejunojejunostomia
   1. Da gastrojejunostomia, meça 20 cm distally.
   2. Crie uma jejunotomia no lado antimesenteric usando o bisturi de 11 lâminas. Evite fazer a jejunotomia sobre as manchas de Peyer.
   3. Este jejunotomia usando micro tesoura, de tal forma que é do mesmo tamanho do membro biliopancreatic. Certifique-se de que um cotonete só se encaixa dentro.
   4. Coloque o membro biliopancreatic de tal forma que não haja torção da mesenteria.
   5. Realize a anastomose de forma semelhante à gastrojejunostomia com suturas de 6-0 nos lados superior e inferior. O lado anterior é realizado com suturas contínuas, enquanto o lado posterior é realizado com suturas interrompidas.
   6. Certifique-se de que o intestino está úmido com soro fisiológico durante esta anastomose.
   7. Verifique se há vazamentos empurrando suavemente o conteúdo luminal através da anastomose. Se houver áreas com vazamento, reforce-as com suturas interrompidas.
9. Reposicione o intestino e o estômago
   1. Certifique-se de que não há torção da bolsa, estômago remanescente ou fígado. Certifique-se de que o lobo esquerdo do fígado é anterior ao estômago e não preso atrás da bolsa, pois isso pode causar isquemia hepática compressiva.
   2. Posicione o intestino no abdômen em sua posição natural de tal forma que não haja torção.
10. Fechamento abdominal
    1. Feche a fáscia com poliglactina 3-0 de forma contínua. Também pode ser utilizado 3-0 polidioxina.
    2. Feche a pele com 2-0 de seda de forma contínua.
11. Emergência anestésico
    1. Diminua o isoflurane para zero, mas continue o oxigênio suplementar.
    2. Administre um anestésico local como um bloco de respingos na incisão.
    3. Administre 10 mL de dextrose subcutânea de 5% em soro fisiológico normal (D5NS) no tecido subcutâneo atrás do pescoço.
    4. Coloque uma coleira de rato elizabetano antes que o rato esteja totalmente acordado. Tome cuidado para encaixá-lo snugly, mas não muito apertado para causar desconforto.
       NOTA: A coleira é mantida até o dia 5 para evitar a deshiscência da ferida.

2. Cirurgia falsa

NOTA: A cirurgia falsa é realizada semelhante ao RYGB, no entanto, não são realizadas anastomosas.

1. Uma gastrotomia é criada e depois fechada com 6-0 polidioxina ou suturas de polipropileno.
2. Uma jejunotomia é criada 7 cm distal no ligamento de Treitz e depois fechada com 6-0 polidioxina ou suturas de polipropileno.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Cuidados pós-operatórios
   1. Abrigar ratos individualmente e mantê-los em plataformas de arame elevado até que alimentos sólidos sejam reintroduzidos para evitar o consumo de roupas de cama e obstrução luminal.
      NOTA: A dieta pós-operatória é retomada gradualmente, pois o edema na gastrojejunostomia pode causar obstrução com a retomada precoce da dieta sólida.
   2. Inspecione os pés diariamente enquanto os ratos estão em plataformas de arame elevado para quaisquer alterações de pele.
   3. Mantenha os ratos na água e dieta de terapia de reidratação oral durante as primeiras 72 horas.
   4. Administre 10 mL de D5NS a cada 12 h para as primeiras 72 h.
   5. Administre buprenorfina de ação curta subcutânea a 0,01 mg/kg se os ratos parecerem estar com dor. A Escala de Careta de Ratos é usada para avaliar a dor¹⁶.
   6. No pós-operatório 3, adicione dieta líquida de roedores. Continue fornecendo água e terapia de reidratação oral.
   7. No pós-operatório 5, reinicie a dieta rica em gordura. Continue fornecendo água e dieta líquida. Remova a coleira elizabetano.
   8. No pós-operatório 7, descontinuar a dieta líquida.
   9. Remova as suturas da pele no pós-operatório 10-14.

Resultados

Animais e moradia
36 ratos Wistar machos foram alojados em pares e foram alimentados com 60% de roedores estéreis com alta gordura a partir das seis semanas de idade(Figura 2). Com 16 semanas de idade, eles foram submetidos a RYGB ou cirurgia falsa. Após a primeira semana pós-operatória, os ratos foram retomados em uma dieta rica em gordura. Metade dos ratos foram eutanizados em 2 semanas após o operatório e a outra metade foi eutanásia em 14 semanas de pós-operatório.

Discussão

O RYGB envolve a criação de uma pequena bolsa gástrica (menos de 30 mL), e a criação de um membro biliopancreatic e um membro Roux(Figura 1). Em humanos, o membro biliopancreatic é tipicamente de 30 a 50 cm e transporta secreções do remanescente gástrico, fígado e pâncreas. O membro Roux tem tipicamente 75 a 150 cm de comprimento e é o canal principal para alimentos ingeridos. O canal comum é o distal intestinal delgado restante para onde os dois membros se juntam e é onde ocorre a maioria d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suturas de Seda 2-0	Ethicon	K533
3-0 Vicryl Suturas	Ethicon	J219H
4% Isoflurano	N/A	N/A Solução
de Dextrose a 5% e Cloreto de Sódio a 0,9% - 1000 mL	Cônicos Baxter	2B1064
50 mL Suturas	Fisher Scientific	14-432-22
6-0	Ethicon	8805H
	N/A	N/A
Barbeador de Pêlos de Animais	N/A	N/A
Solução Betadine	N/A	N/A
Porta-agulha Castrojievo com trava 14 cm (curva suave)	Instrumentos de Precisão Mundial	503258
ECHELON FLEX Cortador Linear Endoscópico Articulado	Ethicon	Pinças Econômicas EC45A
#4	World Precision Instruments	501978
ENDOPATH ETS Cortador Linear Articulado 45mm Recarrega	Controlador	Ethicon 6R45B
com almofada de aquecimento (15,2 cm L x 20,3 cm C), sonda de temperatura da almofada e 10 protetores de manga descartáveis e não estéreis Coleira
	Kent Scientific	EC404VL-10
Tubo de Alimentação para Dieta Líquida (150 mL)	Bio-Serv	9007
(curto ajustável)	Bio-Serv	9015
	World Precision Instruments	500452
Micro Scissors	World Precision	Instruments 503365
Dieta de rato, calorias com alto teor de gordura (60%), pellets macios	Bio-Serv	S3282
No. 11 Lâmina e cabo de bisturi	N/A	N/A
OPMI Microscópio Cirúrgico	Vario ZEISS	S88
Grade de Piso Elevado	Tecniplast	GM500150 Grade
Dieta Líquida para Roedores, Lieber-DeCarli '82, Controle, 4 Litros/Saco	Bio-Serv	F1259
Solução de Irrigação de Cloreto de Sódio 0,9% - 500 mL	Baxter	JF7633
Cotonetes Estéreis	N/A	N/A
Campo Estéril	N/A	N/A
Toalha Estéril	N/A	N/A
Unidade de Cauterização Térmica	World Precision Instruments	501293

Tubos de Centrífuga Prolene Máquina Anestésica de Almofada de Aquecimento de Infravermelho Distante Elizabetana de Rato Grande Kent Scientific RT-0515 Suporte para Tubo de Alimentação para Dieta Líquida Pinça Micro Mosquito de Piso Elevado