Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.
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Artigo de método
Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.
Introdução
Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim pordiante 1 são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento2. Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agreg....
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Protocolo
1. Materiais e reagentes
- Use soluções livres pirogênicas e médias para cultura celular(Tabela 1).
- Prepare soluções para o experimento bioquímico usando água ultrauso e use como DNase/RNase livre.
- Selecione um FBS apropriado para a cultura celular com um processo de verificação de lotes. Uma vez que o lote selecionado da FBS muda regularmente, o catálogo e o número do lote para FBS não podem ser representados aqui.
- DNA plasmídeo
- Prepare pmeGFP-N15 para expressão monômero eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 para expressão GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7<....
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Resultados
Realizamos a medição fcs de GFP-TDP25 em lisesto celular e SOD1-G85R-GFP em células vivas. Em ambos os casos, foram capazes de ser adquiridas uma amplitude positiva e acfs suaves. Mostramos que uma parte do GFP-TDP25 expressa em células Neuro2a foi recuperada na fração solúvel sob a condição indicada6. Na fração solúvel do liseto celular, foram detectadas moléculas de fluorescência extremamente brilhantes no registro da taxa de contagem de fótons usando FCS (Figura 2A.......
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Discussão
Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para proteger o detector.......
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Divulgações
Esses autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
A.K. foi apoiada por uma Sociedade Japonesa de Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), por uma subvenção da Fundação Nakatani para Contramedidas contra novas infecções por coronavírus, por uma bolsa do Escritório da Universidade de Hokkaido para o Desenvolvimento de Futuros Líderes de Pesquisa (L-Station), e uma subvenção da Fundação Hoansha. M. K. foi parcialmente apoiado por um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686), e um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% (p/v) Tripsina-1 mmol/L EDTA· Solução 4Na com Vermelho de Fenol (Tripsina-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| Pratos de plástico de 100 mm | CORNING | 430167 | |
| Prato com base de vidro de 35 mm | IWAKI | 3910-035 | Para medição de células vivas |
| Pratos de plástico de 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Placa de alumínio | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apocromático 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Raspador de células objetivas | |
| Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | ||
| Membrana filtrante de acetato de celulose (0,22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Câmara de vidro de cobertura 8 poços | IWAKI | 5232-008 | Para medição da solução |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | meio basal |
| Soro bovino fetal (FBS) | biosera | Verificação de lote necessária | |
| Lipofectamina 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | Sistema FCS | |
| Neuroblastoma murino Células Neuro2a | ATCC | CCL-131 | Linha celular |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | DNA plasmídico para o transportador de transfecção |
| Solução de penicilina-estreptomicina (× 100) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | DNA de plasmídeo para TDP25 marcado com eGFP monomérico | ||
| pmeGFP-N1 | DNA de plasmídeo para expressão de monômero eGFP | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | DNA de plasmídeo para mutante G85R ligado a ALS de SOD1 marcado com eGFP monomérico | ||
| Coquetel de inibidor de protease | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....
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Reimpressões e permissões
