Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

Summary

Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

Abstract

A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.

Introduction

Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim por^{diante 1} são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento². Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agreg....

Protocol

1. Materiais e reagentes

1. Use soluções livres pirogênicas e médias para cultura celular(Tabela 1).
2. Prepare soluções para o experimento bioquímico usando água ultrauso e use como DNase/RNase livre.
3. Selecione um FBS apropriado para a cultura celular com um processo de verificação de lotes. Uma vez que o lote selecionado da FBS muda regularmente, o catálogo e o número do lote para FBS não podem ser representados aqui.
4. DNA plasmídeo
   1. Prepare pmeGFP-N1⁵ para expressão monômero eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ para expressão GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R^7<....

Results

Realizamos a medição fcs de GFP-TDP25 em lisesto celular e SOD1-G85R-GFP em células vivas. Em ambos os casos, foram capazes de ser adquiridas uma amplitude positiva e acfs suaves. Mostramos que uma parte do GFP-TDP25 expressa em células Neuro2a foi recuperada na fração solúvel sob a condição indicada⁶. Na fração solúvel do liseto celular, foram detectadas moléculas de fluorescência extremamente brilhantes no registro da taxa de contagem de fótons usando FCS (Figura 2A.......

Discussion

Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para proteger o detector.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% (p/v) Tripsina-1 mmol/L EDTA· Solução 4Na com Vermelho de Fenol (Tripsina-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
Pratos de plástico de 100 mm	CORNING	430167
Prato com base de vidro de 35 mm	IWAKI	3910-035	Para medição de células vivas
Pratos de plástico de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150460
Placa de alumínio	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apocromático 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Raspador de células objetivas
	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Membrana filtrante de acetato de celulose (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Câmara de vidro de cobertura 8 poços	IWAKI	5232-008	Para medição da solução
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	meio basal
Soro bovino fetal (FBS)	biosera		Verificação de lote necessária
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		Sistema FCS
Neuroblastoma murino Células Neuro2a	ATCC	CCL-131	Linha celular
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	DNA plasmídico para o transportador de transfecção
Solução de penicilina-estreptomicina (× 100)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			DNA de plasmídeo para TDP25 marcado com eGFP monomérico
pmeGFP-N1			DNA de plasmídeo para expressão de monômero eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			DNA de plasmídeo para mutante G85R ligado a ALS de SOD1 marcado com eGFP monomérico
Coquetel de inibidor de protease	Sigma-Aldrich	P8304