Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

Resumo

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho experimental completo para estudar interações RNA-proteína usando pinças ópticas. Várias possíveis configurações experimentais são delineadas, incluindo a combinação de pinças ópticas com microscopia confocal.

Resumo

O RNA adota diversas dobras estruturais, essenciais para suas funções e, assim, podem impactar diversos processos na célula. Além disso, a estrutura e a função de um RNA podem ser moduladas por vários fatores trans-acionados, como proteínas, metabólitos ou outras RNAs. As moléculas de RNA de mudança de quadro, por exemplo, são RNAs regulatórias localizadas em regiões de codificação, que direcionam ribossomos de tradução em um quadro de leitura aberto alternativo e, assim, agem como interruptores genéticos. Eles também podem adotar diferentes dobras após a ligação a proteínas ou outros fatores trans. Para dissecar o papel das proteínas vinculantes ao RNA na tradução e como elas modulam a estrutura e a estabilidade do RNA, é crucial estudar as características interpulsão e mecânica desses complexos de proteína RNA simultaneamente. Este trabalho ilustra como empregar pinças ópticas acopladas a uma molécula única para explorar a paisagem conformacional e termodinâmica dos complexos de proteína RNA em alta resolução. Como exemplo, elabora-se a interação do elemento ribossômico programado SARS-CoV-2 com o fator trans-ação de isoforme curto da proteína antiviral de dedo de zinco. Além disso, ribossomos rotulados por fluorescência foram monitorados utilizando-se a unidade confocal, o que, em última análise, permitiria o estudo do alongamento da tradução. O ensaio de fluorescência acoplado de OT pode ser amplamente aplicado para explorar diversos complexos de proteína RNA ou fatores trans-atuantes que regulam a tradução e poderia facilitar estudos de regulação genética baseada em RNA.

Introdução

A transferência de informações genéticas do DNA para as proteínas através dos mRNAs é um processo bioquímico complexo, que é precisamente regulado em todos os níveis através de interações macromoleculares dentro das células. Para a regulação translacional, as interações RNA-proteína conferem um papel crítico para reagir rapidamente a vários estímulos e ^sinais1,2. Algumas interações RNA-proteína afetam a estabilidade do mRNA e, assim, alteram o tempo em que um RNA é tratilicamente ativo. Outras interações RNA-proteína estão associadas a mecanismos de recodificação, como leitura stop-codon, bypass ou mudança de ....

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Clone a sequência de interesse no vetor contendo os fragmentos de DNA lambda, que servem como sequências de alça (Figura 2)^43,50.
2. Primeiro gerar um modelo de DNA para transcrição in vitro subsequente via PCR (Figura 2B; reação 1). Nesta etapa do PCR, o promotor T7 é adicionado no final de 5' da molécula de DNA de sentido32,33,43,50. Defina a reação do PCR....

Resultados

Nesta seção, o foco é dado principalmente em medidas de interações RNA-proteína/ligand pelas pinças ópticas fluorescência. Para uma descrição dos experimentos gerais de pinça óptica RNA e resultados representativos correspondentes, ^consulte32. Para uma discussão mais detalhada das interações RNA/DNA-proteína, consulte também 1,2,26,59,60.

Discussão

Aqui, demonstramos o uso de pinças ópticas acopladas à fluorescência para estudar interações e comportamento dinâmico de moléculas de RNA com vários ligantes. Abaixo, são discutidas etapas críticas e limitações da presente técnica.

Passos críticos no protocolo
Como para muitos outros métodos, a qualidade da amostra é fundamental para obter dados confiáveis. Portanto, para obter as amostras de maior qualidade possível, vale a pena gastar tempo para otimizar o procedimento pa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cepas bacterianas
. coli HB101	coleção de laboratório	Clonagem N/A	dos vetores
Produtos químicos e enzimas
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	31424	Tampões
Biotina-16-dUTP	Roche	11093070910	Biotinilação
BSA	Sigma-Aldrich	A4737	Buffers
Catalase	Lumicks	N / A	Sistema de eliminação de oxigênio
Ditiotreitol (DTT)	Melford Labs	D11000	Buffers
DNAse I do pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	D4527	transcrição in vitro
dNTPs	Th.Geyer	11786181
PCR EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Buffers
Formamida	Sigma-Aldrich		11814320001 Buffers
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	Sistema de eliminação de oxigênio
Glicose-oxidase	Lumicks	N / A	Sistema de eliminação de oxigênio
HEPES	Carl Roth	HN78.3	Buffers
Cloreto de magnésio	Carl Roth	2189,1	amortecedores
Phusion DNA polimerase	NEB	M0530L	Gibson conjunto, clonagem
cloreto de potássio	Merck	529552-1KG	tampões
PrimeSTAR GXL DNA Polimerase	Takara Bio Clontech	R050A	PCR
Pirofosfatase, thermostabile, inorgânico	NEB	M0296L	in vitro transcrição
RNase Inibidor	Molox	1000379515	Buffers
rNTPS	tecnologias de vida	R0481	transcrição in vitro
Tiossulfato de sódio	Sigma-Aldrich	S6672-500G	Desativação de alvejante
Sytox Green	Lumicks	N/A	medições confocais
T4 DNA Polimerase	NEB	M0203S	Biotinilação
T5 exonuclease	NEB	M0363S	Montagem Gibson, clonagem T7
RNA polimerase	Produzido internamente	N/A	transcrição in vitro
Taq DNA polimerase	NEB	M0267S	PCR
Taq ligase	Biozym	L6060L	Montagem Gibson, clonagem
TWEEN 20 BioXtra	Sigma-Aldrich	P7949	Buffers
Kits
Kit de Rotulagem de Proteínas Monólitas RED-NHS 2ª Geração (Amina Reativa)	Nanotemper	MO-L011	Usado para marcação de ribossomos
Purefrex 2.0	GeneFrontier	PF201-0.25-EX	Ribossomos usados para a rotulagem
Oligonucleotídeos
5' handle T7 forward	Microsynth	pedido	personalizado5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', usado para gerar o modelo de transcrição in vitro OT em PCR 1
3' handle reverse	Microsynth	ordem personalizada	5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', usado para gerar modelo de transcrição in vitro OT em PCR 1
5' alça para frente	Microsynth	ordem personalizada	5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , usado para gerar alça de 5' em PCR 2
5' alça reversa	Microsynth	ordem personalizada	5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', usado para gerar alça de 5' em PCR 2
Maçaneta de 3' para frente	Microsynth	ordem personalizada	5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', utilizada para gerar alça de 3' em PCR 3
alça de 3' reversa 5' marcado com digoxigenina	Microsynth	ordem personalizada	5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', usado para gerar alça 3' em vetores
de DNA >forte >
pMZ_OT	produzido internamente	N/A	descrição adicional em "Estudos estruturais da proteína Cardiovirus 2A revelam a base molecular para o reconhecimento de RNA e controle translacional" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software e Algoritmos
Atom	https://atom.io/packages/ide-python	N/A
Bluelake	Lumicks	N/A
Graphpad	https://www.graphpad.com/	N/A
InkScape 0.92.3	https://inkscape.org/	N/A
Matlab	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	N/A
BATATA		N/A
RNAestrutura	https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html	N/A
Spyder	https://www.spyder-ide.org/	N/A
Other
Partículas de Poliestireno Revestidas com Estreptavidina, 1.5-1.9 µ m, 5 ml, 1.0% w/v	Spherotech	SVP-15-5
Partículas de Poliestireno Revestidas com Anti-digoxigenina, 2.0-2.4 µ m, 2 ml, 0,1% c/v	Seringas Spherotech	DIGP-20-2
	VWR	TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap	Lumicks	N/A	pinças ópticas acopladas à microscopia confocal

E https://github.com/lpekarek/POTATO.git