Quantificação da função ventricular esquerda do coração do rato, tensão do miocárdio e forças hemodinâmicas por ressonância magnética cardiovascular

Summary

Este estudo descreve um protocolo abrangente de ressonância magnética cardiovascular (RMC) para quantificar os parâmetros funcionais ventriculares esquerdos do coração do camundongo. O protocolo descreve a aquisição, pós-processamento e análise das imagens da RMC, bem como a avaliação de diferentes parâmetros funcionais cardíacos.

Abstract

Os modelos de camundongos têm contribuído significativamente para a compreensão dos fatores genéticos e fisiológicos envolvidos na função cardíaca saudável, como perturbações resultam em patologia e como as doenças do miocárdio podem ser tratadas. A ressonância magnética cardiovascular (RMC) tornou-se uma ferramenta indispensável para uma avaliação in vivo abrangente da anatomia e função cardíaca. Este protocolo mostra medidas detalhadas da função ventricular esquerda do coração do rato, cepa do miocárdio e forças hemodinâmicas usando 7-Tesla CMR. Primeiro, a preparação e o posicionamento dos animais no scanner são demonstrados. As varreduras de pesquisa são realizadas para o planejamento de fatias de imagem em várias visões de curto e longo eixo. Uma série de filmes de curto eixo (SA) potencialmente acionados pelo ECG (ou imagens CINE) são adquiridos cobrindo o coração do ápice à base, capturando fases sistólicas e diatólicas finais. Posteriormente, imagens CINE de fatia única e retrospectiva são adquiridas em uma exibição SA midventricular, e em vistas de 2, 3 e 4 câmaras, a serem reconstruídas em imagens CINE de alta resolução temporal usando software personalizado e de código aberto. As imagens CINE são posteriormente analisadas usando um software dedicado de análise de imagens CMR.

Delinear fronteiras endomyocárdicas e epicardiais em imagens CINE end-sistólicas e terminais permite o cálculo de volumes end-sistólicas e diatólicas finais, fração de ejeção e saída cardíaca. As imagens MIDventricular SA CINE são delineadas para todos os períodos de tempo cardíaco para extrair uma curva detalhada de tempo de volume. Sua derivada temporal permite o cálculo da função diastólica como a razão das ondas de enchimento precoce e contração atrial. Finalmente, as paredes do endocardial ventricular esquerdo nas vistas de 2, 3 e 4 câmaras são delineadas usando o rastreamento de recursos, a partir do qual são calculados parâmetros de tensão miocárdio longitudinal e forças hemodinâmicas ventriculares esquerdas. Em conclusão, este protocolo fornece quantificação in vivo detalhada dos parâmetros cardíacos do camundongo, que podem ser usados para estudar alterações temporais na função cardíaca em vários modelos de camundongos de doenças cardíacas.

Introduction

A ressonância magnética cardiovascular (RMC) em animais pequenos fornece uma medição in vivo precisa da função miocárdica, tornando a RMC uma ferramenta ideal para pesquisas pré-clínicas em doenças cardiovasculares. Devido à alta resolução espacial e alto contraste entre sangue e miocárdio nas imagens cmr, é possível delinear os contornos endo e epicardial e calcular a massa miocárdia e os volumes ventriculares^1,2. Apesar das altas taxas cardíacas de até 600 batidas/min, o uso de eletrocardiograma (ECG) e acionamento respiratório permite medições de alta qualidade de diferentes fases cardíacas (também chamadas de imagens CINE) sem artefatos de movimento respiratório. Desta forma, várias fatias podem ser usadas para cobrir o coração do ápice à base para extrair parâmetros de função sistólica, como fração de ejeção (EF), volume sistólica final (ESV), volume de diastólica final (EDV) e saída cardíaca (CO)³. Além da avaliação básica da função sistólica, técnicas adicionais de RMC foram desenvolvidas recentemente para avaliar a disfunção diastólica^4,a cepa miocárdia⁵e as forças hemodinâmicas (HDF)⁶.

O gating ECG permite a sincronização ao ciclo cardíaco iniciando a aquisição de sinal de MR após a detecção do pico R e registrando um número definido de fases cardíacas durante o intervalo R-R. No entanto, o número de fases cardíacas (taxa de quadros) que podem ser adquiridas dessa forma depende do menor tempo de repetição possível (TR) que o sistema pode alcançar mantendo uma relação sinal-ruído aceitável (SNR) e resolução espacial⁴. Além disso, como o uso de gradientes de campo magnético elevado pode distorcer temporariamente o sinal ECG, a aquisição geralmente é interrompida antes da fase diatólica final. Ambos os fatores limitam o uso desses exames para avaliações de funções sistólicas, já que o cálculo de outros parâmetros funcionais cardíacos requer uma melhor definição da curva de tempo de volume ventricular esquerdo (LV).

Imagens CINE de alta taxa de quadros podem ser adquiridas por gating retrospectivo, pelo qual o sinal mr é continuamente adquirido durante a varredura, e um eco de navegador incorporado após a excitação de radiofrequência (RF) detecta movimento cardíaco e respiratório. Como a aquisição da RMC é realizada de forma assíncrola com o movimento cardíaco, os sinais de Ressonância Magnética adquiridos podem então ser atribuídos a um número retrospectivamente escolhido de quadros cardíacos. Desta forma, se dados suficientes forem coletados, imagens CINE de alta taxa de quadros podem ser reconstruídas^4,7. Isso permite, então, a avaliação da função diastólica, representada pela razão entre a taxa de enchimento precoce de pico (E') e o pico de taxa de enchimento tardio da contração atrial (A').

Em pesquisas clínicas, as imagens CINE podem ser analisadas com rastreamento de recursos cmr para avaliar a cepa do miocárdio e HDF^6,8. A cepa do miocárdio é um parâmetro de deformação cardíaca que mede a diferença de percentuais entre o comprimento inicial (geralmente em comprimento diastólico final) e o comprimento máximo (geralmente no sistólio final) de um segmento miocárdio⁹. As medidas de tensão do miocárdio podem ser de valor incremental para avaliar a função LV, pois os valores da tensão quantificam o encurtamento e o engrossamento da parede miocárdio. A redução da função de encurtamento pode ser uma indicação de dano de fibra subendocardial¹⁰. Alterações na cepa do miocárdio podem ocorrer independentemente da EF e podem ser um precursor para complicações subjacentes.

Especificamente, a cepa longitudinal global (GLS) e a cepa circunferencial global (GCS) têm se mostrado de valor agregado na caracterização da doença cardíaca^10,11,12. Da mesma forma, o HDF tem sido sugerido ser um parâmetro novo potencial para indicar a função cardíaca alterada^6,13. Estes hdf ou gradientes de pressão interventricular (IVPG) impulsionam o movimento sanguíneo durante a ejeção e preenchimento do coração e são afetados pela troca de impulso entre sangue e miocárdio, incluindo a válvula aórtica e mitral^14,15.

Neste estudo, um protocolo abrangente é descrito para a realização de medidas robustas de CMR animal pequeno para quantificar a função LV, a cepa do miocárdio e o HDF dos corações dos mouses. Contém as etapas necessárias para a preparação animal, aquisição de dados utilizando imagens CINE prospectiva e retrospectivamente fechadas do coração, bem como análise com software dedicado capaz de calcular as medidas volumétricas, razão E'/A', cepa miocárdica e HDF do coração. Este protocolo pode ser usado para a avaliação extensiva da função LV em vários modelos de camundongos de doenças cardiovasculares.

Protocol

Os experimentos animais descritos são conduzidos de acordo com as diretrizes da União Europeia para o bem-estar dos animais de laboratório (Diretiva 2010/63/UE) e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Centro Médico Acadêmico.

1. Configuração e preparação animal

1. Antes de iniciar o experimento, certifique-se de que há anestesia isoflurane suficiente por pelo menos 2 h, e que a bateria disponível para ECG e monitoramento respiratório esteja suficientemente carregada. Certifique-se de que a área do scanner está equipada com um tubo de extração de fumaça funcionando para remover o excesso de isoflurane.
2. Prepare o berço do mouse(Figura 1A),e ligue o sistema de aquecimento animal com a temperatura definida para 40 °C. Prepare o módulo de interface respiratória ECG e a configuração da bateria(Figura 1B),e inicie o software para monitoramento em tempo real de ECG e sinais respiratórios(Figura 1C).
3. Remova o mouse da gaiola de carcaça e meça o peso corporal.
4. Coloque o rato em uma câmara de indução de anestesia sob um braço de extração de capô de fumaça, e forneça 3-4% de isoflurane em uma mistura de 0,2 L/min O₂ e 0,2 L/min de ar médico. Depois que o animal estiver totalmente anestesiado, aplique uma pequena gota de pomada nos olhos em cada olho, e feche as pálpebras do rato.
5. Coloque o mouse na posição supina no berço do mouse. Gancho os incisivos do mouse na barra de mordida no berço do mouse, e ajuste o cone do nariz para caber corretamente(Figura 1A). Verifique visualmente se a respiração está estável abaixo de 100 respirações/min, e reduza o isoflurane para ~2% durante a preparação animal.
6. Mova o berço do mouse de tal forma que o coração esteja localizado na parte do suporte do berço que vai acabar no centro da bobina RF e iso-central do ímã.
7. Use geleia de petróleo para inserir a sonda de temperatura retal e tape o cabo de fibra óptica da sonda de temperatura no berço do mouse.
8. Coloque o balão respiratório no abdômen inferior do mouse e fixe-o com fita adesiva. Insira duas agulhas de eletrodo ECG subcutâneamente no tórax na altura das prevedas e grave-as suavemente para evitar o movimento(Figura 1A).
9. Verifique se os sinais de respiração e ECG são de qualidade suficiente e se os pontos de gatilho corretos são detectados pelo software (Figura 1C).
   1. Certifique-se de que a taxa respiratória é de 50-80 respirações/min, frequência cardíaca ~400-600 batidas/min, e temperatura corporal em torno de 37 °C. Ajuste a administração isoflurane quando a taxa respiratória estiver fora dessa faixa, e reduza a temperatura do sistema de aquecimento animal se a temperatura corporal tende a exceder 37 °C.
10. Coloque a bobina RF sobre o mouse.
    NOTA: Dependendo do sistema, isso pode exigir uma desconexão temporária dos eletrodos ECG e dos plugues de balão respiratório do módulo ECG/interface respiratória.
11. Conecte os cabos da bobina e coloque o berço no furo do ímã. Verifique se o sinal de ECG ainda está estável.
    1. Se o sinal ECG for subótimo, reposicione os eletrodos ECG para um sinal melhor, pois isso não pode ser feito em um estágio posterior sem alterar significativamente a orientação do animal.

Figura 1: Preparação animal e configuração do equipamento para imagem cmr do coração do rato. (A) Camundongo totalmente anestesiado na posição supina, colocado no berço do rato aquecido com um travesseiro pneumático respiratório colocado no abdômen, sensor de temperatura de fibra óptica retal e eCG subcutâneo no peito perto das preevoadas. (B) Bobina do corpo do rato colocada sobre o berço do mouse, com cabos de ECG e travesseiro respiratório reconectado ao ECG e interface respiratória antes de colocar o suporte no ímã de ressonância magnética. (C) Representação do ECG e sinais respiratórios em software dedicado de monitoramento animal de pequeno porte. O pico R do sinal ECG é detectado e usado como ponto de partida para aquisição de sinal de ressonância magnética. Um período de em branco entre os picos R pode ser ajustado manualmente com base no período de um batimento cardíaco. O acionamento só pode ocorrer durante o platô respiratório (linha verde no painel do meio) para o qual o atraso inicial e a largura máxima podem ser ajustados manualmente. Abreviaturas: CMR = ressonância magnética cardiovascular; ECG = eletrocardiograma; Ressonância Magnética = ressonância magnética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Calibração e acionamento da ressonância magnética

1. Ajuste os parâmetros de ECG e gating respiratório dentro do software de monitoramento de sinais, de modo que os pontos de gatilho sejam gerados nos picos R e somente durante a porção plana do sinal respiratório. Para minimizar os erros de gating do ECG, defina um período de em branco 10-15 ms mais curto que o intervalo R-R.
   NOTA: Este período de em branco deve ser ajustado durante todo o experimento se ocorrerem alterações na frequência cardíaca.
2. Realize uma calibração de frequência central e uma varredura SCOUT padrão (untada) com zero deslocamento para determinar a posição do mouse no scanner nas direções coronal, axial e sagital. Se o coração não estiver posicionado dentro de 0,5-1 cm do centro de campo de visão (FOV), ajuste a posição do berço em conformidade e refaça a varredura SCOUT.
3. Execute uma calibração manual de shim e RF usando os métodos de fornecedor disponíveis.

3. Escaneie planejamento e aquisição

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter parâmetros de varredura detalhados das seguintes varreduras.

1. Com base no SCOUT inicial, realize uma varredura de reconhecimento de gradiente de um quadro único (GRE)(Tabela 1, scan 1) com 5 fatias em 3 direções ortogonais, e posicione cada pilha de fatias na localização aproximada do coração para localizar a posição exata do coração(Figura 2A).
2. Realize uma varredura de varredura SA de um único quadro(Tabela 1, scan 2). Para isso, use o batedor GRE anterior para posicionar 4-5 fatias em uma posição ventricular de meio-esquerdo, perpendicular ao eixo longo do coração para encontrar uma estimativa inicial da visão SA midventricular, que é necessária para planejar o escotismo de 2 câmaras de longo eixo(Figura 2B).
3. Para as seguintes varreduras prospectivas (etapas 3.4-3.6), ajuste o número de quadros cardíacos (Nframes) de modo que Nframes × TR seja ~60-70% do intervalo R-R.
   NOTA: A aquisição para 60-70% do intervalo R-R é suficiente para capturar a fase diatólica final do ciclo cardíaco, permitindo o relaxamento adicional do T1 durante a diastola final para melhorar o SNR e prevenir a perturbação do seguinte pico R por comutação gradiente.
4. Realize uma varredura GRE de fatia única fechada para gerar o batedor de 2 câmaras (2CH) de eixo longo, combinado com a varredura SA, é necessário para planejar a 4 câmara (4CH) (Tabela 1,scan 3). Para este fim, posicione uma fatia perpendicular às visões SA anteriores que correm paralelamente aos pontos de conexão entre o ventrículo esquerdo e direito. Mova esta fatia para o meio do ventrículo esquerdo, e verifique a imagem coronal do batedor GRE se a fatia estiver alinhada com o eixo longo lv de tal forma que ela seja colocada através do ápice(Figura 2C).
5. Realize outra varredura GRE de fatia única fechada para gerar a varredura de 4 câmaras (4CH), necessária para planejar a SA de várias fatias e a varredura de 3 câmaras(Tabela 1, scan 4). Para este fim, posicione uma fatia perpendicular à varredura de scout 2CH e alinhe-se ao centro do eixo longo de tal forma que a fatia passe pela válvula mitral e pelo ápice. Nas vistas SA, ajuste a fatia de modo que ela seja colocada paralelamente à parede ventricular posterior e anterior e entre os dois músculos papilares(Figura 2D). Verifique se a fatia permanece no centro do ventrículo durante todo o ciclo cardíaco.
6. Realize uma varredura SA GRE sequencial de várias fatias(Tabela 1, digitalização 5) para medições de função sistólica. Para isso, posicione uma fatia midventricular perpendicular ao eixo longo lv nas vistas 2CH e 4CH no centro do coração, e aumente o número de fatias (tipicamente um número ímpar, por exemplo, 7 ou 9 fatias, sem lacuna entre as fatias) para cobrir o coração da base ao ápice(Figura 2E).
7. Para os seguintes escaneamentos retrospectivamente fechados (etapas 3.8-3.9), desligue toda a funcionalidade prospectiva de gating cardíaco e respiratório. Anote a taxa cardíaca e respiratória antes e depois de cada varredura retrospectivamente fechada, e use esses valores para fins de reconstrução posteriormente (etapa 5.2.2).
8. Realize três varreduras GRE fechadas retrospectivamente sequenciais na visão SA midventricular (para quantificação da razão E'/A'), 2CH e 4CH, as duas últimas necessárias para a quantificação da cepa miocárdica e dos valores HDF(Tabela 1, digitalização 6-8). Se necessário, otimize as orientações finais de fatias 2CH e 4CH com base nas visualizações SA multi-fatias, bem como nas varreduras de scout 2CH e 4CH disponíveis.
9. Realizar uma varredura GRE de fatia única adjacente em uma visão de 3 câmaras (3CH), que combinada com a visão 2CH e 4CH da etapa 3.8 é necessária para a quantificação da cepa miocárdica e dos valores HDF(Tabela 1, scan 9). Para este fim, posicione uma fatia perpendicular à visão SA midventricular semelhante à posição da visão final de eixo longo 4CH, e gire a fatia em 45° para passar da parede anterior para o músculo papilar mais próximo da parede posterior. Inspecione a fatia SA basal para ver se a fatia passa pela válvula mitral e aórtica. Inspecione na visão final de 4CH do eixo longo se a fatia estiver passando pelo ápice(Figura 2F).

Figura 2: Planejamento de fatias para imagens CMR em um mouse. (A) GRE SCOUT planejando através do coração em 3 vistas ortogonais usando o scout scan inicial. (B) O scout de eixo curto planeja as fatias coronal e sagital GRE SCOUT. (C) Planejamento da visão de batedor 2CH utilizando o batedor de eixo curto e a fatia coronal GRE SCOUT. (D) Planejamento da visão de batedor 4CH usando o batedor de eixo curto e o batedor 2CH. (E) Planejamento da visão de eixo curto de várias fatias usando batedores 2CH e 4CH. (F) (esquerda) Planejamento das vistas finais de 2CH, 3CH e 4CH utilizando as vistas de curto eixo midventricular e 2CH/4CH. Abreviaturas: CMR = ressonância magnética cardiovascular; GRE = Gradiente Eco; CH = câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Número de varredura(s)	1	2	3	4	5	6-9
Escaneie os nomes(s)	Batedor gre	multi-fatia SA scout	Batedor de 2CH	Batedor 4CH	SA multi-fatias	SA, 2CH, 4CH, 3CH
fatias totais	15 (3 x 5)*	4-5	1	1	7-9	1
Espessura (mm)	1	1	1	1	1	1
FOV (mm)	60	35	30	30	35	30
Relação FOV	1	1	1	1	1	1
Ângulo de lançamento	40	20	20	20	20	15
TE (ms)**	3.8	3.4	2.5	2.5	2.5	3.6
TR (ms)	200	1 R-R	7	7	7	8
Nframes	1	1	12-14	12-14	12-14	32 ***
Tamanho da matriz	192 x 192	192 x 192	192 x 192	192 x 192	192 x 192	192 x 192
Ativação do ECG	Não	Sim	Sim	Sim	Sim	retrospectiva
Desencadeamento respiratório	Sim	Sim	Sim	Sim	Sim	retrospectiva
Médias	1	3	5	5	5	retrospectiva ****
Tempo total de imagem (estimado *****)	2 min.	2min	3-4 min	3-4 min	20-25 min	13 min / scan

Tabela 1: Parâmetros de aquisição para cada sequência utilizada durante o protocolo CMR. * Os exames são realizados em três orientações ortogonais diferentes (axial, coronal, sagital). **O te mais curto possível, dado todos os outros parâmetros são utilizados, o que depende da configuração específica do scanner. Este é o número de quadros cardíacos após binning retrospectivo. A média efetiva depende do preenchimento aleatório do espaço K durante o tempo total de aquisição. No total, foram realizadas 400 repetições de todas as linhas K. Incluindo atrasos no ECG/gatilho respiratório. Abreviaturas: CMR = ressonância magnética cardiovascular; ECG = eletrocardiograma; GRE = eco gradiente; FOV = campo de visão; TE = tempo de eco; TR = tempo de repetição; Nframes = número de quadros cardíacos; SA = eixo curto; CH = câmara. Clique aqui para baixar esta Tabela.

4. Finalização do experimento e armazenamento de dados

1. Remova o mouse do berço depois de desprender todos os outros equipamentos de medição e desligue a anestesia. No caso de experimentos longitudinais, coloque o rato em uma gaiola de habitação pré-aquecida a 37 °C para recuperação até que o animal esteja acordado e ativo.
2. Limpe todos os equipamentos que foram usados com lenços de limpeza ou 70% de álcool.
3. Gerar arquivos DICOM (Digital Imaging and Communication in Medicine) para os dados de ressonância magnética prospectivamente fechados e copiá-los juntamente com os arquivos de dados brutos da ressonância magnética das varreduras retrospectivamente fechadas para um servidor seguro para análise subsequente de dados.

5. Reconstrução offline dos exames adquiridos retrospectivamente

NOTA: Para a reconstrução das varreduras retrospectivamente fechadas, foi utilizado um software de código aberto personalizado(Figura 3). Execute as seguintes etapas para cada um dos dados acionados retrospectivamente separadamente.

1. Abra o software de reconstrução Retrospectivae carregue o arquivo de dados bruto correspondente a uma ressonância magnética fechada retrospectivamente.
2. Inspecione o sinal do navegador Raw e note que os picos de sinal mais altos representam a frequência respiratória e os picos de sinal mais baixos representam a frequência cardíaca.
   1. Se os picos forem registrados de cabeça para baixo, gire o sinal com o interruptor para cima/para baixo.
   2. Além disso, verifique se a frequência cardíaca detectada automaticamente corresponde a 10% dos valores observados durante cada varredura. Caso não, ajuste manualmente esses valores porque a detecção automatizada falhou.
   3. Escolha uma porcentagem de janela adequada para exclusão de dados durante o movimento respiratório, geralmente 30%.
3. Pressione o filtro para realizar a análise do navegador e separe o navegador cardíaco do navegador respiratório.
4. Defina o número de quadros CINE para 32 (valor utilizado neste estudo) e pressione tipo k-space.
5. Escolha as configurações apropriadas para regularização de sensoriamento comprimido (CS) e reconstrua a prensa. Utilize os seguintes parâmetros típicos de regularização: parâmetro de regularização de ondas nas dimensões espacial (x, y e z) (WVxyz) 0,001 ou 0; restrição de variação total na dimensão CINE (TVcine) 0.1; restrição de variação total na dimensão espacial (TVxyz) 0; e restrição de variação total na dimensão dinâmica (TVdyn) 0,05.
6. Uma vez concluída a reconstrução, pré-visualizar o filme CINE para avaliar a reconstrução. Exportar imagens DICOM para análise posterior com o EXPORT DCM.

Figura 3: 'Retrospectiva' desencadeando interface gráfica do usuário. 'Retrospectiva' é uma aplicação de reconstrução personalizada para exames de ressonância magnética cardíaca acionados retrospectivamente. Na interface do usuário, é possível avaliar o sinal do navegador, ajustar o número de quadros CINE a serem reconstruídos, ajustar os parâmetros de sensoriamento comprimido para melhorar a reconstrução, visualizar as imagens CINE como um filme dinâmico e exportar os dados reconstruídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Software de análise de imagens

NOTA: O software de análise de imagem (Figura 4) requer o uso de imagens DICOM e possui múltiplos plugins para diferentes aplicações de análise cardiovascular, como o plugin para medições volumétricas e o plugin para análise de cepa e HDF.

1. Para avaliação volumétrica da LV, selecione a varredura SA de várias fatias e carregue-a no plugin para medições volumétricas.
   1. Atribua etiquetas sistólicas finais (ES) e diastólicas finais (ED) ao quadro cardíaco correspondente.
   2. Use as ferramentas de contorno para segmentar as bordas do endomyocárdico nos quadros ES e ED.
      NOTA: O software de análise, utilizado para este protocolo, exibe automaticamente os parâmetros LV EF, EDV, ESV quando todas as anotações necessárias foram feitas.
2. Para medições diastólicas, selecione as imagens SA CINE midventricular e carregue-as no plugin para medições volumétricas.
   1. Atribua as etiquetas ED e ES aos quadros cardíacos correspondentes.
   2. Use as ferramentas de contorno para segmentar a borda do endocárdio para todos os quadros. Compare a segmentação dos quadros vizinhos para garantir transições suaves da segmentação ao longo do ciclo cardíaco.
   3. Exporte a evolução do tempo de todos os quadros cardíacos e os volumes correspondentes do endomicardial LV (LV ENDO). Aplique um script personalizado (ver Material Suplementar) para calcular a razão E'/A'.
      NOTA: O script aplica um filtro Savitzky-Golay para cálculo robusto das curvas dV/dt e usa detecção de pico semiautomática para encontrar os picos E' e A'.
3. Para cálculos de cepa e HDF, selecione as imagens CINE de eixo longo de 2CH, 3CH e 4CH e carregue-as no plugin para medições volumétricas.
   1. Atribua as etiquetas ED e ES ao quadro cardíaco correspondente em cada orientação de fatia.
   2. Use as ferramentas de contorno para segmentar a borda do endocárdio para todos os quadros em todas as 3 orientações. Compare a segmentação dos quadros vizinhos para garantir transições suaves da segmentação ao longo do ciclo cardíaco.
   3. Uma vez que os contornos são desenhados no plugin para medições volumétricas, execute o plugin para a tensão e análise HDF.
   4. Atribua cada um dos conjuntos de dados adquiridos aos rótulos correspondentes para visualizações de 2CH, 3CH e 4CH e execute a análise de tensão.
   5. Para análise hdf, desenhe o diâmetro da válvula mitral no quadro estatólico final em todas as 3 orientações e desenhe o diâmetro da aorta na imagem de eixo longo de 3 câmaras.

Figura 4: Interface gráfica do usuário do software de análise de imagem. O plugin para medição volumétrica no software de análise de imagem, que é usado para contorno da borda do endomyocárdio. Para cada conjunto de dados, são selecionadas as fases cardíacas diatólicas e finais são selecionadas, e a borda do endomyocárdio é segmentada para todos os quadros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

Usando o protocolo descrito anteriormente, um grupo de camundongos saudáveis de C57BL/6 wildtype (n = 6, 14 semanas) foi escaneado usando um scanner de ressonância magnética 7-Tesla usando uma bobina de gaiola de 38 mm de diâmetro. Durante cada sessão de varredura, as imagens CINE SA multi-fatias foram adquiridas usando sequências GRE prospectivamente fechadas, enquanto as imagens CINE midventricular de fatia única, 2CH, 3CH e 4CH foram adquiridas usando gating retrospectivo. Reconstruções representativas de alta taxa de quadros de varreduras retrospectivamente fechadas usando um software pós-processamento personalizado podem ser vistas no Vídeo Suplementar 1. A partir das imagens resultantes, foram determinadas curvas de tempo de volume durante o ciclo cardíaco (Figura 5A) bem como as curvas de primeiro derivado correspondentes (dV/dt) para cálculo de sistólica (EF = 72,4 ± 2,8%) e parâmetros de função diastólica (razão E'/A' = 1,5 ± 0,3) respectivamente.

As imagens CINE de visão 2CH, 3CH e 4CH foram analisadas utilizando-se software de análise de imagem para determinar alterações endocardiais GLS (endoGLS) ao longo do ciclo cardíaco (Figura 5B) e valores de GLS de pico correspondentes (-22,8 ± 2,4%) como medida para a cepa do miocárdio. Além disso, o software calcula a média raiz do HDF quadrado (RMS) em direções longitudinais (apex-base) (135,2 ± 31,7%) e transversal (inferolateral-anteroseptal) (12,9 ± 5,0%) e direções transversais (inferolateral-anteroseptal). Para cada animal, também é possível produzir um perfil de tempo HDF, que segue um padrão consistente de picos positivos e negativos que representam a magnitude e a direção do HDF durante o ciclo cardíaco (Figura 5C). Os resultados descritivos de todos os parâmetros de desfecho são resumidos na Figura 5D.

Figura 5: Quantificação dos parâmetros funcionais lv com base no coração do mouse. (A) Curva de volume-tempo representativo e curva dV/dt correspondente. Este último retrata a velocidade de fluxo com pico de enchimento antecipado distinto (E') e pico de contração atrial (A'). (B) Curva gls representativa indicando deformação da tensão na direção longitudinal durante todo o ciclo cardíaco. (C) Curva HDF representativa com picos de força distintos na direção de nível ápice, começando com a força de ejeção sistólica e seguida por uma força descendente na transição entre sistóstole e diastole, força de desaceleração de ondas E, aceleração de ondas A e força de desaceleração. (D) Resultados descritivos de todos os animais para valores de EF, razão E'/A', GLS de pico e quadrado médio raiz do HDF em direções apex-base e inferolateral-anteroseptal. Os valores são expressos como média ± SD. Abreviaturas: LV = ventrículo esquerdo; V = volume; t = tempo; GLS = cepa longitudinal global; HDF = forças hemodinâmicas; EF = fração de ejeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo suplementar 1: Reconstrução representativa de imagens CINE fechadas retrospectivamente em vistas SA, 2CH, 3CH e 4CH. Abreviaturas: SA = eixo curto; CH = câmara. Clique aqui para baixar este vídeo.

Material Suplementar: Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

O protocolo apresentado descreve o uso de imagens CMR para experimentos longitudinais, não invasivos e invasivos para analisar a função cardíaca em camundongos. Esses resultados são exemplos de animais saudáveis para demonstrar a viabilidade do uso de imagens CINE para quantificar os parâmetros cardíacos. No entanto, os métodos descritos podem ser usados para vários modelos animais. Embora modelos específicos de doenças possam exigir pequenas alterações no protocolo, sua estrutura básica para avaliar os diferentes parâmetros funcionais cardíacos será muito semelhante. Um caso em particular que vale a pena mencionar é um modelo de infarto do miocárdio onde parte do coração tem perda significativa na contração. Isso pode causar baixa qualidade do sinal do navegador cardíaco dentro desta fatia. Neste caso, uma opção alternativa seria adquirir o navegador a partir de uma fatia separada, conforme descrito em estudo anterior por Coolen et al.¹⁶. As imagens CINE em diferentes pontos de vista são reconstruídas a partir de dados armazenados retrospectivamente usando algoritmos CS e são analisadas usando software de análise de imagem para calcular a tensão e os valores de HDF.

A qualidade das imagens adquiridas depende naturalmente de todas as etapas de preparação, que precisam ser cuidadosamente realizadas antes de iniciar o protocolo de ressonância magnética cardíaca. Por exemplo, se não forem vistos sinais claros de ECG e respiratórios ao colocar o animal dentro do scanner de ressonância magnética, isso provavelmente resultará em aquisições subótimas e até mesmo aumento dos tempos de varredura devido ao efeito adicional das distorções magnetohidrodynamic¹⁷. É importante perceber que devido ao planejamento sequencial das orientações da fatia, os animais não podem simplesmente ser reposicionados entre os exames. Portanto, não é possível reajustar os leads de ECG entre as varreduras, pois isso alterará a posição do mouse no scanner. Durante a varredura, o controle de temperatura é crucial para a manutenção de um intervalo cardíaco e respiratório constante, o que beneficia especialmente a qualidade dos escaneamentos armazenados retrospectivamente que são adquiridos por um período maior de tempo. Durante este ciclo de alta duração, a temperatura do animal pode aumentar constantemente, fazendo com que a frequência cardíaca e a frequência respiratória aumentem. O ajuste da temperatura do sistema de aquecimento e da anestesia pode contribuir muito para estabilizar a taxa respiratória antes ou durante a varredura.

Um passo crítico durante a análise é a consistência no desenho do contorno. Embora a segmentação automática funcione bem para dados clínicos, não tem desempenho robusto no caso de dados cardíacos do camundongo (não testados para ratos). A alta frequência cardíaca e o alto fluxo sanguíneo durante fases cardíacas específicas, especialmente no início do enchimento da LV, podem causar desfaçamento intravoxel e vazios de sinal, comprometendo a delineamento da parede miocárdio. Portanto, não é aconselhável analisar cada quadro de forma independente, mas inspecionar visualmente o movimento da parede do miocárdio entre os quadros e levar isso em conta ao desenhar os contornos em todos os quadros. Aconselhável copiar e ajustar o contorno endocárdico entre dois quadros consecutivos para manter um movimento contratil mais natural na análise. Neste protocolo, os músculos papilares são excluídos do volume de lúmen ventricular nas imagens SA para avaliação da função sistólica e diastólica, enquanto estão incluídos nas vistas 2CH, 3CH e 4CH para a tensão e análise hdf porque este último se baseia no conhecimento do movimento preciso da parede miocárdica, em vez do volume preciso dos lumen ventriculares.

Considerando que os parâmetros de função sistólica e diastólica baseiam-se na medição dos volumes de LV ao longo do ciclo cardíaco, os parâmetros de tensão e HDF também dependem de padrões de movimento dentro da parede do miocárdio. Para isso, são utilizadas técnicas de rastreamento de recursos onde o deslocamento do segmento miocárdio pode ser avaliado reconhecendo características anatômicas distintas e intensidades de sinal entre as fases subsequentes do CINE. O forte contraste entre a poça sanguínea e o miocárdio nas imagens cmr facilita o uso de rastreamento de recursos para posterior tensão e análise HDF⁸. Antes do rastreamento de recursos da CMR, a cepa do miocárdio foi determinada com echografia de rastreamento de manchas e marcação de tecido cmr. O rastreamento de recursos do CMR não requer tempo adicional de varredura em comparação com a marcação de tecido CMR. No entanto, apesar do uso de gatilho retrospectivo, a RMC ainda possui uma resolução temporal limitada, o que pode dificultar a avaliação correta de deformações rápidas dentro do ciclo cardíaco.

A avaliação do HDF ao longo do ciclo cardíaco requer medições dos diâmetros das válvulas mitral e aórtica para calcular o HDF em direções apex-base e anteroseptal inferolateral usando equações descritas anteriormente¹⁸. Este método mostrou estimativas consistentes do HDF em comparação com a ressonância magnética de fluxo 4D padrão de referência, que tem uma disponibilidade limitada no uso clínico devido à sua complexidade⁶. É importante saber que a estimativa robusta dos diâmetros da válvula é difícil e, portanto, os diâmetros da válvula devem ser mantidos constantes para um grupo de animais e através de medições repetidas em um estudo longitudinal, pois variações neste parâmetro por estimativas incorretas poderiam facilmente ofuscar mudanças sutis nos parâmetros do HDF. O software específico usado para calcular parâmetros GLS e HDF pode não estar disponível para todos os usuários. Portanto, pode-se referir-se a Voigt et al.¹⁹ (GLS), bem como Pedrizzetti et al.^6,20 (HDF), que contêm todas as descrições matemáticas que formam a base dos respectivos cálculos realizados pelo software de análise.

Para efeitos deste estudo, o protocolo foi avaliado em animais saudáveis (N = 6). Um conjunto representativo de curvas de tempo para volume LV, dV/dt, endoGLS e HDF são mostrados na Figura 5A-C. Os valores médios dos múltiplos parâmetros funcionais cardíacos (EF, E'/A'-ratio, peak GLS e HDF) são mostrados na Figura 5D. Estes concordam bem com protocolos comparáveis utilizados na literatura²¹. A literatura sobre dados GLS e HDF em camundongos é escassa. Foi medido um valor médio de GLS de -22,8%, que está na mesma faixa dos dados clínicos^8,indicando que as medidas de GLS obtidas com o método descrito são viáveis em camundongos. As curvas HDF obtidas em camundongos também mostram as mesmas fases distintas vistas em dados humanos, mostrando a tradução bem-sucedida dessa técnica para pesquisas pré-clínicas. Enquanto os parâmetros hdf são hipóteses para servir como biomarcadores iniciais de disfunção cardíaca, mais estudos são justificados para investigar o valor diagnóstico e preditivo deste novo parâmetro. Os resultados deste protocolo mostram que os resultados de HDF e GLS devem ser mais variáveis entre os animais, o que precisa ser levado em conta quando são esperadas diferenças sutis nos modelos animais ou efeitos do tratamento.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipamento
AccuSens condicionador de sinal de canal único e multicanal	Opsens solutions inc., Canadá	ACS-P4-N-62SC	Usado com sensor de temperatura de fibra óptica para monitorar a temperatura corporal
Pomada para os olhos Duratears	Alcon Nederland B.V., Holanda
Célula de rato	É equipamento Vé té rinaire Minerve, França		referido como mouse berço
compatível com MR Monitoramento & Sistema de Gating para Pequenos Animais	SA Intuments, Inc., Estados Unidos	Modelo 1030	Módulo ERT (ECG/módulo de interface respiratória) , Módulo de Controle/Gating ERT, pacote de bateria e conjunto de eletrodos de ECG subdérmico
Scanner de ressonância magnética	MR Solutions Ltd., Reino Unido	Modelo: MRS-7024	Sistema de ressonância magnética pré-clínica 7,0 T/24 cm
Unidade de controle de temperatura multiestação e PCA de alto fluxo	e Acute; equipamento Vé té rinaire Minerve, França	Modelo: URT Multipostes	sistema de aquecimento animal
Sensor de Respiração	Graseby Medical Limited, Reino Unido	Ref 2005100
Bobina RF	MR Solutions Ltd., Reino Unido	MRS-MVC	38mm volume do mouse Bobina RF para estudos do corpo do mouse
de vazão medidor de vazão, Itália	SF 3
Vaporizador sigma delta Intermed	Penlon Ltd., Reino Unido
Materials
Isoflurane	AST farma, Países Baixos
Vaselina vaselina	Unilever, Reino Unido
Software
BART toolbox			https://mrirecon.github.io/bart/
Mathematica 12.0	Wolfram Research, Inc., Estados Unidos
MATLAB 2019a	The MathWorks,Inc., Estados Unidos
MEDIS Suite MR	Medis Medical Imaging Systems B.V., Holanda		Software de análise de imagem
PC-SAM	SA Intuments, Inc., Estados Unidos
	MR Solutions Ltd., Reino Unido		Software de digitalização
Versão retrospectiva 7.0	Amsterdam UMC, Holanda		Software de reconstrução: https://github.com/Moby1971?tab=repositories