Um Modelo de Apoptose Neuronal Induzida por Compressão da Medula Espinhal em Ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de compressão da medula espinhal de rato, avaliar sua pontuação comportamental e observar a região comprimida da medula espinhal. As avaliações comportamentais mostraram diminuição da incapacidade motora do monitor. A coloração e imunocoloração de hematoxilina e eosina revelaram considerável apoptose neuronal na região comprimida da medula espinhal.

Resumo

Como uma doença degenerativa progressiva grave, a mielopatia espondilótica cervical (MSC) tem um prognóstico desfavorável e está associada a dor física, rigidez, disfunção motora ou sensorial e alto risco de lesão medular e acroparalisia. Assim, estratégias terapêuticas que promovam a regeneração medular eficiente nessa doença crônica e progressiva são urgentemente necessárias. Modelos de compressão da medula espinhal animal eficazes e reprodutíveis são necessários para entender o complexo mecanismo biológico subjacente ao CSM. A maioria dos modelos de lesão medular reflete condições destrutivas agudas e estruturais, enquanto os modelos animais de MSC apresentam uma compressão crônica na medula espinhal. Este trabalho apresenta um protocolo para gerar um modelo de compressão da medula espinhal de ratos, que foi posteriormente avaliado avaliando o escore comportamental e observando a região da medula espinhal comprimida. As avaliações comportamentais mostraram diminuição da incapacidade motora do monitor, incluindo movimentos articulares, capacidade de pisar, coordenação, estabilidade do tronco e força muscular dos membros. A coloração e imunocoloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou considerável apoptose neuronal na região comprimida da medula espinhal.

Introdução

Como uma doença degenerativa progressiva comum, a MSC é responsável por 5-10% de toda a espondilose cervical¹. Se os pacientes que sofrem de MSC ignorarem seus sintomas e não os tratarem de maneira oportuna e eficaz, isso pode levar a complicações graves, como lesão medular e paralisia de membros, que se deteriorariam com o envelhecimento, representando um fardo econômico e mental substancial para os pacientes e suas famílias ^2,3. A patogênese da MSC é complexa, envolvendo fatores estáticos e dinâmicos, a teoria da hipóxia-isquemia, a lesão das células endoteliais, a teoria da destruição da barreira medular sanguínea e a teoria da inflamação e apoptose 4,5,6,7.

Os mecanismos estáticos e dinâmicos de compressão na medula espinhal causam sintomas clínicos. Discos vertebrais salientes, corpos vertebrais deformados e ligamentos calcificados podem causar compressão medular prolongada, que afetará gradualmente a barreira sangue-medula espinhal e a microvasculatura local na medula espinhal ^4,8. Por sua vez, isquemia, inflamação e apoptose afetam os neurônios, axônios e células gliais ^6,9.

Os modelos animais experimentais de lesão medular incluem lesão contusiva, lesão compressiva, lesão por tração, lesão induzida por fotoquímica e lesão de isquemia-reperfusão. A maioria desses modelos também reflete algumas condições destrutivas agudas e estruturais (transecção ou toxicidade química). No entanto, esses modelos animais de MSC não podem apresentar apoptose neuronal progressiva na medula espinhal.

Este artigo descreve um protocolo detalhado para gerar um modelo de compressão da medula espinhal de ratos, que foi avaliado posteriormente avaliando o escore comportamental e observando a região comprimida da medula espinhal. Este modelo de compressão da medula espinhal de rato é um modelo animal confiável para uma investigação mais aprofundada dos mecanismos envolvidos na MSC.

Protocolo

O procedimento a seguir foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Todas as cirurgias de sobrevivência foram realizadas em condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do NIH. A dor e o risco de infecções foram tratados com analgésicos e antibióticos apropriados para garantir um resultado bem-sucedido. Este procedimento cirúrgico é otimizado para ratos machos Sprague-Dawley (SD) com 12 semanas de idade e 400 g de peso.

1. Preparação de hidrogel de poliacrilamida PVA

NOTA: Conforme mostrado na Figura 1G, 1H, o hidrogel de poliacrilamida PVA é uma folha de polímero absorvente de água. No estado natural, o gel é extremamente difícil de cortar em pedaços pequenos. A preparação é descrita a seguir.

1. Coloque um hidrogel de poliacrilamida PVA em água por 24 h para facilitar o corte após a hidratação.
2. Use uma ferramenta de corte de fabricação própria (Figura 1H) para dividir todo o hidrogel em pedaços, de tamanho 2 mm x 2 mm x 2 mm.
3. Transfira esses pedaços de hidrogel para um forno a 60 ° C por 12 h para desidratação em pequenos pedaços de 1 mm x 1 mm x 1 mm como materiais de implantação.

2. Anestesia e preparação

NOTA: Certifique-se de usar uma touca cirúrgica, máscaras médicas descartáveis e luvas cirúrgicas estéreis durante todo o processo cirúrgico estéril.

1. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento e certifique-se de que a temperatura retal seja mantida em 37±1 °C durante a anestesia.
2. Coloque o rato na câmara de anestesia cheia de isoflurano a 3% por 3 min.
3. Aperte suavemente os membros e dedos dos pés do rato com uma pinça para testar a perda da resposta de abstinência, indicando anestesia bem-sucedida.
4. Fixe o rato na mesa de operação em decúbito ventral, garantindo que os membros e a cabeça do rato estejam firmemente fixados.
5. Fixe a máscara de anestesia no rosto do rato. Administre isoflurano a 2% em uma mistura de oxigênio/ar por meio de uma máscara de nariz de rato padrão para anestesiar o rato durante a cirurgia de compressão espinhal.
6. Coloque uma gaze cilíndrica (tamanho de cerca de 30 mm x 20 mm x 60 mm) entre o rato e a mesa cirúrgica (Figura 1A) para garantir uma via aérea desobstruída e um local cirúrgico totalmente exposto durante toda a cirurgia.
7. Raspe o cabelo ao redor da área cirúrgica do pescoço do rato com um barbeador elétrico.
8. Aplique o creme depilatório para remover os pelos restantes e expor a pele.
9. Desinfete a área cirúrgica com iodóforo.
10. Cubra a área desinfetada com uma toalha estéril com um orifício expondo apenas a área cirúrgica no lado dorsal do pescoço do rato.

3. Abordagem cirúrgica

1. Faça uma incisão longitudinal na linha média dorsal com bisturi do segundo processo espinhoso cervical para o segundo processo espinhoso torácico, após o posicionamento percutâneo do segundo processo espinhoso cervical e do segundo processo espinhoso torácico.
2. O Blunt separa os músculos de ambos os lados com pinças hemostáticas para expor a lâmina C2-T2 após o corte do tecido subcutâneo e da fáscia camada por camada.
3. Faça um furo (1 mm x 1 mm) no laminar cervical (Figura 1B).
   NOTA: Para evitar lesões excessivas na medula espinhal, certifique-se de que o pescoço do rato seja mantido em um estado de arco dorsal, permitindo espaço suficiente entre as lâminas cervicais.
4. Use uma pinça microcirúrgica para agarrar um pedaço de hidrogel de poliacrilamida PVA do tamanho de 1 mm x 1 mm x 1 mm e insira-o no orifício previamente perfurado (Figura 1C, 1D).
   NOTA: O desempenho de contração transitória indica que o modelo de compressão da medula espinhal foi estabelecido com sucesso.
5. Suturar os tecidos musculares, fáscias, subcutâneos e cutâneos, camada por camada, usando agulhas triangulares e sutura 5-0.
6. Após a desinfecção, transfira os animais de volta para a gaiola e mantenha-os aquecidos.
7. Injete analgesia por cloridrato de buprenorfina por via subcutânea (0,03 mg/kg) a cada 6 h por 3 dias após a cirurgia e conforme necessário após isso.

4. Manejo pós-operatório

1. Injete o equivalente a 100.000 unidades de penicilina por via intraperitoneal nos ratos uma vez ao dia para prevenir infecções pós-operatórias e aliviar a dor.
2. Transfira os ratos para novas gaiolas que foram continuamente aquecidas com uma lâmpada infravermelha para garantir a preservação adequada do calor no pós-operatório.
   NOTA: Remova a lâmpada de aquecimento depois que a consciência do rato for restaurada
3. Mantenha a higiene e ventilação da gaiola de alimentação do rato.
4. Ajude os ratos a comer e beber duas vezes ao dia. Se necessário, administre uma massagem na bexiga para ajudar na micção até que a função urinária seja restaurada.

5. Avaliação comportamental

1. Use a escala de classificação de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) para avaliar o comportamento pós-operatório.
   NOTA: A escala de classificação BBB é um padrão-ouro (Tabela 1) usado para avaliar a função relacionada à medula espinhal em ratos. Ele avalia o movimento dos ratos de acordo com pontuações que variam de 0 (nenhum movimento do membro posterior foi observado) a 21 (coordenação da marcha, consistência do espaço do dedo do pé, posição da garra principal paralela em toda a postura, estabilidade consistente do tronco e elevação consistente da cauda).

6. Teste de força de preensão

1. Use um medidor eletrônico de força de preensão para medir a força de preensão.
2. Pegue a metade inferior do rato para suspendê-lo e permitir que ele agarre a haste de metal do medidor de aderência frontal.
3. Quando o rato agarrar a haste de metal, puxe-a e registre a força de preensão.
4. Meça a força de preensão três vezes para cada rato e registre a pontuação mais alta.

7. Teste de placa inclinada

1. Coloque o rato em uma placa de borracha com um ângulo ajustável.
2. Aumente gradualmente o ângulo da placa inclinada em 5° de cada vez até que o rato consiga se equilibrar e permanecer firme por 5 s.
3. Registre o ângulo máximo em que o rato pode se equilibrar na placa inclinada.
4. Meça o ângulo máximo três vezes para cada rato e registre a pontuação mais alta.

8. Eutanásia, separação da medula espinhal e incorporação congelada

NOTA: Certifique-se de que óculos de proteção e proteção facial/máscara apropriados sejam usados para proteger os olhos, rosto e trato respiratório do paraformaldeído e do gás formaldeído.

1. Injete o equivalente a 10% de hidrato de cloral por via intraperitoneal para anestesiar os ratos antes de abrir o esterno para expor o coração.
2. Insira uma agulha de perfusão no ápice do coração, fixe-a com uma pinça hemostática e infunda lentamente com solução salina normal.
3. Faça um orifício no apêndice atrial direito até que a solução salina normal limpa saia do átrio direito, indicando uma infusão bem-sucedida.
4. Pare a perfusão salina normal depois que o fígado ficar branco.
5. Infundir com um equivalente a 10% de paraformaldeído até que o corpo do rato fique rígido.
6. Após a perfusão do paraformaldeído, remova a pele, os músculos e os tecidos moles ao redor da coluna; separar o segmento C2-C7 da coluna cervical; e mergulhe-o em paraformaldeído a 10% para fixação durante a noite.
7. Separe a medula espinhal cervical da coluna e coloque-a em um gradiente de concentração de soluções de sacarose de 10%, 20% e 30% para desidratação gradual.
8. Transferir a medula espinhal comprimida de 2 mm de altura juntamente com um agente de inclusão OCT para um congelador a -80 °C.
9. Após o corte em fatias de 7 μm de espessura e coloração (coloração H & E e marcação de extremidade de corte dUTP (TUNEL) / núcleos neuronais (NeuN), consulte a seção 9), observe a histopatologia da medula espinhal e da apoptose neuronal, respectivamente.

9. Imunocoloração TUNEL/NeuN

1. Mergulhe as seções da medula espinhal em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida, bloqueie com solução de PBS contendo 0,3% de Triton X-100 e 5% de albumina de soro bovino (BSA) por 1 h.
2. Incubar as secções da medula espinal com um anticorpo policlonal anti-NeuN de coelho (diluído a 1:200;) durante a noite a 4 °C.
3. Enxágue as seções da medula espinhal três vezes em PBS. Posteriormente, incubar com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 594 por 2 h em temperatura ambiente.
4. Execute o kit de ensaio de apoptose TUNEL de uma etapa (fluorescência verde) para corar os núcleos apoptóticos das seções da medula espinhal.

Resultados

A lesão compressiva da medula espinhal pode levar à incapacidade neuromuscular nos membros
À medida que o pedaço de hidrogel se expande gradualmente, ele comprime persistentemente a região da medula espinhal por um período prolongado, o que simula as incapacidades do membro anterior induzidas por doenças da medula espinhal cervical ^8,10. No modelo atual, foi observada considerável contratura ipsilateral da pata dianteira na maioria dos ratos (...

Discussão

O objetivo deste procedimento cirúrgico era gerar apoptose neural prolongada e reprodutível na medula espinhal de ratos. Uma das principais vantagens desse modelo é que os implantes de hidrogel expansível fornecem uma compressão prolongada na medula espinhal, levando a uma resposta apoptótica neural progressiva (Figura 2C), que é consistente com o processo patológico da MSC. No presente estudo, a mortalidade por lesão medular foi extremamente baixa (~ 2 em 5...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pomada			Previne a infecção da ferida
Buprenorfina-SR			Alívio da dor
Isoflurano	Veteasy		Anestesia
		anestesia inalante	Anestesia
Micro fórceps oftálmica	Equipamento médico Mingren	Comprimento: 11 cm, Diâmetro da cabeça: 0,3 mm	Prenda o músculo
Fórceps oftálmico	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fábrica de instrumentos cirúrgicos	JD1050	Clipe a pele
Tesoura oftálmica (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fábrica de instrumentos cirúrgicos	Y00030	Incisão na pele
SD ratos machos Shanghai	SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Modelo animal
Lâminas cirúrgicas estéreis (22 #)	Fornecedor verificado - Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Incisão muscular
Aparador			Depilação
Creme de depilação Veet	RECKITT BENCKISER (Índia) Ltd		Depilação
Venus tesouras	Mingren equipamento médico	Comprimento: 12,5 cm	Incisão muscular

antibiótica Equipamento de de pequenos animais