Artigo de método
Este protocolo para marcação imunofluorescente de proteínas de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de insetos excisados pode ser usado para estudar interações entre vírus e insetos vetores, funções de proteínas de insetos e mecanismos moleculares subjacentes à transmissão de vírus.
A maioria dos vírus de plantas na natureza é transmitida de uma planta para outra por insetos hemípteros. Uma alta densidade populacional de insetos vetores, que são altamente eficientes na transmissão do vírus, desempenha um papel fundamental nas epidemias de vírus nos campos. O estudo das interações vírus-insetos vetoriais pode avançar na compreensão da transmissão de vírus e epidemias com o objetivo de desenhar novas estratégias para controlar vírus de plantas e seus insetos vetores. A marcação por imunofluorescência tem sido amplamente utilizada para analisar interações entre patógenos e hospedeiros e é usada aqui na cigarrinha-de-dorso-branco (WBPH, Sogatella furcifera), que transmite eficientemente o vírus anão estriado do arroz do sul (SRBSDV, gênero Fijivirus, família Reoviridae), para localizar os virions e proteínas de insetos nas células epiteliais do intestino médio. Usando microscopia confocal de varredura a laser, estudamos as características morfológicas de células epiteliais do intestino médio, a localização celular de proteínas de insetos e a colocalização de virions e uma proteína de inseto. Este protocolo pode ser usado para estudar atividades virais em insetos, funções de proteínas de insetos e interações entre vírus e inseto vetor.
A maioria dos vírus de plantas descritos é transmitida por insetos da ordem Hemiptera que inclui pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes 1,2. As partes bucais sugadoras de insetos hemípteros perfuram o tecido vegetal para alimentação e secreção de saliva, concomitantemente transmitindo eficientemente o vírus2. Diferentes mecanismos de transmissão de vírus de plantas por insetos vetores têm sido descritos. Estes incluem não persistente, semipersistente e persistente. O tipo persistente é não propagativo ou propagativo3,4, mas para ambos os tipos....
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1. Criação de insetos não virulíferos
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A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição do vírus, excisão do intestino, marcação por imunofluorescência e confecção da lâmina.
Intestinos WBPH excisados de adultos foram fixados em paraformaldeído a 4% (m/v), permeabilizados com Triton X-100 a 2% (v/v) e, em seguida, incubados com faloidina Dylight 63310,18. A micrografia confocal de varredura a laser na
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Para melhores resultados, alguns pontos-chave devem ser considerados. Primeiro, uma alta proporção de insetos virulíferos entre a população total é necessária. Embora o AAP mínimo para SRBSDV por ninfas e adultos WBPH seja de 5 min17, os insetos devem ser autorizados a se alimentar de plantas de arroz frescas infectadas com SRBSDV por 2 d para alcançar uma eficiência de aquisição de até 80%. Como os virions SRBSDV podem ser detectados em 80% dos intestinos médios18, nós exc.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630058 para X.W. e 31772134 para W.L.).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Albumina de soro de touro a 3% (BSA) | Coolaber | SL1331 | Anticorpos diluídos |
| Vidro de cobertura | Solarbio | YA0771-18 * 18mm | Para fabricação |
| de lâminas Microscópio de dissecação | Beitja | XTL-7045B1 | Para dissecação de insetos |
| Microscópio confocal de varredura a laser | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe o sinal de fluorescência |
| Lâminas de microscópio | Solarbio | ZBP-7105 | Para fabricação de lâminas |
| Meio de montagem com 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Abcam | AB104139 | Rótulo celular necleus |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127 | Para fixação de tecidos |
| Faloidina | Invitrogen | A22284 | Rótulo de actina de epitiels do intestino médio |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | Para permeação de tecidos |
| Pinças (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | Para dissecção de insetos |
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