Usando Baseplating e um Miniscópio Pré-ancorado com uma Lente Objetiva para Pesquisa Transiente de Cálcio em Camundongos

Resumo

O encolhimento do cimento dentário durante a cura desloca a placa de base. Este protocolo minimiza o problema, criando uma base inicial do cimento dentário que deixa espaço para cimentar a placa de base. Semanas depois, a placa de base pode ser cimentada em posição neste andaime usando pouco cimento novo, reduzindo assim o encolhimento.

Resumo

Os neurocientistas usam microscópios em miniatura (miniscópios) para observar a atividade neuronal em animais que se comportam livremente. A equipe do Miniscope da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA) fornece recursos abertos para que os pesquisadores construam miniscópios eles mesmos. O V3 UCLA Miniscope é um dos miniscópios de código aberto mais populares atualmente em uso. Ele permite a imagem dos transientes de fluorescência emitidos por neurônios geneticamente modificados através de uma lente objetiva implantada no córtex superficial (um sistema de uma lente), ou em áreas cerebrais profundas através de uma combinação de uma lente de relé implantada no cérebro profundo e uma lente objetiva que é pré-ancorada no miniscópio para observar a imagem retransmitida (um sistema de duas lentes). Mesmo em condições ideais (quando os neurônios expressam indicadores de fluorescência e a lente de relé foi implantada adequadamente), uma mudança de volume do cimento dentário entre a placa de base e sua fixação ao crânio após a cura do cimento pode causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando na má qualidade da imagem. Uma placa de base é uma placa que ajuda a montar o miniscópio no crânio e fixa a distância de trabalho entre as lentes objetiva e de relé. Assim, mudanças no volume do cimento dentário ao redor da placa de base alteram a distância entre as lentes. O presente protocolo tem como objetivo minimizar o problema de desalinhamento causado por alterações de volume no cimento dental. O protocolo reduz o desalinhamento construindo uma base inicial de cimento dentário durante o implante da lente de relé. O tempo de convalescença após a implantação é suficiente para a fundação do cimento dentário curar completamente a placa de base, de modo que a placa de base possa ser cimentada neste andaime usando o mínimo de cimento novo possível. No presente artigo, descrevemos estratégias de baseplating em camundongos para permitir a imagem da atividade neuronal com uma lente objetiva ancorada no miniscópio.

Introdução

Os repórteres de atividade fluorescente são ideais para a imagem da atividade neuronal, pois são sensíveis e apresentam grandes amplitudes dinâmicas ^1,2,3. Portanto, um número crescente de experimentos está utilizando microscopia de fluorescência para observar diretamente a atividade neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15

Protocolo

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Nacional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Taiwan (Nº de Aprovação: NTU-109-EL-00029 e NTU-108-EL-00158).

1. Avaliação da alteração volêmica do cimento dentário

NOTA: Alterações no volume de cimento dental ocorrem durante o processo de cura. Testar as alterações de volume do cimento dentário antes da implantação e baseplating. Os pesquisadores podem testar qualquer marca de cimento dental e usar a marca com a menor mudança de volume para cimentar a placa de base. Um exemplo é mostr....

Resultados

Avaliação da alteração do volume de cimento dentário
Uma vez que o volume de cimento dentário muda durante o processo de cura, pode impactar significativamente a qualidade da imagem, uma vez que a distância de trabalho de uma lente GRIN é de aproximadamente 50 a 350 μm ^4,8. Portanto, dois cimentos dentários comercialmente disponíveis foram testados neste caso, Tempron e Tokuso, antes do procedimento de implantação e baseplating (

Discussão

O presente relatório descreve um protocolo experimental detalhado para pesquisadores que usam o sistema UCLA Miniscope de duas lentes. As ferramentas projetadas em nosso protocolo são relativamente acessíveis para qualquer laboratório que deseje experimentar imagens de cálcio in vivo. Alguns protocolos, como injeção viral, implantação de lentes, baseplating fictício e baseplating, também podem ser usados para outras versões do sistema miniscópio para melhorar a taxa de sucesso da imagem de cálcio. Além dos probl.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Broca de 0,7 mm	#19008-07	Ferramentas de Ciência Fina; EUA	para cirurgia
0.1– 10 μ l ponteiras de pipeta	104-Q; QSP	Fisher Científico; Cingapura	para testes de cimento dentário
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tóquio, Japão	para cirurgia
agulha 27 G	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tóquio, Japão	para cirurgia
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1,5*10^13	Addgene preparação viral; MA, EUA	para injeção viral
Sulfato de atropina		Astart; Hsinchu, Taiwan	para cirurgia/baseplating fictícia/baseplating
Placa de base	V3	http://miniscope.org	para baseplating fictícia/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, EUA	Argila adesiva reutilizável; para cirurgia/baseplating fictícia/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Alemanha,	para a fixação de base
Buprenorfina		INDIVIOR; Reino Unido	para cirurgia
Carprofeno	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevenir infecções
PCB de aquisição de dados para UCLA Miniscope	comprado em https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		para revestimento de base
Conjunto de cimento odontológico	Tempron	GC Corp; Tóquio, Japão,	para testar cimento dentário
Conjunto de cimento dentário	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tóquio, Japão	para testes de cimento/cirurgia/baseplating fictício/baseplating
Dual Lab Standard com Adaptadores de Rato e Rato	#51673	Stoelting Co; Illinois, EUA	para cirurgia/baseplating simulado/baseplating
Pomada		Alcon; Genebra, Suíça	para cirurgia/baseplating fictícia/baseplating
Ibuprofeno		YungShin;	Analgesia
Isoflurano		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	para cirurgia/baseplating fictício/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	para comparação com V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	para eutanásia
Solução salina			para cirurgia
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Alemanha	para implantação de lentes
Microsseringas de Microlitros, 2.0 µ L, calibre 25	# 88400	Hamilton; Bonaduz, Suíça	para moldagem por injeção viral
de borracha de silicone	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Itália	placa de base fictícia
	#64519	Edmund Optics; NJ, EUA	para baseplating fictício / baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, EUA	para revestimento de base fictício
Sucção Portátil	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	para cirurgia
Relé Lente GRIN	# 1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, EUA	para revestimento de base fictício/revestimento de base
Parafusos de ancoragem de aço inoxidável	1,00 mm de diâmetro, comprimento total 3,00 mm		para cirurgia
Microscópio estéreo	#SL720	Sage Vison; Nova cidade de Taipei, Taiwan	para cirurgia/baseplating fictícia/baseplating
Aparelho estereotáxico	#51673	Stoelting; IL, EUA	para cirurgia/baseplating fictício/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Dü sseldorf, Alemanha	para teste de cimento dentário
V3 UCLA Miniscope	comprado em https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		para cirurgia/baseplating fictício/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	para eutanásia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Sö dertä lje, Suécia	para cirurgia

Duratear de Taiwan normal para a lente de índice de gradiente objetivo (GRIN) de