O presente estudo relata um protocolo de triagem cromossômica de embriões humanos que utiliza meio de cultura usado, o que evita a biópsia embrionária e permite a identificação de ploidia cromossômica usando NGS. O presente artigo apresenta o procedimento detalhado, incluindo a preparação do meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA), preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise dos dados.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Aviso de errata
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumo
Resumo
Na fertilização clínica in vitro (FIV), o método predominante para PGT-A requer biópsia de algumas células do trofectoderma (TE). Esta é a linhagem que forma a placenta. Esse método, no entanto, requer habilidades especializadas, é invasivo e sofre de falsos positivos e negativos porque os números cromossômicos no ET e a massa celular interna (MCI), que se desenvolve no feto, nem sempre são os mesmos. O NICS, uma tecnologia que requer o sequenciamento do DNA liberado no meio de cultura tanto do TE quanto do ICM, pode oferecer uma saída para esses problemas, mas já demonstrou ter eficácia limitada. O presente estudo relata o protocolo completo do NICS, que inclui métodos de amostragem em meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA) e preparação de bibliotecas, e análise de dados NGS por software de análise. Considerando os diferentes tempos de criopreservação em diferentes laboratórios de embriões, os embriologistas possuem dois métodos de coleta de meio de cultura embrionário que podem ser selecionados de acordo com as condições reais do laboratório de FIV.
Introdução
As tecnologias de reprodução assistida (TARA) têm sido cada vez mais utilizadas para o tratamento da infertilidade. No entanto, a taxa de sucesso da TARV, como a FIV, tem sido limitada, e a taxa de perda gestacional é significativamente maior do que a da população normal1. A principal causa desses problemas são as anormalidades cromossômicas, comumente existentes em embriões humanos pré-implantacionais2. A PGT-A é um método eficaz de triagem de embriões para equilíbrio cromossômico antes da implantação 3,4. Alguns estudos comprovaram que a PGT-A pode reduzir a ta....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
A permissão ética foi obtida do Comitê de Ética do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim.
1. Preparo
NOTA: Os materiais e equipamentos necessários estão listados na Tabela de Materiais.
- Reagentes
- Pré-aquecer e equilibrar (balanceado) 20-30 μL de meio gameta/meio de fertilização e meio de cultura de clivagem/blastocisto (coberto com óleo mineral) e hialuronidase (em um tubo bem tampado) a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O2 em uma incubadora Tri-gás durante a noite antes do uso.
- Pré-aqueça a hialuronidase a 37 °C numa superfície de trabalho num exaustor.<....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O presente estudo aplicou o método proposto em um paciente. A aprovação do IRB e o consentimento informado foram obtidos antes da aplicação da análise NICS. O presente estudo obteve 6 blastocistos de pacientes e realizou NICS em todos os 6 embriões no meio do dia 4 ao dia 5. Anormalidades cromossômicas causadas pela translocação balanceada dos pais foram detectadas em cinco cromossomos com o ensaio NICS; portanto, não puderam ser utilizados para transferência (Figura 4A-E). .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Modificações e solução de problemas
Se os resultados do NICS estiverem contaminados com materiais genéticos parentais, certifique-se de que todas as células cumulus-corona radiata sejam removidas e certifique-se de que a ICSI seja realizada para fertilização. Evitam-se processos inadequados de armazenamento de meios ou preparação de moldes, o que pode degradar o DNA. O espaço de trabalho foi cuidadosamente purificado com reagentes de descontaminação DNase e RNase. Para evitar .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang e Sijia Lu são funcionários da Yikon Genomics Co., Ltd.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Shiping Bo e Shujie Ma por sua assistência na análise de dados NGS. Financiamento: este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Processo Nº 2018YFC1003100).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo EP de 1,5 mL, tubo de PCR de 0,2 mL | Axygen | MCT-150-C, PCR 02-C | DNase/RNase free, tubos de PCR de baixa ligação e tubos de microcentrífuga de 1,5 mL são recomendados. |
| 10 µ L, 200 µ L, 1000 µ L DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | Isso pode ser substituído por outra marca/Para transferência de amostra |
| 100% etanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para purificação de biblioteca de DNA |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst kit de preparação de biblioteca | Para amplificação de biblioteca |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Estéreis | BD Bioscience | 363037 | Podem ser substituídos por outra marca/Para cultura de embriões |
| BD Falcon Pratos de cultura de tecidos (Easy Grip), Estéril | BD Bioscience | 353001 | Pode ser substituído por outra marca/Para cultura de embriões |
| BD Falcon Pratos de cultura de tecidos, Estéril | BD Bioscience | 353002 | Pode ser substituído por outra marca/Para cultura de embriões |
| Tampão de lise celular | Yikon Reagente Genômico | no NICSInst kit de preparação da biblioteca | para pré-tratamento do meio de cultura |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent no NICSnst kit de preparação da biblioteca | para pré-tratamento do meio de cultura |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Análise | |
| de dados CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst kit de preparação da biblioteca | para purificação da biblioteca |
| Sistema aberto Cryotop | KITAZATO BioPharma | 81110 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para vitrificação de embriões |
| Destila água | Yikon Genomics | Reagent in NICSnst kit de preparação de biblioteca | Para dissolver |
| DNA ES (kit de vitrificação) | KITAZATO BioPharma | Kit de inVitrificação de reagentes | Pode ser substituído por outra marca/Para vitrificação de embriões |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | Pode ser substituído por outra marca/Para |
| solução de hialuronidase ICSI, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | Pode ser substituído por outra marca/Digest oócito-corona-cumulus complexo |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para ICSI |
| Illumina MiSeq® Sistema | Illumina | SY-410-1001 | Para sequenciamento de biblioteca |
| Incubadora | Labotect | Inkubator C16 | Isso pode ser substituído por outra marca / Para cultura de embriões |
| Tampão de biblioteca | Reagente genômico Yikon | em NICSnst kit de preparação de biblioteca | para amplificação de biblioteca |
| Biblioteca Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent em NICSInst kit de preparação de biblioteca | para biblioteca Suporte magnético amplificaton |
| DynaMagTM-2 | 12321D | para microscópio de purificação de biblioteca | |
| OLYMPUS | 1X71 | Isso pode ser substituído por outra marca/para observação de embriões | |
| Mini-centrífuga | ESSENSCIEN | ELF6 | Para separação |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent em NICSInst kit de preparação de biblioteca | para pré-tratamento de meio de cultura |
| Kit de preparação de biblioteca NICSInst | Yikon Genomics | KT1000800324 | Amplificação do genoma completo e construção de biblioteca |
| Estação de Preparação de Amostras NICSInst | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificar DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | Pode ser substituído por outra marca/Para lavagem de embriões e cultura de blastocisto |
| Pipeta | Pasteur Oirgio | MXL3-IND-135 | Isso pode ser substituído por outra marca / Para pipetas Pasteur de tansfer de embriões |
| ORIGIO | PP-9-1000 | Isso pode ser substituído por outra marca / Para laboratório de fertilização in vitro | |
| Pre-Lib Buffer | Yikon | Genomics Reagent no NICSInst kit de preparação da biblioteca | Preparação pré-biblioteca |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent no NICSInst kit de preparação da biblioteca | Preparação pré-biblioteca |
| Qubit® 3.0 Fluorômetro | Thermo Scientific | Q33216 | Para quantificação de biblioteca |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | Para cultura em estágio de blastocisto embrionário |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para cultura em estágio de clivagem embrionária |
| Quinn's Advantage Fertilization Médio | SAGE | ART-1020 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para fertilização de oócitos e espermatozóides |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium com HEPES | SAGE | ART-1023 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para embrião clutrure |
| Kit de substituição de proteína de soro SPS Quinn's Advantage | SAGE ART-3010 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para desnudar o oócito | |
| Quinn's Advantage Óleo mineral de cultura de tecidos | SAGE | ART-4008P | Isso pode ser substituído por outra marca/Para cobrir o meio de cultura |
| PONTAS DE STRIPPER | ORIGIO | MXL3-IND-135 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para desnudar células da granulosa |
| Vitrificação Cryotop Sistema aberto | KIZTAZATO | 81111 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para vitrificação de embriões |
| Kit | de vitrificação KITAZATO BioPharma | VT101 | Isso pode ser substituído por outra marca/Para vitrificação de embriões |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Mistura de amostras |
| VS (kit de vitrificação) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | Este pode ser substituído por outra marca/Para vitrificação embrionária |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASSE 1 | laser Este pode ser substituído por outra marca/Para colapso de blastocele artificial |
Referências
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.
