Summary
Способность точно обнаруживать компоненты нервно-мышечного соединения имеет решающее значение при оценке изменений в его архитектуре из-за патологических процессов или процессов развития. Здесь мы представляем полное описание простого метода получения высококачественных изображений цельномонтных нервно-мышечных соединений, которые могут быть использованы для выполнения количественных измерений.
Abstract
Нервно-мышечное соединение (NMJ) является специализированной точкой контакта между двигательным нервом и скелетной мышцей. Этот периферический синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность. При многочисленных расстройствах нервной системы NMJ является ранней патологической мишенью, приводящей к сбою нейротрансмиссии, слабости, атрофии и даже к гибели мышечных волокон. Благодаря своей актуальности, возможность количественно оценить определенные аспекты взаимосвязи между компонентами NMJ может помочь понять процессы, связанные с его сборкой/разборкой. Первым препятствием при работе с мышцами является получение технической экспертизы для быстрого выявления и рассечения без повреждения их волокон. Вторая проблема заключается в использовании высококачественных методов обнаружения для получения изображений NMJ, которые могут быть использованы для выполнения количественного анализа. В данной статье представлен пошаговый протокол рассечения разгибателя digitorum longus и камошистых мышц у крыс. Это также объясняет использование иммунофлуоресценции для визуализации пред- и постсинаптических элементов цельномонтных NMJ. Полученные результаты демонстрируют, что этот метод может быть использован для установления микроскопической анатомии синапса и выявления тонких изменений в состоянии некоторых его компонентов при физиологических или патологических состояниях.
Introduction
Нервно-мышечное соединение млекопитающего (NMJ) представляет собой большой холинергический трехсторонний синапс, состоящий из нервного окончания двигательного нейрона, постсинаптической мембраны на скелетно-мышечном волокне и концевые шванновские клетки1,2,3. Этот синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность4,5,6,7,8даже во взрослом возрасте, когда NMJ могут подвергаться динамическим структурным модификациям. Например, некоторые исследователи показали, что двигательные нервные окончания постоянно меняют свою форму на микрометровом масштабе9. Также сообщалось, что морфология NMJ реагирует на функциональные требования, измененное использование, старение, физические упражнения или изменения в двигательной активности4,10,11,12,13,14,15. Таким образом, тренировка и отсутствие использования представляют собой существенный стимул для изменения некоторых характеристик NMJ, таких как его размер, длина, дисперсия синаптических везикул и рецепторов, а также ветвление нервных терминалов14,16,17,18,19,20.
Кроме того, было показано, что любое структурное изменение или дегенерация этого жизненно важного соединения может привести к гибели клеток двигательных нейронов и атрофии мышц21. Также считается, что измененная связь между нервами и мышцами может быть ответственна за физиологические возрастные изменения NMJ и, возможно, за его разрушение в патологических состояниях. Демонтаж нервно-мышечного соединения играет решающую роль в возникновении бокового амиотрофического склероза (БАС), нейродегенеративного заболевания, которое представляет собой один из лучших примеров нарушения взаимодействия мышц и нервов3. Несмотря на многочисленные исследования, проведенные по дисфункции двигательных нейронов, до сих пор обсуждается, происходит ли ухудшение, наблюдаемое при БАС, из-за прямого повреждения двигательного нейрона, а затем распространяется на кортико-спинальные проекции22; или если его следует рассматривать как дистальную аксонопатию, при которой дегенерация начинается в нервных окончаниях и прогрессирует в сторону двигательных нейронов сомы23,24. Учитывая сложность патологии БАС, логично считать, что происходит смешение самостоятельных процессов. Поскольку NMJ является центральным игроком в физиопатологическом взаимодействии между мышцами и нервами, его дестабилизация представляет собой ключевую точку в происхождении заболевания, которая имеет отношение к анализу.
Нервно-мышечная система млекопитающего функционально организована в дискретные двигательные единицы, состоящие из двигательного нейрона и мышечных волокон, которые исключительно иннервируются его нервным концом. Каждый двигательный блок имеет волокна со сходными или идентичными структурно-функциональными свойствами25. Селективный набор двигательных нейронов позволяет оптимизировать реакцию мышц на функциональные требования. Теперь ясно, что скелетные мышцы млекопитающих состоят из четырех различных типов волокон. Некоторые мышцы названы в соответствии с характеристиками их наиболее распространенного типа волокон. Например, камбала (задняя мышца задней конечности, участвующей в поддержании осанки тела) несет на себе большинство медленно дергающихся единиц (тип 1) и распознается как медленная мышца. Вместо этого экстензор digitorum longus (EDL) по существу состоит из блоков с аналогичными свойствами быстрого подергивания (волокна типа 2) и известен как быстрая мышца, специализированная для фазовых движений, необходимых для передвижения. Другими словами, хотя взрослые мышцы пластичны по своей природе из-за гормональных и нервных влияний, их состав волокон определяет способность выполнять различные виды деятельности, как видно на камбале, которая испытывает непрерывную низкоинтенсивную активность, и EDL, которая демонстрирует более быстрое одиночное подергивание. Другие признаки, которые варьируются среди различных типов мышечных волокон, связаны с их структурой (содержание митохондрий, расширение саркоплазматического стикулума, толщина линии Z), содержанием АТФазы миозина и составом тяжелой цепи миозина26,27,28,29.
Для NMJ грызунов существуют значительные различия между мышцами28,29. Морфометрический анализ, проведенный в камбуше и EDL у крыс, выявил положительную корреляцию между синаптической областью и диаметром волокна (т. Е. Синаптическая область в медленных волокнах камбуша больше, чем в быстрых волокнах EDL), но соотношение между площадью NMJ и размером волокна одинаково в обеих мышцах30,31. Кроме того, по отношению к нервным окончаниям абсолютные области концевой пластины в волокнах типа 1 были ниже, чем в волокнах типа 2, тогда как нормализация по диаметру волокна сделала области нервных окончаний в волокнах типа 1 самыми большими32.
Тем не менее, очень немногие исследования сосредоточены на морфометрическом анализе, чтобы показать доказательства изменений в некоторых компонентах NMJ33,34. Таким образом, в связи с актуальностью НМЮ в функции организма, морфология и физиология которого изменяются при различных патологиях, важно оптимизировать протоколы рассечения разных типов мышц с достаточно качественным качеством, позволяющим визуализировать всю структуру НМЮ. Также необходимо оценить возникновение пред- или постсинаптических изменений в различных экспериментальных ситуациях или состояниях, таких как старение или физические упражнения35,36,37,38. Кроме того, может быть полезно провести более тонкие изменения в компонентах NMJ, такие как измененное фосфорилирование нейрофиламента в терминальных нервных окончаниях, как сообщается в ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с руководящими принципами Национального закона No 18611 об уходе за животными, используемыми в экспериментальных целях. Протокол был одобрен Институциональным этическим комитетом (CEUA IIBCE, Протокол No 004/09/2015).
1. Рассечение мышц (День 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом делайте 40 мл 0,5% параформальдегида (PFA), pH 7,4 в фосфатном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS). Опционально сделайте 20 мл 4% PFA. Приготовить 5 мл аликвот и заморозить при -20 °C. В день рассечения разморозьте 4% аликвот и добавьте 35 мл DPBS для получения 40 мл 0,5% PFA.
-
Изоляция EDL (быстро дергающихся мышц)
- Усыпить крысу. Поместите животное брюшком вверх. Сделайте начальный разрез с помощью хирургического лезвия между ноликами по направлению к задней конечности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае для эвтаназии крысы была введена внутрибрюшинная инъекция 90: 10 мг / кг кетамина: ксилазина, но также разрешены другие варианты анестезии. - Снимите кожу, потянув ее вверх до тех пор, пока колено крысы не обнажится.
- Чтобы найти EDL, следуйте за сухожилиями стопы до кольцевой связки. Эта связка обвоюет два сухожилия. Отрежьте связку между двумя сухожилиями однополосными ножницами (или аналогичными). Определите сухожилие EDL, подняв оба и выберите тот, который заставляет носки двигаться вверх.
- Обрежьте сухожилие однополосными ножницами. Затем, удерживая сухожилие тонким биологическим пинцетом, начните медленно отделять мышцу EDL от передней большеберцовой части, передней части большеберцовой, передней и длинной передней части(см. Рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышца отделена без каких-либо повреждений. Сделайте это, разрезав остальные боковые мышцы, чтобы открыть путь между ними (EDL не имеет поверхностного расположения), удерживая и поднимая мышцу EDL. - Чтобы полностью изолировать мышцу, отрежьте сухожилие, прикрепленное к колену крысы, однополосными ножницами.
- Погрузить рассеченную мышцу в 5 мл 0,5% ПФА и оставить на 24 ч при 4 °C. По желанию скрепите мышцу в куске картона и поверните ее мышцей вниз. Затем полностью погрузить его в 8 мл фиксаторного раствора. Этот шаг помогает в поддержании мышцы удлиненной во время процесса фиксации.
- Усыпить крысу. Поместите животное брюшком вверх. Сделайте начальный разрез с помощью хирургического лезвия между ноликами по направлению к задней конечности.
-
Выделение камбалы (медленно дергающихся мышц)
- Переверните животное (брюшко теперь обращено вниз). Через кожу разрезают сухожилие велотряной кисти хирургическим лезвием.
- С помощью биологического пинцета и однополосных ножниц отделяют икроножную мышцу от костей, создавая «мышечное веко». Камбоя будет находиться на внутренней стороне мышечного укупочной крышки. Его можно идентифицировать, потому что он красного цвета и имеет плоскую морфологию.
- С помощью пары биологических пинцетов достигните и поднимите камбовидное сухожилие, которое лежит над икроном (см. Рисунок 1B).
- Обрежьте сухожилие однополосными ножницами. Поднимите всю мышцу, разрезая некоторые слабые точки крепления (т.е. нервно-сосудистые элементы). Наконец, чтобы полностью освободить камбарусную мышцу, отрежьте камушную фасцику, которая образует сухожилие в цокольной кике, однополосными ножницами.
- Повторите шаг 1.1.6, чтобы исправить рассеченную камошвую мышцу.
2. Приготовление дразнить клетчатку (День 2)
- После 24 ч фиксации промыть мышцы 6 мл раствора DPBS 3x в течение 10 мин каждый перед выделением мышечных волокон.
- Чтобы изолировать волокна, поместите мышцу на слайд микроскопа. Используя стереомикроскоп, аккуратно удерживайте одно из сухожилий одной парой биологических пинцетов. Затем, с помощью других биологических пинцетов, начните медленно защемлять сухожилие, чтобы отделить мышечные волокна. После этого медленно потяните защемленную ткань вверх к противоположному мышечному сухожилию. Необходимо будет повторить это действие несколько раз до получения нескольких небольших, изолированных пучков.
- Поместите их аккуратно на предварительно обработанную горку (силанизированную). Необходимо держать все волокна в порядке, чтобы они не перекрывались. В этот момент высушите волокна на воздухе в течение 24 ч.
3. Иммунофлуоресценция
-
Первичная инкубация антител (День 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполнялись при комнатной температуре, если не указано иное. Наиболее эффективным способом удаления различных растворов без отсоединения волокон от слайда является использование инсулинового шприца.- Чтобы начать процесс иммуноокрашивания, окружите высушенные изолированные мышечные волокна пап-ручкой, чтобы создать водонепроницаемый барьер.
- Чтобы увлажнить мышечные волокна, добавьте 200 мкл дистиллированной воды в течение 5 минут, а затем замените воду на 200 мкл DPBS в течение следующих 5 минут инкубации. В этот момент начинают иммунофлуоресцентную маркировку.
- Инкубировать волокна с 300 мкл блокирующего буфера (BB), содержащего 50 мМ глицина, 1% BSA и 1% Triton X-100 в течение 30 мин.
- Заменить BB первичным антителом в концентрации, предложенной производителями. Используйте BB для разбавления антитела. В этом эксперименте использовали 400 мкл SMI 32 или SMI 31, которые распознавали нефосфорилированный (Nf) или фосфорилированный (Phos-Nf) нейрофиламент H при разведении 1/800 для обнаружения пресинаптического компонента NMJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая решение о признании всего пресинаптического элемента вместо оценки фосфорилирования нейрофиламента, выберите антитела против синапсина, синаптофизина или SV2a, которые ранее успешно использовались. - Инкубируют волокна с первичным разведением антител при 4 °C в течение ночи (необязательно инкубацию можно проводить при 37 °C в течение 1 ч). В обоих случаях важно будет выполнить инкубацию с использованием влажной камеры.
-
Иммунофлуоресценция: вторичная инкубация антител (день 4)
- Удалите первичное антитело и промойте волокна 3 раза в течение 10 мин каждый с 500 мкл DPBS и последний раз с BB.
- Удалите эту последнюю промывку и добавьте флуоресцентно меченое вторичное антитело, разбавленные в BB. Для этого эксперимента было использовано 500 мкл козьего антимышеского Alexa Fluor 488 при разведении 1/1000 в BB. Для просмотра постсинаптического элемента NMJ во вторичное разведение антител добавляли конъюгат 1:300 α-бунгаротоксина (Btx) биотина-XX.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление Btx-биотина XX позволяет улучшить изображения сигнал-шум после обнаружения с помощью стрептавидина, который усиливает сигнал. Кроме того, конъюгация стрептавидина с различными флуорофорами увеличивала цветовые комбинации в анализах совместной маркировки. Альтернативно, флуоресцентно меченый Btx позволяет получать изображения аналогичного качества. - Инкубируют вторичное антитело и Btx в течение 2 ч при комнатной температуре или 1 ч при 37 °C, защищенных от света.
- Удалите вторичное антитело и Btx. Промывайте 3x в течение 10 мин каждый с 500 мкл DPBS и последнее полоскать BB.
- Инкубировать с 500 мкл Стрептавидина Alexa Fluor 555 в разведении 1/1000 с ВВ в течение 1 ч при комнатной температуре. В этот момент, при желании, добавляют зонд для контрокрашения ядер, таких как диаминофенилиндол в конечной концентрации 1 мкг/мл.
- Удалите инкубационный раствор и промывайте волокна 3x в течение 10 мин каждый с 500 мкл DPBS. Затем монтируем волокна.
-
Установка
- Поместите 4 точки прозрачного лака для ногтей на слайд микроскопа, как если бы они были вершинами квадрата. Дайте им высохнуть 1-2 мин. Это будут точки, где будут лежать покровные листы, помогая избежать раздавливания тканей.
- Снимите последнюю промывку DPBS и добавьте достаточное количество монтажного носителя (~ 200 мкл) для покрытия волокон; избегайте пересыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 10 мл монтажной смеси используйте Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: глицерин в 4:1 (v:v). - Используйте наконечник пипетки 200 мкл, чтобы аккуратно распределить монтажную кладку по волокнам, чтобы обеспечить полное погружение всех из них. Перед тем, как поместить крышку стекла, удалите пузырьки воздуха.
- Поместите крышку на образцы, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Это движение можно сделать с помощью щипцов.
4. Микроскопия и морфометрический анализ
- Изобразите дразнящие препараты волокон с помощью лазерной конфокальной микроскопии.
- Возьмите серию оптических сечений (стеки Z 30 мкм) по всему синапсу, используя интервал в один микрометр. Чтобы установить стек, используйте сигнал Btx. Изображение не менее 15-20 NMJ для каждого мышечного состояния с разрешением 2048 px x 2048 px. Этот метод был выбран для получения изображений с достаточным оптическим качеством и разрешением для морфометрического анализа.
- Для выполнения измерений используйте проекционные изображения стеков с любым аналитическим программным обеспечением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя объясненный морфометрический анализ был сделан вручную, есть два недавно разработанных инструмента на основе Image J для изучения многих различных аспектов морфологии NMJ до и послесинаптическогоNMJ 33,34. - Чтобы получить значения Total NMJ area, выделите внешнюю границу (внешний контур окрашенной области, см. рисунок 2)концевой пластины с помощью инструмента Photoshop Magnetic lasso и определите количество выбранных пикселей в окне гистограммы. Затем области пикселей могут быть преобразованы в квадратные микрометры с использованием масштаба, заданного конфокальным программным обеспечением.
- С помощью того же инструмента «Лассо» выделите внутреннюю границу (контуры окрашенной области внутри концевой пластины, см. Рисунок 2)и определите неокрашивированную область во всей структуре (или пустой области), как описано выше (шаг 4.4.). Значения Postsynaptic Area будут получены после вычитания общей площади из пустой области каждого NMJ.
- Получите пресинаптическую область, которая определяется как область с антинейрофиламентной иммунофлуоресценцией, аналогично площади Total NMJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти параметры использовались для определения индекса постсинаптической плотности (постсинаптическая область/общая площадь) и охвата NMJ (пресинаптическая область/постсинаптическая область). Более высокий индекс постсинаптической плотности подразумевает более плотную или более компактную концевую пластину, тогда как меньшее покрытие NMJ отражает гораздо более плохое взаимодействие между нервным терминалом и концевой пластиной (оба совместимы с процессом денервации). В показанном здесь случае, поскольку фосфорилированные и нефосфорилированные формы нейрофиламентов были обнаружены на уровне нервных терминалей, были рассчитаны соотношение фосфорилированный/нефосфорилированный пресинаптический сигнал и соотношение фосфорилированного/нефосфорилированного покрытия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол предлагает простой метод выделения и иммуноокрашивания мышечных волокон из двух различных типов мышц (мышцы быстрого и медленного подергивания, см. Рисунок 1). Используя правильные маркеры и/или зонды, компоненты NMJ могут быть обнаружены и оценены с количественной точки зрения для оценки некоторых морфологических изменений, которые могут возникнуть в результате прогрессирования заболевания или специфического медикаментозного лечения. В настоящем исследовании пресинаптические и постсинаптические компоненты NMJ были флуоресцентно помечены с использованием анти-Nf или анти-Phos-Nf антител и Btx соответственно(Рисунок 2,верхние панели). Каждое конфокальное изображение NMJ с высоким разрешением, полученное после иммуноокрашивания, использовалось для определения морфометрических измерений и показателей, указанных в разделе Протокол(Таблица 1),применяя параметры, описанные в нижних панелях фиг.2.
Чтобы продемонстрировать, что этот цельномонтный nmJ-препарат прекрасно сохранил синапсовую архитектуру, позволяющую визуализировать эффект, который оказывает на него прогрессирующее заболевание нервной системы, дразнили волокна трансгенных крыс, экспрессирующих человеческий ген SOD1G93A (модель БАС), иммуноокрашенные с использованием протокола(рисунок 3). Слияние изображений до- и постсинаптических сигналов с ядрами, окрашенными DAPI, показало, что различия между NMJ между трансгенными и неперегенными животными, соответствующими возрасту, хорошо видны и совместимы с результатами, ожидаемыми литературой.
Кроме того, качество изображений позволило количественно оценить наблюдаемые изменения, выполнив морфометрический анализ. Например, на рисунке 4 показаны доказательства того, что постсинаптический сигнал у трансгенных животных представляется более компактным (примерно на 20%), главным образом из-за уменьшения общей площади NMJ.
С другой стороны, рисунок 5 показывает, что пресинаптическая область НМЖ у трансгенных животных также уменьшается. О качестве этого цельномонтного nmJ-препарата свидетельствовал анализ степени втягивания нервных терминалей и обнаружение изменений, касающихся состояний фосфорилирования нейрофиламента. Этот факт будет важен для получения глубокого понимания процесса разборки NMJ, связанного с заболеванием БАС, в используемой модели. Наименьшей обнаруженной пресинаптической областью была та, которая была помечена антифосфорилированным нейрофиламентом(Рисунок 5B, E, C, F).
Использование индекса покрытия(рисунок 6)позволило установить, что трансгенные НМЖ были частично денервированы. Кроме того, он может определить, что индексы покрытия фосфорилированного нейрофиламента ниже, чем у нефосфорилированного нейрофиламента. Эти результаты показывают, что они относятся к состоянию NMJ с целым креплением и что было бы полезно ввести изучение состояния фосфорилирования нейрофиламента (важный фактор, определяющий пластичность и стабильность нити) с использованием этого препарата NMJ с цельным креплением.
Наконец, методы, представленные в этой работе, предлагают наибольшее качество NMJ для выявления, оценки и оценки даже тонких изменений в NMJ в целом или в одном из его компонентов.
Рисунок 1:Анатомические ориентиры EDL и камбоя. Изображение выделяет(A)EDL и(B)расположение камбуша среди других мышц нижней задней конечности крысы. Вставки показывают схемы мышц задних конечностей, близких к EDL (красные) и камбоистые (зеленые)мышцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Цельномонтное нервно-мышечное соединение мышечных волокон EDL. (A) Постсинаптический компонент NMJ обнаружен с помощью альфа-бунгаротоксина (Btx, пурпурный), зонда, который связывается специфически с ацетилхолиновым рецепторами (AChR). (B) Моторный терминал, обнаруженный с использованием антинейропиляментов (анти-Nf, зеленый). (С,D) Синаптические компоненты схематизированы для иллюстрации параметров (внешние и внутренние границы), которые определяли измерения (общая площадь, пресинаптическая и постсинаптическая область), используемые для морфометрического анализа, подробно описанного в протоколе. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Пред- и постсинаптические изменения, наблюдаемые в НМЮ модели БАС. Репрезентативные конфокальные изображения, полученные из цельномонтных NMJ, полученных в препаратах из мышечных волокон EDL, окрашенных для обнаружения нейронитей (зеленый), AChR (пурпурный) и ядра (синий) либо у нетрансгенных (-/-), либо трансгенных (hSOD1G93A/-) крыс. (А,С) Нетрансгенные крысы имеют нормальную морфологию NMJ (форма кренделя) как при визуализации моторного конца с использованием анти-Phos-Nf(A)или анти-Nf(C). (Б,Д) Трансгенные крысы представляют более компактную постсинаптическую область и меньшие пресинаптические терминали с уменьшением сигнала фосфорилирования нейрофиламента. Шкала бара = 50 мкм.
Рисунок 4:Морфометрическая оценка постсинаптического элемента NMJ в мышцах EDL у 180-дневных самцов крыс hSOD1G93A. Репрезентативные конфокальные изображения постсинаптических компонентов у(A,D)непреродгенных и(B,E)трансгенных животных. Оценка(C)постсинаптического участка и(F)постсинаптического индекса плотности в НМЖ неперегенных (твердые колонки) и трансгенных (полосатые колонны) животных. В то время как постсинаптическая площадь была несколько уменьшена у трансгенных животных, постсинаптический индекс увеличился в большей пропорции, что подчеркивает степень уплотнения NMJ, о чем свидетельствует уменьшение общей площади у трансгенных животных, как показано в таблице 1. Шкала бара = 50 мкм. Представленные данные являются средними ± SEM. (*) и (***) обозначены p<0,05 и p<0,001, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Морфометрическая оценка пресинаптического элемента NMJ в мышцах EDL у 180-дневных самцов крыс hSOD1G93A. Учитывая важность разборки НМЖ при заболевании БАС, качество препарата оценивали путем анализа не только степени втягивания нервных терминов, но и возможности выявления изменений фосфорилирования ПРЕСИНАПТИЧЕСКОГО ЭЛЕМЕНТА НМЖ. Репрезентативные конфокальные изображения пресинаптического компонента у(A,D)непретергенных и(B,E)трансгенных животных, обнаруженные с использованием(A,B)анти-Фос-Nf или(D,E)анти-Nf антител. Оценка пресинаптического участка, разграниченного(C)фосфорилированными и(F)нефосфорилированными нейрофиламентами в NMJ нетрансгенных (твердые колонки) и трансгенных (полосатые колонны) животных. Обратите внимание, что эти области очень похожи у неперегенных животных, тогда как они представляют собой значительное сокращение NMJ трансгенных животных. Шкала бара = 50 мкм. Представленные данные являются средними ± SEM. (****) указан p<0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Оценка состояния иннервации на цельномонтных НМЮ волокон EDL hSOD1G93A. Индекс покрытия широко используется для оценки состояния иннервации. Считается, что «полностью иннервированные» НМЮ имеют индекс покрытия 
50%, в то время как «частично иннервированные» имеют охват от ≥20% до ≤50%, а вакантные считаются «денервируемыми». Репрезентативные конфокальные изображения(A,D)нетрансгенных и(B,E)трансгенных NMJ, показывающие пресинаптические и постсинаптические элементы, обнаруженные с использованием(A,B)анти-Phos-Nf или(D,E)анти-Nf антител для наблюдения за двигательным терминалом. Оценка покрытия с использованием(С)фосфорилированных и(F)нефосфорилированных нейрофиламентов в НМЖ нетрансгенных (твердые колонки) и трансгенных (полосатые колонны) животных. Изображения и графика свидетельствуют о том, что NMJ от трансгенных животных имеют более низкий индекс покрытия, чем нетрангенные. Кроме того, у трансгенных животных показатели покрытия фосфорилированных нейрофиламентов ниже (18%), чем полученные при обнаружении нефосфорилированной формы (25%). Этот факт подтверждается соотношением между обоими индексами, как показано в таблице 1. Отметим, что качество препаратов позволяет получить 50% от индекса покрытия, предусмотренного для НМЖ, ожидаемых как «полностью иннервированные». Шкала бара = 50 мкм. Представленные данные являются средними ± SEM. (***) и (****) указаны p<0,001 и p<0,0001, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1. Морфометрические параметры и соотношения, полученные из цельномонтовых NMJ неперегенных и трансгенных волокон EDL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем подробный протокол рассечения двух скелетных мышц крыс (одна медленно дергается, а другая быстро дергается), выделения волоконных мышц и иммунофлуоресцентного обнаружения пред- и постсинаптических маркеров для количественной оценки изменений NMJ, а также процессов сборки / разборки. Этот вид протокола может быть полезен в моделях41,42 грызунов для оценки NMJ во время физиологических или патологических процессов, как покажет здесь в модели дегенерации двигательных нейронов, такой как обнаруженная у крыс ALS hSOD1G93A.
Для получения успеха и полезных результатов необходимо иметь в виду некоторые советы. Например, описанный протокол допускает немедленное использование рассеченных мышц. Однако при необходимости более длительного сохранения мышц применение DPBS с 0,05% азида натрия плюс 4 °C хранение позволяет продлить отличное сохранение мышц до 4 недель. При использовании этого варианта перед началом процесса окрашивания необходимо прополнить обширную промывку DPBS (5x, 10 мин каждая). Другой полезный вариант для получения изображений хорошего качества включает снижение концентрации PFA на 0,5%, поскольку это снижает мышечную автофлуоресценцию. Это должно сопровождаться более длительной фиксацией до 24 ч при 4 °C.
Что касается изоляции волокон, меньшие группы волокон производят лучшие иммунодетекционные качества. Волокна, высушенные на силанизированных горках, необходимо использовать в течение 2-3 дней. По истечении этого времени иммунодетекции не являются хорошим качеством.
Одной из альтернатив высушенным волокнам на силанизированных слайдах является генерация набора частично изолированных волокон, которые удерживаются вместе сухожильной тканью в одном из концов волокон («пучок» мышечных волокон) и проведение инкубации в микроцентрифужных трубках методом «свободно плавающего». С помощью этого варианта необходимо увеличить время инкубации антител на несколько часов (24-48 ч), а также количество промывок (не менее 6 по 10 мин каждая).
В отношении изоляции волокон без повреждений необходимо выполнить «дразнилку», удалив концы, где сухожилие осторожно тянут в противоположных направлениях для достижения разделения волокон.
Другим важным шагом для улучшения иммунодетекции является добавление 1% тритона X-100 и 50 мМ глицина в BB. Это важно для получения препаратов, которые имеют однородное окрашивание и небольшой фон. Также стоит упомянуть, что наличие небольшого фона может быть полезным, когда незапятнанные волокна должны быть изображены. Диаметр волокна хорошо измерять вдали от поля NMJ, поскольку описано, что он может быть увеличен на этом уровне. Поэтому определите диаметр волокна на расстоянии, равном значению профиля NMJ.
С помощью представленной процедуры можно идентифицировать и количественно оценивать компоненты NMJ в физиологических условиях. Это также позволяет изучать ранние ключевые патологические события, такие как демонтаж NMJ24 и потеря фосфорилированной нейрофиламента в терминальных окончаниях39, как описано в патогенезе БАС. По этой причине описанный протокол предлагает альтернативный и простой подход, помогающий лучше понять ремоделирование NMJ, предполагая, что визуализированные морфологические особенности могут быть полезными инструментами для диагностики дегенеративного состояния NMJ или для оценки различных терапевтических подходов. Это также применимо к другим моделям заболеваний, таким как модели Шарко-Мари-Тута41 и спинальная мышечная атрофия42, которые представляют собой нарушение NMJ.
Кроме того, подходы, описанные в этой работе, могут быть использованы для идентификации шванновских клеток, которые интегрируют этот трехсторонний синапс, и в конечном итоге для оценки некоторых его ролей во время ремоделирования NMJ43. Исследования могут проводиться у новорожденных до взрослых, в физиологических условиях или в ответ на различные методы лечения, влияющие на нервно-мышечную систему.
Наконец, несмотря на отличную обработку, необходимую для вскрытия и маркировки образцов, а также время, затрачивое на проведение ручных измерений, методология, представленная здесь, позволяет оптимально маркировать различные компоненты NMJ благодаря облегченному проникновению антител и зондов. Хотя лучшее проникновение может быть получено в секционных мышечных препаратах, дразнение сохраняет 3D-морфологическую целостность всех синаптических компонентов, которые могут быть потеряны в мышечных отделах. Это также позволяет избежать всей подготовки, необходимой для создания таких разделов, как включение мышечного куска и дальнейшее извлечение антигена для получения возможного признания. Кроме того, по сравнению с целыми монтируемыми препаратами, которые сохраняют полные паттерны иннервации, поддразнивание позволяет изучать изолированные волокна. Это может быть значительным преимуществом, когда необходимо оценить гетерогенность волокон, о которых сообщается при патологических состояниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Большое спасибо CSIC и PEDECIBA за финансовую поддержку, оказанную этой работе; Наталье Розано за исправление рукописи; Марсело Касакуберте, который снимает видео, и Николасу Болатто за то, что он одолжил свой голос для него.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
