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Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

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DOI:

10.3791/62623

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25 de dezembro de 2021

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1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta a preparação do slide e a pontuação automatizada do ensaio de focos γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. Para ilustrar o método e a sensibilidade do ensaio, linfócitos isolados foram irradiados in vitro. Este método automatizado de detecção de DSB de DNA é útil para aplicações de dosimetria biológica rápida e de alto rendimento.

Resumo

A radiação ionizante é um potente indutor de dano de DNA e um carcinógeno bem documentado. A dosimetria biológica compreende a detecção de efeitos biológicos induzidos pela exposição à radiação ionizante para fazer uma avaliação individual da dose. Isso é pertinente no quadro de emergências por radiação, onde avaliações de saúde e planejamento do tratamento clínico para vítimas expostas são críticos. Uma vez que as quebras de fios duplos de DNA (DSB) são consideradas a forma mais letal de dano de DNA induzido por radiação, este protocolo apresenta um método para detectar DNA DSB em amostras de sangue. A metodologia baseia-se na detecção de uma proteína fluorescente de reparação de DNA fosfoilado, ou seja, γ-H2AX. O uso de uma plataforma automatizada de microscopia para pontuar o número de focos γ-H2AX por célula permite uma análise padronizada com uma diminuição significativa no tempo de retorno. Portanto, o ensaio γ-H2AX tem o potencial de ser um dos ensaios mais rápidos e sensíveis para a dosimetria biológica. Neste protocolo, amostras de sangue inteiros de voluntários adultos saudáveis serão processadas e irradiadas in vitro, a fim de ilustrar o uso do ensaio automatizado e sensível γ-H2AX para aplicações de biodosimetria. É utilizado um sistema automatizado de varredura de slides e uma plataforma de análise com um microscópio integrado de fluorescência, que permite a pontuação rápida e automática do DNA DSB com um grau reduzido de viés.

Introdução

Desde sua descoberta, a radiação ionizante (IR) tornou-se uma ferramenta indispensável nas práticas médicas e industriais atuais, bem como nas aplicações agrícolas e militares. No entanto, o amplo uso do IR também aumenta o risco de superexposição por radiação tanto para trabalhadores profissionais de radiação quanto para membros do público. O IR é um conhecido carcinógeno físico que pode induzir danos ao DNA de forma direta ou indireta, levando a riscos significativos à saúde 1,2. Por isso, é importante realizar uma avaliação da dose, uma vez que o grau de exposição forma um importante passo inicial no manejo do acidente de radiação 1.

No caso de emergências nucleares ou radiológicas em larga escala, o número de avaliações de doses que precisam ser realizadas pode variar de algumas a milhares de pessoas, dependendo do tamanho do acidente3. Nesses cenários, a dosimetria física também pode ser ambígua (por exemplo, se o dosímetro não for usado corretamente) ou indisponível, quando os membros do público estiverem envolvidos. Embora os sintomas clínicos possam ser usados para triagem, eles não são necessariamente específicos da radiação e podem resultar em um diagnóstico falso. Portanto, é aconselhável utilizar a dosimetria biológica ao lado da dosimetria física e avaliações clínicas. Este método permite a análise de alterações induzidas por radiação a nível celular e permite a identificação inequívoca de indivíduos expostos que necessitam de tratamento médico4. O médico pode, então, usar essa avaliação de dose biológica para complementar reconstruções de doses físicas e outros diagnósticos clínicos, a fim de prescrever os cuidados médicos adequados5. A necessidade de dosimetria biológica será especialmente elevada para triagem e gerenciamento médico de vítimas quando o cenário de exposição não é bem conhecido e quando as vítimas são membros do público. O principal objetivo da triagem é distinguir efetivamente pessoas "preocupadas bem", que poderiam ter sintomas prodromais, mas que não receberam alta dose, de pessoas expostas que necessitam de ajuda médica imediata e atendimento especializado. O nível limiar de dose de radiação que pode causar doenças de radiação é aproximadamente 0,75 - 1,00 Gy. Em seguida, aqueles indivíduos que recebem > 2 Gy de exposição têm maior risco de síndrome aguda de radiação e devem receber tratamento médico imediato6,7. Estimativas oportunas e precisas de doses biológicas para vítimas capturadas no fogo cruzado de tais desastres são críticas. Além disso, também pode confortar e tranquilizar as vítimas minimamente expostas8.

As autoridades de proteção contra radiação utilizam vários marcadores de biodosimetria, que são baseados principalmente na detecção de danos citogenéticos, como cromossomos ou micronucleos, em linfócitos humanos cultivados9. A detecção de danos citogenéticos também pode ser realizada pelo ensaio de translocação fluorescente in situ (FISH)10. No entanto, a maior desvantagem dos métodos citogenéticos convencionais é o longo tempo de reviravolta para obter os resultados em uma situação de emergência8.

Um dos primeiros passos no processo de reconhecimento do DNA DSB é a fosforilação da variante histona H2AX, levando à formação de γ-H2AX, e ao subsequente recrutamento de fatores de reparo. Na última década, a detecção de focos de γ-H2AX induzidos por radiação em linfócitos periféricos usando microscopia de imunofluorescência tem recebido cada vez mais atenção como uma ferramenta de dosimetria biológica confiável11,12,13,14,15. Dependendo da qualidade da radiação e do tipo celular, o rendimento máximo de γ-H2AX é detectado dentro de 0,5 - 1 hora após a irradiação16,17. Prevê-se que haja uma correlação estreita entre o número de focos de DNA DSB e γ-H2AX, bem como entre o desaparecimento de focos e reparos de DSB. Experimentos com uma tesoura laser com um micróbio laser pulsado demonstraram que γ-H2AX focos localizados aos locais de DNA DSB18. Embora continue sendo um tema de debate ativo, um dos primeiros estudos com 125sugeri uma correlação um-para-um entre o número calculado de desintegrações por célula (representável para o número de DSB de DNA induzido por radiação) e o número de γ-H2AX focos que foi pontuado19,20.

Na última década, a União Europeia financiou os projetos MULTIBIODOSE (ferramentas biodosimétricas multidisciplinares para gerenciar baixas radiológicas em larga escala) e reneb (realização da Rede Europeia de Biodosimetria) para criar uma rede sustentável em dosimetria biológica e retrospectiva21,22. Este projeto incluiu vários laboratórios em toda a Europa para avaliar as capacidades de resposta a emergências em caso de emergência radiológica14,21,22. O ensaio de focos γ-H2AX tem uma série de vantagens consideráveis, como um tempo de processamento rápido, o potencial de processamento em lote permitindo alta produtividade, bem como sua alta sensibilidade se usado dentro de poucas horas após a exposição13,23,24. A alta sensibilidade do ensaio na faixa de baixa dose resultou em uma série de estudos onde o ensaio de γ-H2AX foi utilizado como um indicador do efeito da exposição à radiação médica, tanto na radioterapia quanto em aplicações de diagnóstico por imagem25,26,27,28,29,30. Essas características fazem com que os focos γ-H2AX testem uma alternativa altamente competitiva a outros métodos de triagem precoce em grandes acidentes nucleares para separar os criticamente expostos de indivíduos de baixo risco. Vários experimentos de otimização ilustraram que é viável realizar o ensaio de focos γ-H2AX com pequenos volumes de sangue, como o estudo de Moquet et al. que relataram que é viável realizar o ensaio de γ-H2AX com apenas uma gota de sangue (picada de dedo)31. Uma abordagem semelhante foi usada no desenvolvimento do sistema RABIT (Rapid Automated Biodosimetry Tool) totalmente automatizado que foi otimizado para medir os rendimentos de γ-H2AX a partir de amostras de sangue derivadas de dedos32,33. No geral, os resultados dos estudos de intercoadia MULTIBIODOSE e RENEB sugerem que o ensaio de γ-H2AX pode ser uma ferramenta de triagem muito útil após uma recente (até 24 horas) exposição aguda à radiação12,13,14. Em um estudo inter-comparativo de baixa faixa de dose, uma dose tão baixa quanto 10 mGy poderia ser distinguida das amostras de controle irradiadas por vergonha, destacando a sensibilidade do ensaio na faixa de baixa dose34. É importante notar que a alta sensibilidade do ensaio é particularmente verdadeira para linfócitos, o que os torna um dos tipos celulares mais adequados para a avaliação de exposições de baixa dose. Os linfócitos são principalmente células não ciclistas e representam uma população síncronana. Este último evita a expressão de γ-H2AX está associada à replicação do DNA, o que reduz significativamente a sensibilidade do ensaio para detectar DSB induzido por radiação durante a fase G2 e S do ciclo celular35. Além de sua sensibilidade a doses baixas para linfócitos, o tempo de reviravolta do ensaio de focos γ-H2AX é significativamente mais rápido do que técnicas citogenéticas, como o ensaio dicêntrico e micronucleus, uma vez que não requer a estimulação de linfócitos. Portanto, os resultados podem ser obtidos em poucas horas em comparação com alguns dias para técnicas citogenéticas. Uma grande desvantagem do ensaio é o desaparecimento rápido do sinal de focos γ-H2AX, que normalmente será reduzido a níveis de linha de base dentro de dias após a exposição à radiação, dependendo da cinética de reparação de DNA36. Portanto, a aplicação mais adequada do ensaio em um contexto de biodosimetria é para fins iniciais de triagem e para priorizar o acompanhamento da dosimetria biológica citogenética mais demorado para determinadas vítimas. No entanto, para a biodosimetria retrospectiva precisa e efeitos a longo prazo, é preciso confiar em técnicas citogenéticas, como análises de PEIXEs de três cores para a detecção de aberrações cromossômicas estáveis no caso da exposição ter ocorrido há vários anos10.

Como parte de várias iniciativas de biodosimetria, vários ensaios foram avaliados para fins de triagem ao lado do ensaio de focos γ-H2AX para triagem de pessoas em emergências radiológicas em larga escala; como o ensaio dicentrics, o ensaio micronucleus de bloco de citocinas, ressonância paramagnética eletrônica (EPR), ensaio de proteína sérica (SPA), ensaio de manchas de pele (SSA), luminescência estimulada opticamente (OSL), bem como análise de expressão genética 37,38. O ensaio de γ-H2AX pode ser usado quantitativamente para avaliação da formação e reparação de DNA DSB39. No entanto, o ensaio é dependente do tempo, pois o nível de γ-H2AX tem variação de tempo após a irradiação devido à cinética de reparação do DNA DSB40. Um estudo comparativo ilustrou que a pontuação microscópica com capacidade de estágio z oferece os resultados mais precisos após 1 Giro de irradiação, enquanto a citometria de fluxo só dá resultados confiáveis em doses mais altas de IR41. Há muitos relatos do desenvolvimento de soluções de análise de imagem para uso na pontuação automatizada42,43,44,45,46. Neste protocolo, uma plataforma automatizada de microscopia fluorescente de alto rendimento é usada para analisar γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. O uso de um sistema de pontuação automática evita tanto viés de pontuação inter-laboratorial quanto inter-observador, enquanto ainda permite sensibilidade suficiente para detectar doses abaixo de 1 Gy47. A principal vantagem deste sistema em comparação com o software de código aberto gratuito para pontuação de focos é o fato de que o processo completo desde a digitalização de slides até a captura e pontuação seja automatizado. O conceito de classificadores definível e armazenador de usuário garante a reprodutibilidade que adiciona um grau imparcial de qualidade aos resultados. Portanto, este trabalho ilustra como os resultados de focos γ-H2AX podem ser obtidos usando um método automatizado de digitalização e pontuação microscópica que pode ser usado quando amostras de sangue de indivíduos potencialmente super-expostos são recebidas por laboratórios de radiobiologia para fins de dosimetria biológica.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Comitê de Ética da Universidade do Cabo Ocidental - Código BM18/6/12.

1. Preparação de Soluções48

  1. Solução de fixação celular (3% PFA no PBS)
    1. Use os equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados e trabalhe em uma capa de fume, adicione 20 g de paraformaldeído a 200 mL de H2O. Aqueça a mistura a 60 °C para auxiliar na dissolução.
    2. Uma vez que o PFA é dissolvido, adicione 40 gotas de 5 N NaOH cuidadosamente ao longo de 30 minutos e para esfriar à temperatura ambiente. Ajuste ao pH 7 usando 1 M HCl e faça até um volume final de 250 mL com H2O destilado (alíquotas podem ser armazenadas a -20 °C por 1 ano). Adicione 25 mL desta solução a 41,7 mL PBS para pagar uma solução PFA de 3%.
  2. Solução de 1% Bovine Serum Albumin (BSA): Adicione 10 g de BSA a 1000 mL de PBS e misture até dissolver. Armazenar a 4 °C até usar (máxima de 72 horas).
  3. Solução Triton-X em uma concentração de 1:500: Adicionar 1 μL de Triton-X a 500 μL de PBS, armazenar a 4 °C até o uso (máximo 24 horas).
  4. Soluções de anticorpos
    1. Anticorpo primário - Anti-γ-H2AX na concentração de 1:500: Adicionar 1 μL de anti-γ-H2AX a 500 μL de solução BSA de 1%, armazenar a 4 °C até o uso (máximo 24 horas).
    2. Anticorpo secundário - DAM-TRITC em concentração de 1:1000: Adicionar 1 μL de DAM-TRITC a 1000 μL de solução BSA de 1%, armazenar a 4 °C até o uso (máximo 24 horas).
  5. Mídia completa do Roswell Park Memorial Institute (cRPMI)
    1. Adicione soro bovino fetal filtrado (FBS) e penicilina-estreptomicina à mídia RPMI 1640 em uma garrafa estéril para dar uma concentração final de 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina.

2. Preparação de Amostras

NOTA: Para este protocolo, amostras de sangue integral periférica são coletadas por venipuntura em tubos de coleta de lítio-heparina de voluntários adultos saudáveis (com consentimento informado - BM18/6/12 Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica da Universidade do Cabo Ocidental). Antes de começar, certifique-se de que o sangue e o meio de densidade de 1,077 g/mL estejam aclimatados à temperatura ambiente.

  1. Em um gabinete de biossegurança preparado, diluir o sangue periférico inteiro em um volume de 1:1 com PBS e camada suave do sangue diluído em um volume igual a dois volumes de médio com densidade de 1,077 g/mL. É importante colocar gradualmente o sangue no meio de densidade segurando o tubo inclinado a 45°, garantindo que o sangue e o meio de densidade não se misturem.
  2. Transfira cuidadosamente a suspensão para uma centrífuga e gire a 900 x g por 20 minutos. A partir daí, pipete a camada 'nublada' apenas para um novo tubo cônico estéril e encha o tubo com PBS e centrífuga por 10 minutos a 1000 x g. Depois disso, aspire o supernatante com uma pipeta, sendo cauteloso para não perturbar a pelota, resuspensar a pelota PBMC cuidadosamente em 1 mL PBS e encher o tubo com PBS.
  3. Repita o passo de lavagem acima mais duas vezes para chegar a um total de três lavagens.
  4. Conte o número de PBMCs usando um hemótmetro, ciente de que cada mL de sangue periférico de um doador adulto resultará em uma média aproximada de 1 - 1,5 x 106 PBMCs49. Após a contagem, dilui a pelota PBMC a uma concentração de 8 x 105 linfócitos em 1 mL de cRPMI. Em seguida, adicione aproximadamente 2 x 106 PBMCs ou 2,5 mL da solução pbmc isolada em um tubo estéril e cônico para irradiações.

3. Irradiações de amostras

ATENÇÃO: Manuseie a unidade de radiação de acordo com as diretrizes de Proteção contra Radiação e use um dosímetro físico o tempo todo. Certifique-se de que o sistema de irradiação utilizado esteja calibrado e configure de tal forma que as doses corretas esperadas sejam alcançadas.

  1. Irradiar PBMCs à temperatura ambiente usando uma fonte de 60Co. Calibrar (protocolo TRS-398) com uma câmara Farmer 117 para a qual um fator de calibração da câmara obtido do Instituto Nacional de Metrologia da África do Sul (NMISA)50.
    1. Para este ensaio, coloque os tubos cônicos entre uma folha de acrílico de 5 mm (usada para o acúmulo de entrada do feixe) e o material de 50 mm backscatter com a taxa de dose de origem atual de 60Co de 0,57 Gy/min para um tamanho de campo de 300 mm × 300 mm homogêneo a 750 mm Fonte à Distância superficial.
  2. Irradie os PBMCs com doses classificadas de 0,125, 0,500, 1.000, 1.500 e 2.000 Gy, e mantenha as amostras de controle irradiadas falsas, na sala de controle, recebendo apenas exposição à radiação ambiente.
  3. Incubar as amostras irradiadas por 1 hora a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2, a fim de atingir o número máximo de focos γ-H2AX.
    NOTA: O tempo de incubação pode ser modificado de acordo com o design experimental.

4. Preparação de slides

NOTA: Consulte a Figura 1 para a configuração do slide.

  1. Prepare 3 slides (repetições técnicas) usando slides revestidos com uma superfície carregada positivamente para melhorar a adesão por condição de irradiação (ou por tubo cônico). Coloque o slide no suporte do clipe, adicione a placa de filtro em cima dele e, finalmente, o funil. Fixar os clipes de slides e colocar no citocentrifuuge.
  2. Adicione 250 μL da suspensão da célula ao funil (200.000 células/slide) e gire por 30 x g por 5 minutos usando um cytocentrifuge.
  3. Após a citocentrifugação, remova o slide do suporte do clipe e usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um círculo ao redor do local com as células, a fim de reter a mancha imunofluorescente nas células ligadas durante o processo de coloração.

5. Fixação e imunofluorescência γ-H2AX coloração

NOTA: Todas as soluções são cuidadosamente adicionadas diretamente na área celular que é marcada por um círculo hidrofóbico. As soluções de coloração são distribuídas ligeiramente acima do slide sem permitir que a ponta da pipeta interrompa as células. As soluções NÃO são adicionadas ao slide completo.

  1. Corrija os slides em 3% pfa recém-preparados por 20 minutos.
    NOTA: Os slides podem ser armazenados em PBS contendo PFA de 0,5% a 4 °C durante um máximo de 2 dias antes da imunosstaining ser realizada. Depois disso, lave slides em um frasco de Coplin com PBS por 5 minutos e cubra as células com 100 μL da solução Triton-X fria por 10 minutos para permitir a permeabilização.
  2. Coloque a solução Triton-X em papel de tecido e lave os slides três vezes em solução BSA de 1% por 10 minutos. Isso é feito para evitar o fundo indesejado bloqueando a ligação de anticorpos não específicos.
  3. Incubar lâminas à temperatura ambiente com 100 μL do anticorpo anti-γ-H2AX diluído de 1:500 diluído por 1 hora em uma câmara umidificante, facilmente realizado adicionando papel de tecido molhado na base de uma caixa de armazenamento de slides retangular.
    1. Coloque a solução de anticorpos em papel de tecido e realize três lavagens com solução BSA de 1% por 10 minutos em um frasco de Coplin para remover anticorpos primários não ligados e para evitar a ligação não específica do anticorpo secundário.
  4. Incubar lâminas com 100 μL da solução de anticorpos secundárias DAM-TRITC diluídas de 1:1000 por 1 hora na câmara umidificante. Coloque a solução de anticorpos em papel de tecido e lave os slides em PBS por 10 minutos três vezes.
  5. Por fim, seque as lâminas fora do círculo hidrofóbico com papel de tecido macio e sem poeira e adicione 1-2 gotas de DAPI resolvidas em um meio de montagem aquoso e cubra suavemente o slide com um deslizamento de cobertura de 24 x 50 mm, garantindo que não haja bolhas de ar presas e coloque na geladeira a 4 °C durante a noite. Os slides podem ser armazenados a 4 °C durante um máximo de 2 semanas antes da digitalização.

6. Digitalização automatizada e pontuação de slides

NOTA: O sistema de digitalização precisa ter um microscópio fluorescente, uma câmera CCD de alta resolução (dispositivo acoplado carregado) conectada a um agarrador de quadros para digitalização em tempo real de imagens de vídeo, um estágio de digitalização, trackball para movimentos manuais, mouse 3D, PC rápido e monitor e disco rígido para arquivamento(Figura 2).

  1. Configuração do classificador
    NOTA: O classificador é um conjunto de parâmetros que define como o sistema detecta células. Resulta do treinamento baseado em campos de imagem pré-classificados. Um classificador é específico para uma ampliação do microscópio, tipo celular e laboratório. Os classificadores podem, portanto, exigir modificações nos seguintes parâmetros para adaptá-los às condições atuais. Recomenda-se testar as configurações com um slide de referência antes da avaliação.
    1. Aquisição de imagem: Use um objetivo seco de 40x para imagem. Para alcançar qualidade de imagem comparável em todas as células, defina o tempo de integração da câmera para o modo automático. Defina o tempo máximo de integração para pelo menos 1 segundo para ambos os canais coloridos (ganho de câmera 4.0). O canal de sinal é adquirido com 10 aviões de foco e 14/40 μm entre os aviões.
    2. Seleção celular: São detectados PBMCs dentro de uma faixa de 20,00 μm2 e 76,00 μm2. Ajuste a profundidade máxima de concavidade para 0,05 e a proporção máxima para 1,4. Defina o limiar relativo do nível cinza para 20%.
    3. Processamento de células: Processe o canal de contra-mancha da DAPI com um algoritmo máximo de histograma para reduzir o fundo. O canal de sinal é processado com um filtro TopHat (força 7, fator de alisamento 0) para reduzir o fundo e melhorar os sinais.
    4. Contagem de sinais: Conte os focos usando o recurso Contagem de objetos do dispositivo. Para evitar uma avaliação falso-positiva dos sinais de fundo restantes, apenas os sinais que mostram pelo menos 30% da intensidade quando comparados com o objeto mais brilhante da célula são contados.
  2. Inserir/Colocar slides na plataforma de varredura automatizada ou no estágio de slides, depois de cuidadosamente limpo com 70% de etanol, para remover qualquer poeira.
  3. Configuração de slides - Menu de diálogo de configuração de slides aberto(Figura 3)
    1. Selecione o caminho de dadoscorreto , isso especifica onde os arquivos de slides resultantes da pesquisa são armazenados.
    2. Dê um nome ao slide, cada slide deve receber um nome único. Se uma série de slides forem inseridos na forma de uma lista enumerada, o '?' pode ser usado como curinga para o número de slides.
    3. Selecione o classificador apropriado, conforme descrito na seção 1.1 - 1.4 (Figura 4).
    4. Selecione a janela de pesquisa e selecione Predefinido se houver uma definição de janela de pesquisa que corresponda ao círculo celular cytocentrifuge, selecione a respectiva definição na coluna Tamanho ou selecione Manual se não houver uma definição de janela de pesquisa pré-definida disponível. Neste caso, a coluna Tamanho não precisa ser definida.
    5. Selecione a contagem máxima de células e adicione o número máximo de células necessárias para serem digitalizadas. A pesquisa é encerrada mesmo que a janela de pesquisa selecionada ainda não tenha sido digitalizada completamente assim que a Contagem de Células Max for atingida. Para aplicações de biodosimetria, a pontuação automatizada de 1000 células por slide é suficiente, considerando que 3 slides por amostra de sangue são preparados. Clique em OK para confirmar as configurações.
  4. Configuração de varredura de slides
    1. Clique no botão Pesquisar na barra lateral. Se a configuração Janela de Pesquisa Manual for selecionada na configuração de slides, um diálogo será aberto permitindo a determinação da área de varredura(Figura 5). Usando o objetivo de 10x, selecione a área de pesquisa retangular no slide interativamente, fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse. Isso pode ser confirmado com o botão OK. Se a janela de pesquisa estiver se referindo a uma janela de pesquisa predefinida, esta etapa será omitida.
    2. O usuário é solicitado a ajustar uma posição de início de foco. Em seguida, um objeto de referência será selecionado automaticamente, o software solicitará ao usuário que concentre e centralizará um núcleo de referência (usando o objetivo de 40x) para cada slide e confirme as configurações com OK. O sistema se moverá automaticamente para todos os slides sequencialmente. Se necessário, ajuste a configuração de imagem ao vivo - Tempo de integração para esta etapa(Figura 5).
    3. Verifique todas as configurações do microscópio e confirme o prompt do sistema com OK. O sistema iniciará o procedimento automatizado de foco e digitalização. Uma vez concluída a varredura, os dados são salvos no computador para análises. O sistema de digitalização desliga-se automaticamente após a varredura ser concluída.
      NOTA: Certifique-se de que a alavanca do tubo de microscópio está em uma posição que desvia toda a luz para a câmera.
    4. Search End, a pesquisa é encerrada se toda a pesquisa tiver sido digitalizada, se a contagem máxima de células foi atingida ou se a pesquisa foi cancelada.
  5. Análise de slides
    NOTA: A varredura concluída está representada na Figura 6.
    1. Quando a varredura estiver concluída, clique no botão Galeria na barra lateral. Revise a galeria, que consiste em pequenas imagens de células detectadas. Nesta janela(Figura 7),especifique se as células armazenadas na galeria por um critério a ser escolhido a partir de um menu suspenso. As células são geralmente exibidas na ordem em que foram detectadas.
    2. Clique no Histograma/Diagrama de Valor de Característica de Qualidade ( Figura8) para dar a distribuição da medida de qualidade para as células detectadas, bem como os meios, e o desvio padrão dos focos pontuados.

Resultados

Para este protocolo, as células mononucleares de sangue periféricos humanos (PMBCs) foram isoladas de sangue inteiro de quatro voluntários adultos saudáveis e foram expostas a doses de radiação de 0,125, 0,250, 0,500, 1.000 e 2.000 Gy. Depois disso, as amostras foram incubadas por 1 hora a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2. Após a fixação e a coloração da imunofluorescência, os slides são automaticamente digitalizados e pontuados. As figuras 6,7 e 8 dão uma representação do que o software produz para o usuário. Uma janela de análise aparece assim que a varredura é concluída, dando uma visão geral dos focos pontuados. A galeria dá todos os focos pontuados com um menu interativo que pode excluir outliers e finalmente um histograma com um resumo de dados detalhado é dado.

O rendimento de focos γ-H2AX após a exposição a raios-γ são apresentados na Figura 9. Houve um aumento gradual no número de focos γ-H2AX com dose crescente. Este gráfico não apenas ilustra a dependência da dose e sensibilidade do ensaio, mas o ajuste também pode ser usado para realizar uma estimativa de dose quando uma amostra é recebida de um indivíduo que foi exposto a uma dose desconhecida. É importante notar que não se terá controle irradiado ou níveis de focos de fundo para este indivíduo. Portanto, a Figura 9 inclui o valor 0 Gy das amostras de controle irradiadas falsas, que foi de 0,57 ± 0,23 Gy para os quatro doadores adultos neste estudo.

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Figura 1: Preparação de slides paracentrifugação de cito. Coloque o slide no suporte do clipe, adicione a placa de filtro em cima dele e, finalmente, o funil. Fixar os clipes de slides e colocar no citocentrifuuge. Após a citocentrifugação, remova o slide do suporte do clipe e desenhe um círculo ao redor do local com as células usando uma caneta hidrofóbica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: A plataforma de digitalização automatizada que foi usada neste protocolo, contendo um scanner automatizado conectado a um microscópio fluorescente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Menu para configuração de slides. Abra o diálogo clicando no botão CONFIGURAÇÃO na barra lateral. Selecione ou insira o diretório de destino para os arquivos de resultado Clique aqui para exibir uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Menu de configuração do classificador. Certifique-se de que as configurações do classificador selecionados correspondam ao tipo de célula atual, às condições de preparação e aos padrões de coloração da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Menu de configuração para janela de pesquisa manual. A janela foi selecionada na configuração de slides; um diálogo será aberto permitindo a determinação da área de varredura. Usando o objetivo de 10x, a área de pesquisa retangular no slide é selecionada interativamente fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Janela de análise, uma vez concluída a varredura, a janela de análise mostra os resultados da varredura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Exibição da galeria para o slide selecionado. A guia Galeria é encontrada na barra lateral. A galeria de imagens consiste em pequenas imagens das células detectadas, exibidas como uma imagem COMBINADA DAPI-TRITC. No canto inferior esquerdo e direito de cada imagem, os focos diretos contam e as contagens de focos corrigidos são exibidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Imagens de histograma para o slide selecionado. Esta janela é aberta clicando com o botão direito do mouse no histograma. Ao clicar no histograma, a guia histograma fornece um resumo de dados que lista a média, desvio padrão, coeficiente de variação, valores mínimos, máximos e medianos das células analisadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: O número de γ-H2AX em função da dose para linfócitos expostos a 60raios co γ. As barras de erro são os desvios padrão que representam a variação interindividual entre os doadores. Os dados representam o número médio de focos γ-H2AX ± desvio padrão de quatro voluntários saudáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo descreve um procedimento stepwise para a pontuação automatizada baseada em microscopia fluorescente do ensaio de focos γ-H2AX. Ilustra a utilidade do ensaio de focos como um método eficiente para analisar o número de DSB de DNA induzido por radiação em linfócitos sanguíneos periféricos para realizar uma avaliação de dose biológica em um cenário de acidente de radiação onde indivíduos podem ser expostos a níveis desconhecidos de IR.

Neste protocolo específico, os PBMCs foram irradiados in vitro para imitar uma exposição à radiação in vivo. Uma vez que a irradiação e o tempo de incubação de uma hora são concluídos, slides são feitos usando um citocentrifuuge para criar um ponto de concentração de células no slide. O uso de um cytocentrifuge é vital para alcançar condições padronizadas para pontuação automatizada. Quando concluída, uma caneta hidrofóbica é usada para fazer um círculo ao redor das células, para reduzir o desperdício de reagentes, permitindo que o usuário localize os reagentes de coloração. Este tipo de caneta pode ser usada em várias técnicas de imunossuagem, como em seções de parafina, seções congeladas e preparações de citologia. Além disso, é importante selecionar uma caneta hidrofóbica compatível com sistemas de detecção baseados em enzimas e fluorescentes. Após a preparação do slide, ocorreu a fixação e a imunofluorescência γ-H2AX. Neste protocolo, as células são fixadas usando 3% de PFA em uma solução PBS por 20 minutos. Para que a imunostenção tenha sucesso, é essencial que a morfologia das células seja retida e que os sítios antigênicos sejam acessíveis aos reagentes de detecção que estão sendo utilizados. PFA é um agente relativamente gentil para fixação e estabiliza as células, preservando estruturas proteicas51. Experimentos de otimização com maiores concentrações de PFA e tempos de fixação mais longos resultaram em um impacto negativo na qualidade do slide, mas o armazenamento adicional (durante a noite) em 0,5% de PFA até 24 horas rendeu bons resultados.

O anticorpo monoclonal primário 2F3 usado neste protocolo reage à variante histona H2AX quando fosforilado em Serine 139 após indução de DNA DSB. O anticorpo é capaz de se ligar ao resíduo fosforilado sem reatividade cruzada com outras histonas fosforiladas52. Por se trata de um anticorpo monoclonal de camundongos primário, um anticorpo secundário foi selecionado contra a espécie hospedeira do anticorpo primário enquanto era criado em um hospedeiro alternativo, ou seja, burro-anti-rato (DAM)-TRITC. Embora a coloração imunofluorescente seja baseada em ligação anticorpo-epitope específica, várias forças intermoleculares também podem resultar em coloração de fundo não específica. Para reduzir a vinculação não específica, é importante utilizar um reagente de bloqueio nos protocolos de coloração imunofluorescente53; usamos uma solução BSA. Além disso, deve-se alocar tempo suficiente para esta etapa de bloqueio, deixando os slides na solução por pelo menos 20 minutos antes da coloração de anticorpos primários e secundários. Além disso, a solução BSA também deve ser utilizada como diluente para os anticorpos primários e secundários. Dependendo do anti-γ-H2AX e do anticorpo secundário que é usado para a coloração, deve-se considerar testar diferentes diluições de anticorpos para determinar a concentração ideal. Para uma pontuação mais precisa, uma coloração dupla pode ser conduzida, adicionando anticorpos proteicos adicionais de reparação de DNA DSB.

Uma grande desvantagem desse tipo de análise é a necessidade de adquirir amostras de sangue o mais rápido possível após a exposição, já que o número máximo de focos é conhecido por diminuir de volta aos níveis normais dentro de 48 horas após a irradiação. Portanto, quando o tempo de acidente de radiação e amostragem subsequente de sangue é conhecido, pode ser útil trabalhar com diferentes curvas de calibração que foram estabelecidas em diferentes pontos de tempo após a irradiação in vitro (por exemplo, 4, 8, 12 e 24 horas). No entanto, como já mencionado na seção de introdução do manuscrito, a força do ensaio de focos γ-H2AX está em propósitos iniciais e rápidos de triagem e deve ser usada para priorizar a dosimetria biológica citogenética mais demorada. Um cenário combinado onde vários biomarcadores de biodosimetria são usados em paralelo, gerará a estimativa de dose mais confiável e vários laboratórios de biodosimetria em todo o mundo uniram forças para configurar redes nacionais que podem ser ativadas e usadas para permitir múltiplas avaliações de biodosimetria paralela por laboratórios com diferentes expertises37,54,55 . Além disso, estão em andamento desenvolvimentos para análises super-rápida, como um laboratório móvel no local do acidente56. Novos e promissores métodos de biodosimetria estão sendo constantemente desenvolvidos, o que, esperançosamente, resultará em um rendimento ainda mais rápido e confiável no futuro57.

Para o sistema automatizado de análise de imagens, os slides são inseridos ou colocados na plataforma de digitalização automatizada ou no estágio de slides. Depois disso, nomeie e salve os detalhes do slide na pasta apropriada no computador conectado. Para este experimento, a detecção automatizada de núcleos e focos baseia-se nas respectivas configurações do classificador. Ao criar um classificador, certifique-se de que as configurações do classificador selecionado correspondam ao tipo celular atual, condições de preparação e coloração imunofluorescente da amostra. Canais fluorescentes apropriados que correspondem ao espectro de excitação dos anticorpos primários e secundários são definidos no classificador. O classificador permite definir parâmetros adicionais de pontuação, se necessário (por exemplo, tamanho do núcleo, intensidade fluorescente, conforme descrito na Seção 6.1). Se duas ou mais proteínas de reparação de DNA (por exemplo, γ-H2AX e 53BP1) forem combinadas em um experimento, o sistema também é capaz de detectar co-localizações de sinais. Primeiro, o sistema adquire imagens DAPI, aplica o processamento de imagens e identifica núcleos usando critérios morfológicos definidos no classificador. Os sinais TRITC são adquiridos utilizando pilhas de 10 z com um tamanho de passo de 0,35 mm entre os planos focais47. O classificador usou a Contagem de Focos Diretos, onde o número de sinais TRITC distintos dentro do núcleo são pontuados. Aqui, é importante levar em consideração que, com o aumento da dose de radiação, os sinais de foco tendem a se fundir em objetos maiores, resultando em uma subestimação do número real de focos se os objetos forem contados diretamente. Não foi necessário para a análise aqui descrita, mas uma etapa adicional com a Contagem de Focos Corrigidos pode ser implementada para resolver este problema. Este último permite que o sistema obtenha os tamanhos dos sinais detectados e os pesa de acordo. O uso de ambos os métodos de contagem pode fornecer uma estimativa mais realista do número real de focos em doses mais altas.

Para iniciar a digitalização automatizada, a área de digitalização é determinada usando o objetivo de 10x do microscópio para fazer uma área de busca retangular fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse (Figura 5), seguido de foco na posição inicial. O objeto de referência é selecionado automaticamente, e o software solicita ao usuário que concentre e centrale um núcleo de referência (usando o objetivo de 40x) para cada slide. Após o início da pesquisa, o sistema se moverá para o centro da janela de pesquisa do primeiro slide selecionado e solicitará centralizar e concentrar o objeto de referência. Este objeto será posteriormente usado como referência de posição para corrigir qualquer mudança nas posições da célula. O segundo objetivo do campo de referência é o ajuste automático da luz, no modo de luz transmitido a luz é ajustada até que o nível de luz ideal seja atingido. No modo fluorescência o nível de luz é fixo, mas o tempo de integração da câmera CCD pode ser aumentado até que o sinal necessário seja medido. Para permitir um ajuste correto da luz, a referência deve conter objetos com coloração típica. É importante não usar um campo que tenha artefatos com intensidade de coloração muito alta. Após o ajuste da luz, o sistema inicia o foco automático da grade na posição da grade mais próxima do campo de referência. Ele continua a concentrar os campos em uma grade regular, movendo-se em uma mesmã em direção à frente e na parte de trás da janela de busca. A varredura começa quando o foco automático da rede estiver concluído. O estágio é movido em um campo de padrão de meandro após campo para capturar dados. Quando uma célula é detectada, sua imagem de posição e galeria são armazenadas e exibidas na tela e a contagem de células é atualizada. Se ocorrer um erro de microscópio, estágio ou alimentador, a pesquisa será automaticamente cancelada. O único passo em que há uma intervenção manual do operador é durante a configuração de varredura de slides. Este também é o ponto onde ocorre uma rápida verificação de controle de qualidade (bolhas de ar, números de células baixas, desbotamento dos artefatos de coloração de sinal fluorescente) e onde pode ser decidido abortar a varredura de um slide de qualidade inferior. Uma pesquisa é encerrada se todo o slide tiver sido digitalizado, se a contagem máxima de células foi atingida ou se a pesquisa foi cancelada. Uma vez concluída a varredura, os dados são apresentados como visto em Figura 6. Para visualizar células digitalizadas, a janela Galeria é aberta e cada célula pode ser visualizada (Figura 7). Este é outro ponto onde o operador pode realizar um controle de qualidade verificando o foco das imagens da galeria e o número total de células que foram pontuadas. Se muitas células estão fora de foco ou pequenas células foram detectadas pelo sistema para fazer uma estimativa realista de dose (por exemplo, 100 células em vez das 1000 células pretendidas), então a decisão deve ser tomada para excluir o slide e a pontuação automática da avaliação final. Todos os dados são resumidos em histogramas (Figura 8), juntamente com informações sobre a distribuição, os meios e o desvio padrão de focos pontuados para cada célula. Os histogramas também podem ser usados para selecionar e exibir sub-populações de núcleos com base nos achados automatizados para revisão. As análises estatísticas sobre os resultados são realizadas após a distribuição, média, e o desvio padrão do número de focos por célula foram registrados manualmente. O gráfico pode ser usado como uma curva de calibração para fazer uma estimativa de dose de uma amostra de biodosimetria. Isso pode ser feito usando a equação da linha de tendência para fazer uma estimativa aproximada da dose recebida. Além disso Figura 9 ilustra que a varredura automatizada é sensível o suficiente para detectar focos induzidos em doses baixas. Além disso, os resultados mostram um claro aumento linear do número de focos por célula com dose. Deve-se notar que os resultados são apenas representativos para o classificador usado, os resultados diferem para diferentes parâmetros de classificação. Portanto, em caso de análise de biodosimetria, é importante que o mesmo classificador e a preparação de slides sejam utilizados para as amostras de biodosimetria como as que foram utilizadas para estabelecer a curva de calibração que é usada para realizar a estimativa da dose. Embora tenha saído do escopo deste estudo, é importante notar que o ensaio de focos γ-H2AX também pode ser usado para determinar irradiações parciais do corpo. A maioria das exposições de radiação acidental são exposições inhomogêneas ou parciais do corpo, onde apenas uma região localizada do corpo recebeu alta exposição de doses. Vários estudos ilustraram que é possível usar o ensaio de γ-H2AX para estimar a fração do corpo que foi irradiada e a dose para a fração irradiada42. Quando uma irradiação do corpo inteiro ocorrer, haverá indução aleatória de DNA DSB em todas as células e pode-se esperar encontrar uma distribuição de Poisson. Semelhante aos métodos citogênicos, onde a indução de aberrações cromossômicas tende a ser super dispersa em linfócitos sanguíneos periféricos onde há uma alta abundância de células com múltiplas aberrações e células com metafases normais, análise de dispersão de γ-H2AX focos usando um método de Poisson contaminado sugerido sobre distribuições dispersas de focos dispersos58. Este último também foi confirmado em in vivo experimentos com miniporcos e um macaque rhesus59.

Divulgações

C. Schunck é um funcionário da MetaSystems Hard & Software GmbH, Altlussheim, Alemanha.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos participantes do estudo por suas doações de sangue, bem como a enfermeira V. Prince pela coleta de amostras de sangue. A assistência financeira da Fundação Nacional de Pesquisa da África do Sul (NRF) para esta pesquisa é reconhecida. As opiniões expressas, e as conclusões que chegaram são dos autores e não são necessariamente atribuídas à NRF. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA), por meio de um Projeto de Cooperação Técnica (número: URU6042) para apoiar W. Martínez-López, bem como o Projeto de Pesquisa Coordenada E35010 (número do contrato: 22248).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina de soro bovino - BSAMerckA3059
Coplin JarSigmaS6016
Cover Slips (Tamanho 24 x 50 mm)LasecGlass2C29M2450Rec
Frascos criogênicos (1,2 mL)WhiteSci607101
CytospinHealthcare TechnologiesJC370-12-L
Cytospin ClipsHealthcare TecnologiasJC302
Cartões de filtro CytospinHealthcare TechnologiesJC307
Funis Cytospin HealthcareTechnologiesJC372
DAM-TRITCInvitrogenA16022
DAPI-FluroshieldSigma / MerckF6057
EtanolKimixETD901
Filtro dicasWhiteSci  200ul (312012) e 1000ul (313012)
Ácido clorídrico- HClMerck
HistopaqueSigma/Merck10771
lítio– Tubos de coleta de heparinaO Grupo Científico367526
MetaSystems - MetaferMetasystemsAzio Imager Z2: 195-041848
NaOHMerck221465
NovoPenLeica BiosystemsNCL-PEN
ParaformaldeídoSigma/Merck158127
Comprimidossalinos tamponados com fosfatoSeparaçõesSH30028,02
PipetasWhiteSciP11037 e P1033X-tra Clipped Corner Slides são cortadas em ângulos de 45° para ajudar a reduzir a quebra do vidro.
Anticorpo anti-H2A.X Phospho (Ser139) purificadoBiolegend613402 / 100 μ g
RPMI mediumWhiteSciBE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)Sigma/MerckT-9284
Tubes (15ml)WhiteSci601002
X-Tra lâminas adesivas - SMMTechnologies3800200E
com recorte de canto

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