Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

As bactérias são inevitavelmente expostas a uma miríade de estresses ambientais, incluindo pH baixo (por exemplo, no estômago dos mamíferos)^1,2, oxigênio reativo e espécies de cloro (ROS/RCS) (por exemplo, durante a explosão oxidativa em fagocitos)^3,4,5, temperaturas elevadas (por exemplo, em fontes termais ou durante o choque térmico)^6,7, e vários antimicrobianos potentes (por exemplo, AGXX usados neste protocolo)⁸. As proteínas são particularmente vulneráveis a qualquer um desses estressores, e a exposição pode provocar a não-/misfolding de proteínas que, em seguida, a agregação de sementes. Todos os organismos empregam sistemas de proteção que lhes permitem lidar com o erro de proteína⁹. No entanto, o estresse severo pode sobrecarregar o maquinário de controle de qualidade proteica e interromper a estrutura secundária e/ou terciária das proteínas, o que acaba inativando proteínas. Como consequência, os agregados proteicos podem prejudicar severamente as funções celulares críticas necessárias para o crescimento e sobrevivência bacteriana, resistência ao estresse e virulência¹⁰. Portanto, pesquisas com foco na agregação de proteínas e suas consequências nas bactérias são um tema relevante devido ao seu potencial impacto no controle de doenças infecciosas.

O desdobramento e a agregação de proteínas induzidas pelo calor são muitas vezes reversíveis⁷. Em contraste, outras tensões proteotoxiais, como o estresse oxidativo, podem causar modificações proteicas irreversíveis através da oxidação de cadeias laterais específicas de aminoácidos resultando em proteínas não-/misfolding e, eventualmente, agregação de^{proteínas 4}. A formação induzida pelo estresse de agregados proteicos insolúveis tem sido extensivamente estudada no contexto de acompanhantes moleculares e suas funções protetoras na levedura e bactérias^11,12,13. Vários protocolos foram publicados que utilizam uma variedade de técnicas bioquímicas para o isolamento e análise dos agregados de proteínas insolúveis^14,15,16,17. Os protocolos existentes têm sido usados principalmente para estudar a agregação de proteínas bacterianas mediante choque térmico e/ou identificação de acompanhantes moleculares. Embora esses protocolos tenham sido certamente um avanço para o campo, há alguns grandes inconvenientes nos procedimentos experimentais porque exigem (i) um grande volume de cultura bacteriana de até 10 L^14,17, (ii) complicados processos de interrupção física, incluindo o uso de disruptores celulares, imprensa francesa e/ou sonicação^14,15,17, ou (iii) demorado repetidos lalavís e incubação etapas^15,16,17.

Este artigo descreve um protocolo modificado que visa abordar as limitações das abordagens anteriores e permite a análise da quantidade de agregados proteicos formados em duas cepas diferentes de Escherichia coli após o tratamento com um revestimento de superfície antimicrobiana proteotoxic. O revestimento é composto de metal-prata (Ag) e rutênio (Ru)-condicionado com ácido ascórbico, e sua atividade antimicrobiana é alcançada pela geração de espécies reativas de oxigênio^8,18. Aqui está uma descrição detalhada da preparação da cultura bacteriana após o tratamento com o composto antimicrobiano e uma comparação do estado de agregação de proteínas após a exposição de duas cepas de E. coli com perfis distintos de suscetibilidade ao aumento da concentração do antimicrobiano. O método descrito é barato, rápido e reprodutível e pode ser usado para estudar a agregação de proteínas na presença de outros compostos proteotóxicos. Além disso, o protocolo pode ser modificado para analisar o impacto que exclusões genéticas específicas têm na agregação de proteínas em uma variedade de bactérias diferentes.

1. Tratamento de estresse de E. coli cepas MG1655 e CFT073

1. Inocula 5 mL de caldo de lisogenia (LB) médio com uma única colônia de cepa E. coli commensal MG1655 e uropatogenic E. coli (UPEC) cepa CFT073, respectivamente, e incubar por 14-16 h (durante a noite) a 37 °C e 300 rpm.
   NOTA: Escherichia coli CFT073 é um patógeno humano. O manuseio do CFT073 deve ser realizado com medidas de biossegurança adequadas em um laboratório certificado de Biossegurança Nível-2.
2. Diluir cada cepa em um frasco de 500 mL contendo70 mL de ácido propanossulfônico (MOPS)-glicose (MOPS-g)(Tabela 1)médio a uma densidade óptica de 600 nm (OD₆₀₀) valor de 0,1. Incubar a 37 °C e 300 rpm até a fase de registro médio (OD₆₀₀ = 0,5-0,55).
3. Transfira 20 mL de cada cultura em três frascos pré-armados de 125 mL e incubar a 37 °C e 300 rpm por 2 min.
   NOTA: Como o processamento oportuno das amostras é necessário, manuseie não mais do que 6 culturas por vez.
4. Prepare uma solução composta antimicrobiana em meio MOPS-g a uma concentração de 2 mg/mL. Adicione o antimicrobiano a cada cultura para alcançar as concentrações indicadas. Para o controle não tratado, adicione o volume necessário de meio MOPS-g.
   NOTA: Vortex a solução antimicrobiana de 2 mg/mL para permitir uma distribuição uniforme das partículas compostas e evitar a sedimentação.
5. Incubar as culturas por 45 min a 37 °C e 300 rpm.

Figura 1: Tratamento de estresse Escherichia coli. As culturas bacterianas são cultivadas em MOPS-g e tratadas com as concentrações indicadas do antimicrobiano contendo rutênio prateado quando a fase de registro médio é atingida. Abreviaturas: LB = caldo de lysogeny; Ag-Ru = prata-rutênio; MOPS-g = 3-(N-morpholino)ácido propanesulfônico (MOPS)-glicose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Coleta de amostras de células bacterianas

1. Após 45 minutos de tratamento de estresse, determine o OD₆₀₀ de cada cultura. Para cada amostra, as células de colheita equivalem a 4 mL de OD₆₀₀ = 1 em tubos de centrífugas de 15 mL por centrifugação por centrifugação por 15 min a 3.000 × g e 4 °C.
2. Remova completamente o supernasciente e resuspense as pelotas de célula em 50 μL de tampão de lise gelada(Tabela 1). Incubar as amostras por 30 minutos no gelo.
   NOTA: Este passo de lise degrada a camada peptidoglycan. Use sempre o tampão de lise recém-preparado.
3. Transfira as amostras para tubos de microcentrifuuge de 1,7 mL. Congele a -80 °C até que seja mais útil.

Figura 2: Coleta de amostras bacterianas. As amostras de células são colhidas por centrifugação e resuspensadas no tampão de lise seguido de armazenamento a -80 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Extrair os agregados proteicos insolúveis

1. Descongelar amostras no gelo.
   NOTA: O ciclo de congelamento contribui para a lise celular.
2. Adicione 360 μL de tampão gelado A(Tabela 1) e misture delicadamente por pipetação.
   NOTA: O choque osmótico também contribuirá para a lise celular.
3. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuge de 2 mL contendo ~200 μL de contas de vidro de 0,5 mm. Incubar por 30 min a 8 °C em um termomixer com agitação a 1.400 rpm.
   NOTA: Esta etapa resulta na ruptura física da célula. Um inibidor de protease pode ser usado para minimizar a degradação da proteína. A interrupção pode ser realizada a 4 °C. Note-se que o uso de contas de vidro foi relatado para induzir a agregação de um pequeno subconjunto de proteínas na levedura¹⁹.
4. Incubar por 5 minutos no gelo sem tremer para assar as contas de vidro. Transfira 200 μL do lysato celular em tubos de microcentrifuuge de 1,7 mL.
   NOTA: Evite a transferência das contas de vidro.
5. Centrifugar a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Recolher o supernante, que contém proteínas solúveis, e seguir para a seção 4.
6. Resuspenda a pelota em 200 μL de tampão gelado A (Tabela 1) usando a pipeta. Centrifugar a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Remova cuidadosamente o sobrenante completamente.
7. Adicione 200 μL de tampão gelado B (ver Tabela 1 e a Tabela de Materiais) e resuspense cuidadosamente a pelota por pipetação.
   NOTA: O detergente não iônico solubiliza a proteína da membrana.
8. Repita a centrifugação a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Remova cuidadosamente o supernatante.
9. Resuspenda a pelota em 200 μL de tampão frio A (Tabela 1) por pipetação. Centrifugar a 16.000 × g e 4 °C por 20 min. Remova completamente o supernatante.
10. Resuspenda a pelota em 100 μL de 1x reduzindo o tampão de amostra SDS(Tabela 1) e ferva por 5 min a 95 °C em um termomixer.
11. Armazene a amostra a -20 °C para prosseguir mais tarde ou carregar imediatamente em um gel de poliacrilamida SDS para separação.

Figura 3: Extração de agregados proteicos insolúveis. A extração de agregados proteicos envolve uma série de etapas, incluindo a ruptura celular, a separação de agregados proteicos de proteínas solúveis, a solubilização de proteínas de membrana e a lavagem. Abreviação: SDS = sulfato de dodecyl de sódio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Preparação da amostra de proteína solúvel

1. Misture 1 volume de ácido 100% tricloroacético (TCA) com 4 volumes de amostra de proteína solúvel a partir do passo 3.6.
   NOTA: O manuseio do TCA requer um capô de fumaça e equipamentos de proteção individual e um procedimento aprovado de descarte de resíduos.
2. Incubar por 10 min a 4 °C para permitir a precipitação da proteína.
   NOTA: O precipitado branco aparecerá muito em breve.
3. Centrífuga para precipitar a 21.000 × g e 4 °C por 5 min e remover o sobrenante. Lave a pelota com 200 μL de acetona gelada para remover detritos celulares. Centrifugar a 21.000 × g e 4 °C por 5 min e remover o supernatante. Repita essas ações na etapa 4.3 um total de três vezes.
4. Coloque os tubos de microcentrifuuge com tampas abertas em um termomixer a 37 °C para remover a acetona restante da pelota.
   NOTA: A incubação de mais de 5 min pode reduzir a solubilidade da pelota de proteína.
5. Adicione 100 μL de 1x reduzindo o buffer SDS(Tabela 1) e dissolva completamente a pelota. Ferva a amostra por 5 min a 95 °C.
6. Armazene a amostra a -20 °C para prosseguir mais tarde ou carregar imediatamente em um gel de poliacrilamida SDS para separação.

Figura 4: Preparação de proteínas solúveis. A preparação da proteína solúvel envolve um passo de precipitação com ácido tricloroacético e lavagem repetida com acetona gelada. Abreviaturas: TCA = ácido tricloroacético; SDS = sulfato de dodecyl de sódio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Separação e visualização de agregados de proteínas extraídas utilizando SDS-PAGE

1. Prepare um gel de poliacrilamida SDS de 12%.
   1. Para dois géis separados, pipeta 5,1 mL de água dupla destilada (ddH₂O), 3,75 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL de 20% (w/v) SDS, 6 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 75 mL de persulgo de amônio de 10% w/v e 10 mL de tetrametetilenodiamina (TEMED) em um tubo de centrífugo de 15 mL e misture suavemente sem introduzir bolhas de ar. Despeje o gel usando uma tubulação de 1 mL dentro das placas de vidro, deixando a parte superior 2 cm livre da mistura. Adicione 70% de etanol na parte superior do gel de separação e permita uma interface uniforme entre as duas camadas.
   2. Após a polimerização do gel de separação, prepare o gel de empilhamento por pipetação de 1,535 mL de ddH₂O, 625 mL de Tris-HCl (pH 6.8), 12,5 mL de 20% (w/v) SDS, 335 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 12,5 mL de persulgênio de 10% w/v de amônio e 2,5 mL de TEMED. Retire o etanol dos géis de separação e adicione a solução de gel de empilhamento. Insira um pente com o número desejado de bolsos sem introduzir bolhas de ar. Deixe a polimerização por 20-30 min.
2. Carregue 4 μL de cada amostra e escada proteica em poços separados e execute o gel(s) em tampão de corrida Tris-Glycine(Tabela 1) a 144 V por 45 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Pare o gel quando a banda bromofenol estiver prestes a migrar para fora do gel.
3. Manche o gel(s) em uma solução de Fairbanks pré-enfracaada A (Tabela 1) por 30 min em um roqueiro.
4. Decolor o gel(s) em uma solução de Fairbanks pré-enloucou D(Tabela 1) até o fundo desejado (por exemplo, durante a noite) em um roqueiro.

Figura 5: Separação e visualização de proteínas. As amostras são separadas por SDS-PAGE e visualizadas pela coloração coomassie. Abreviação: SDS-PAGE = sulfato de sulfato de sódio-poliacrilamida gel eletroforese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Resultados representativos da agregação de proteínas induzidas por antimicrobianos na cepa Escherichia coli commensal MG1655 e cepa UPEC CFT073. As cepas E. coli MG1655 e CFT073 foram cultivadas a 37 °C e 300 rpm a OD600= 0,5-0,55 na mídia MOPS-g antes de serem tratadas com as concentrações indicadas (-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; ++, 200 mg/mL) do antimicrobiano por 45 min. Amostras de proteína solúvel e insolúvel foram preparadas conforme descrito no protocolo e figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4 e visualizadas em um gel de poliacrilamida de 12% SDS(Figura 5). A formação de proteína agregada (fração insolúvel) foi aumentada em ambas as cepas na presença do antimicrobiano, enquanto as quantidades de proteínas solúveis foram diminuídas. No geral, o antimicrobiano teve um efeito muito mais potente no MG1655 do que no CFT073. Abreviaturas: M= Marcador de proteína; UPEC = uropatogênico E. coli; MOPS-g = 3-(N-morpholino)ácido propanesulfônico (MOPS)-glicose; SDS = sulfato de dodecyl de sódio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, foram utilizadas duas cepas de E. coli que diferem em sua suscetibilidade a um antimicrobiano proteotóxico contendo prata-rutênio para demonstrar este protocolo. Dados preliminares de sobrevivência revelaram que a cepa E. coli commensal MG1655 é significativamente mais sensível ao antimicrobiano gerador de ROS do que a cepa UPEC CFT073 (dados não mostrados). Ambas as cepas foram cultivadas em mídia MOPS-g a 37 °C e 300 rpm. Na fase de registro médio, as células foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 175 μg/mL e 200 μg/mL do antimicrobiano, respectivamente, e incubadas por 45 min. Posteriormente, as células foram lísedas, e os agregados de proteínas celulares separados das proteínas solúveis. As proteínas em ambas as frações foram então separadas pela SDS-PAGE e visualizadas pela coloração coomassie. A fração insolúvel mostrada na Figura 6 representa a quantidade de agregados proteicos formados, que foi aumentada quando as células foram incubadas na presença do antimicrobiano em comparação com as células não tratadas. O aumento da formação de agregado de proteínas foi independente do fundo da cepa, embora tenha sido detectado um aumento muito mais acentuado na formação agregada na cepa mais sensível MG1655. Por outro lado, foram observadas quantidades menores de proteínas solúveis (fração solúvel) após o tratamento antimicrobiano das células em comparação com a contrapartida não tratada. Esse resultado era esperado, dado os dados preliminares que mostraram uma tolerância substancialmente maior do antimicrobiano em CFT073 do que o MG1655.

Tabela 1: Buffer, Media e Solutions. Receitas para buffer, mídia e soluções utilizadas neste protocolo.

Os autores não têm nada a revelar.