Reconstruir o retinoblastoma humano in vitro

Resumo

Descrevemos um método para gerar retinoblastoma humano (RB) através da introdução de mutações RB1 bialélicas em células-tronco embrionárias humanas (hESC). As linhagens celulares de RB também podem ser cultivadas com sucesso usando o RB isolado em um prato.

Resumo

RB humano é câncer pediátrico, que é letal se nenhum tratamento for administrado. Como o RB se origina de precursores de cones, o que é relativamente raro em modelos de roedores, enquanto isso, em relação às diferenças entre espécies entre humanos e roedores, um modelo de doença derivado de humanos é mais benéfico para descobrir os mecanismos do RB humano e buscar os alvos da terapia. Aqui, o protocolo descreve a geração de duas linhagens hESC editadas por genes com uma mutação de ponto RB1 bialélica (RB1 Mut/^Mut) e uma mutação knockout RB1 (RB1-^/-), respectivamente. Durante o processo de desenvolvimento da retina, observa-se a formação de RB. As linhagens celulares RB também são estabelecidas pela segregação dos organoides RB. No total, ao diferenciar as linhas hESC editadas por genes nos organoides da retina usando um protocolo de diferenciação combinada 2D e 3D, reconstruímos com sucesso o RB humano em um prato e identificamos sua origem precursora de cone. Ele forneceria um modelo de doença útil para observar a gênese, proliferação e crescimento do retinoblastoma, bem como desenvolver novos agentes terapêuticos.

Introdução

O retinoblastoma humano (RB) é um tumor raro e fatal, derivado dos precursores do cone da ^retina1,2,3, sendo o tipo mais comum de malignidade intraocular na infância⁴. A inativação homozigótica do gene RB1 é a lesão genética inicial na RB⁵. No entanto, camundongos com mutações RB1 não conseguem formar o tumor da retina². Embora os tumores de camundongos possam ser gerados com a combinação de mutações Rb1 e outras modificações genéticas, eles ainda não possuem as características ....

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. Os hESCs H9 são obtidos do WiCell Research Institute.

1. Geração de hESC mutado RB1

1. Vetor de direcionamento CRISPR/Cas9 para o nocaute (KO) do RB1.
   1. Projete um par de sgRNA. Para a ablação de RB1, vise o primeiro éxon deste gene. A sequência do primer para a frente é CACCGCGGGGCGGCCTTTTCGG, e a sequência do primer reverso é AAACCCGAAAAACGGCCCCCCACCGC.
      Observação : para a mutação RB1 específica, um modelo reparado também é necessário. Neste protocolo, a linhagem c....

Resultados

O procedimento de geração de RB é elucidado na Figura 1, que combina a cultura aderente e flutuante. Foi possível colher o RB humano do RB1-KO hESC e obter a linhagem celular RB isolando os organoides RB.

Aqui, o protocolo fornece os detalhes da diferenciação em diferentes estágios (Figura 2). Esferas ocas são formadas nos primeiros 3 dias que se ligam à superfície da cultura e depois se expandem (Figura .......

Discussão

O retinoblastoma humano (RB) é causado pela inativação do RB1 e pela disfunção da proteína Rb. Neste protocolo, o RB1-KO hESC é o passo fundamental para a geração de RB em um prato. Mesmo com RB1-^/- hESC, é possível que não haja formação de RB devido aos métodos de diferenciação organoide da retina¹⁰. Neste protocolo, a transferência da cultura aderente para a cultura flutuante é essencial no processo de diferenciação. A densidade dos cistos, os tipos de célul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Anticorpo
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Anticorpo
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Anticorpo
Anti-Syk (D3Z1E)	Tecnologia de Sinalização Celular	13198	Anticorpo
BbsI	NEB	R3539S	Enzimas de restrição
Dispase (1U / mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM básico	Gibco	10566-016
DMEM / F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Soro Bovino (FBS), Qualificado para Células-Tronco Embrionárias Humanas	Indústria Biológica	04-002-1A
Glutamina	Gibco	35050-061
Mistura de Nutrientes F-12 da Ham's (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)	Sigma	M7145
Meio Neurobasal	Gibco	21103-049
P3 Célula Primária 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Kit de Nucleofecção
Caneta Strep	Gibco	15140-122
Operação do Gene	Puromicina	ISY1130- 0025MG
Kit de purificação de PCR QIAquick	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC / hESC meio	de cultura Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC / hESC em 1.2.1
Matriz de membrana basal reduzida por fator de crescimento	BD	356231	Matrigel em 1.2.1
Enzima de dissociação celular	Gibco	12563-011	TrypLE Express em 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Suplemento A	Life Technologies	17502-048	N-2 Suplemento (100X), líquido, flexível em medum I
Suplemento B	Life Technologies	17105-041	B-27 Suplemento (50X), líquido, flexível em medum I,II,III
T4 Polinucleotídeo Quinase	Life Technologies	EK0032
Taurina	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML