Reconstruir o retinoblastoma humano in vitro

O retinoblastoma humano (RB) é um tumor raro e fatal, derivado dos precursores do cone da ^retina1,2,3, sendo o tipo mais comum de malignidade intraocular na infância⁴. A inativação homozigótica do gene RB1 é a lesão genética inicial na RB⁵. No entanto, camundongos com mutações RB1 não conseguem formar o tumor da retina². Embora os tumores de camundongos possam ser gerados com a combinação de mutações Rb1 e outras modificações genéticas, eles ainda não possuem as características do RB⁶ humano. Graças ao desenvolvimento da diferenciação organoide da retina, o RB derivado do hESC pôde ser obtido, exibindo os caracteres do RB¹ humano.

Numerosos protocolos para diferenciação organoide da retina foram estabelecidos na última década, incluindo 2D⁷, 3D⁸ e uma combinação de 2D e 3D⁹. O método aqui utilizado para gerar a RB humana é a consolidação da cultura aderente e da cultura flutuante⁹. Ao diferenciar o hESC mutado RB1 em organoides da retina, a formação de RB é detectada por volta do dia 45 e, em seguida, prolifera rapidamente por volta do dia 60. No dia 90, é possível o isolamento dos RBs e a geração da linhagem celular RB; além disso, a RB envolve quase todos os organoides da retina no dia 120.

A RB derivada de hESC é um modelo inovador para explorar a origem, tumorigênese e tratamentos para RB. Neste protocolo, a geração de hESC de edição de genes, a diferenciação de RB e a caracterização para RB são descritas em detalhes.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. Os hESCs H9 são obtidos do WiCell Research Institute.

1. Geração de hESC mutado RB1

1. Vetor de direcionamento CRISPR/Cas9 para o nocaute (KO) do RB1.
   1. Projete um par de sgRNA. Para a ablação de RB1, vise o primeiro éxon deste gene. A sequência do primer para a frente é CACCGCGGGGCGGCCTTTTCGG, e a sequência do primer reverso é AAACCCGAAAAACGGCCCCCCACCGC.
      Observação : para a mutação RB1 específica, um modelo reparado também é necessário. Neste protocolo, a linhagem celular RB1-KO é usada como exemplo.
   2. Digerir 1 μg de pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro com enzimas de restrição BbsI (ver Tabela de Materiais) durante 30 min a 37 °C, seguindo as instruções do fabricante.
   3. Purificar os plasmídeos digeridos usando um kit de purificação de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: As reações enzimáticas podem ser diretamente limpas sem gel de agarose usando o kit de purificação (consulte Tabela de Materiais).
   4. Fosforilato e recozimento de cada par de oligos utilizando a polinucleotídeo quinase T4 (PNK) (Tabela de Materiais) com a reação compreendendo 1 μL de oligo1 (100 μM), 1 μL de oligo2 (100 μM), 1 μL de 10x T4 Ligation Buffer, 6,5 μL de ddH₂O e 0,5 μL de T4 PNK.
      NOTA: Os primers dianteiros e inversos na etapa 1.1.1 são um par de oligos. Fosforilato e recozimento dos oligos num termociclador utilizando os seguintes parâmetros: 37 °C durante 30 min; 95 °C durante 5 min; rampa até 25 °C a 5 °C por minuto.
   5. Diluir os oligos fosforilados e recozidos 200 vezes adicionando 1 μL de oligo reagente a 199 μL de água isenta de nuclease à temperatura ambiente (RT).
   6. Configure a reação de ligadura e incube no RT por 10 min misturando o seguinte: 50 ng de plasmídeo digerido Bbs1 da etapa 1.1.3, 1 μL de oligoduplex da etapa 1.1.5, 5 μL de tampão de ligadura 2x, 1 μL de ligase e tampe até 10 μL usando água livre de nuclease.
   7. Transforme a mistura de ligadura e sequencie as colônias positivas para a próxima etapa.
      NOTA: Use o primer U6 para frente ou para trás para sequenciamento.
      1. Descongele as células competentes no gelo.
      2. Tomar 50 μL das células competentes num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      3. Adicionar 1 μL da mistura de ligadura da fase 1.1.6 às células competentes.
      4. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo o tubo três vezes.
         NOTA: Não faça vórtice.
      5. Coloque a mistura no gelo por 30 min.
      6. Choque térmico da mistura a 42 °C durante 90 s.
      7. Adicionar 950 μL de caldo de Luria-Bertani (LB) à temperatura ambiente sem antibiótico ao tubo.
      8. Colocar o tubo num agitador a 300 rpm a 37 °C durante 60 minutos.
      9. Aqueça as placas LB (peptona, peptona de caseína, cloreto de sódio, ágar-ágar e ampicilina) a 37 °C com antecedência.
      10. Espalhe 50-100 μL das células e da mistura de ligadura nas placas em RT.
      11. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
      12. Pegue 12 colônias da placa e transfira-as para o meio LB com ampicilina. Coloque o meio em um agitador a 300 rpm por 60 min.
      13. Use 1 μL da solução bacteriana (a partir da etapa 1.1.7.12) como modelo para PCR e selecione as colônias positivas.
      14. Sequencie as colônias positivas pelos primers U6, use a colônia com as sequências de sgRNA projetadas na próxima etapa.
   8. Extraia o plasmídeo usando um kit midi (consulte Tabela de materiais).
      NOTA: A qualidade e a quantidade do plasmídeo usando um mini kit não são suficientes para o seguinte experimento de nucleofeção. Midi ou maxi kit é mais adequado do que o mini kit.
2. Cultura e nucleofecção de HESC.
   NOTA: Pré-aqueça todos os reagentes para RT.
   1. Descongelar 1 x 10 6 células H9 em uma placa pré-revestida de⁶ poços com 10 μM Y-27632 (inibidor de ROCK) e 2 mL de meio de cultura fresco ncEpic-hiPSC/hESC.
      NOTA: Revestir a placa de 6 poços com 1% de fator de crescimento reduzido na matriz da membrana basal por pelo menos 30 min a 37 °C antes do uso.
   2. No dia seguinte, remova o sobrenadante, lave as células com 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e, em seguida, adicione 2 mL de meio de cultura fresco ncEpic-hiPSC/hESC.
   3. Mude o meio todos os dias com 2 mL de meio de cultura fresco ncEpic-hiPSC/hESC nos 3-5 dias seguintes até que as células cresçam para cerca de 80% de confluência.
   4. Passagem uma ou duas vezes para ajustar o estado do hESC.
      NOTA: A maneira mais fácil de identificar o estado do hESC é a morfologia.
   5. Cultive as células H9 indiferenciadas em uma placa de 6 poços até atingirem 80% de confluência.
   6. Alterar o meio 2 h antes da nucleofeção com 2 mL de meio de cultura ncEpic-hiPSC/hESC fresco misturado com 10 μM de Y-27632 e pré-revestir um poço de uma placa de 12 poços usando matriz de membrana basal reduzida com fator de crescimento de 1%.
   7. Aspirar o meio e enxaguar com 1 mL de DPBS pré-aquecida.
   8. Remover o DPBS e incubar com 1 ml de enzima de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) durante 3,5 min a 37 °C.
   9. Adicionar 1 ml de meio de cultura fresco ncEpic-hiPSC/hESC às células e pipetar duas vezes para transformar as células H9 numa única suspensão celular.
   10. Retirar 100 μL da mistura para a contagem celular e transferir o restante para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo outros 2 mL de meio de cultura ncEpic-hiPSC/hESC no interior.
   11. Centrífuga a 200 x g durante 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda cerca de 2 x 10⁶ células em um volume de reação de 100 μL. De acordo com o protocolo do fabricante, otimize o volume para as células, plasmídeos, nucleofector e condições de reação. Consulte Tabela de Materiais para o sistema de nucleofeção utilizado neste protocolo.
       NOTA: Geralmente, bolhas não são permitidas durante a nucleofecção.
   12. Após a transfecção, transferir as células para a placa pré-revestida de 12 poços, suplementar com 1,5 mL de meio de cultura ncEpic-hiPSC/hESC e 10 μM de Y-27632 e, em seguida, cultivar as células em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ .
   13. Mude o meio diariamente. Após 48 h, adicionar 2 μg/mL de puromicina para seleção celular em torno de uma semana.
       NOTA: Numerosas células morrem durante os primeiros 3 dias. As células restantes podem proliferar e gerar em colônias na semana seguinte após a seleção da puromicina. Na semana de seleção, certifique-se de que o meio contenha sempre 2 μg/ml de puromicina.
   14. Escolha as colônias manualmente sob um microscópio.
       NOTA: A morfologia da colônia é a mesma da colônia hES. Corte as colônias em pedaços (2-6 pedaços por colônia) com uma ponta de pipeta branca/normal de 10 μL no meio e transfira uma colônia para um poço pré-revestido de uma placa de 12 poços.
   15. Primeiro, identifique as mutações RB1 e as situações fora do alvo (Tabela 1) e, em seguida, a pluripotência para caracterizar a linhagem celular H9 knockout RB1.
       NOTA: Detecte as mutações RB1 e as situações fora do alvo usando PCR e sequenciamento de sanger. Identificar os marcadores de pluripotência por RT-PCR e Imunofluorescência.

2. Geração de retinoblastoma humano

1. Manutenção de RB1-KO hESC.
   1. Cultivar as células H9 editadas por genes em uma matriz de membrana basal reduzida com fator de crescimento revestida de placa de 6 poços com 2 mL de meio de cultura ncEpic-hiPSC/hESC e trocar o meio todos os dias.
   2. Passagem usando tampão EDTA por 3,5 min a 37 °C ou 5 min a RT.
      NOTA: O tampão EDTA é a mistura de 1x DPBS, 5 mM EDTA e 0,9 mg/mL de NaCl.
2. Diferenciação celular da retina.
   NOTA: Prepare o Meio I antes da diferenciação. Para preparar o Meio I, misture 24,5 mL de Meio Águia Modificado (DMEM)/Mistura de Nutrientes F-12(F12)-Glutamina (1x), 24,5 mL de Meio Basal Neuronal, 250 μL de 100x suplemento A, 500 μL de 50x suplemento B, 0,1 mM ß-mercaptoetanol e 250 μL de 100x L-glutamina. Pré-aqueça todas as misturas para RT antes de usar.
   1. Aumente o RB1-KO hESC para 80% de confluência em um poço de uma placa de 6 poços.
   2. Retire o meio e enxágue as células com 1 mL de 1x DPBS.
   3. Elevar as colónias celulares utilizando 1 ml de tampão dispase (ver Tabela de Materiais) durante 5 min a 37 °C.
      NOTA: Verifique as colônias de células sob um microscópio. Normalmente, leva 5 minutos para a borda das colônias se desenrolar.
   4. Aspirar o tampão de dispase e enxaguar suavemente as células uma vez com 1 ml de 1x DPBS.
   5. Adicione 1 mL de Meio I no poço.
   6. Corte as colônias em pedaços (6-9 pedaços por colônia) com uma ponta de pipeta branca/normal de 10 μL no meio.
      NOTA: Geralmente, cerca de 60% a 70% das células se desprendem do poço. Use um raspador de células para raspar as células restantes no meio.
   7. Colha todas as células por centrifugação em um tubo de 15 mL a 200 x g por 5 min.
   8. Deixar cerca de 50 μL do sobrenadante para dispersar as células no meio e, em seguida, misturar as células com 250 μL de matriz de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento por agitação suave.
      NOTA: Mantenha a matriz de membrana basal reduzida do fator de crescimento a 4 °C ou no gelo antes de usar. Se for alíquotado e armazenado a -20 °C, colocá-lo a 4 °C durante a noite ou, pelo menos, 1 h antes da utilização.
   9. Manter o tubo de 15 ml com as células suspensas numa incubadora a 37 °C durante 20 minutos.
      NOTA: Certifique-se de que as células e a matriz de membrana basal reduzida do fator de crescimento formem um gel solidificado.
   10. Adicione 1 mL de Meio I no tubo de 15 mL e, em seguida, pipete levemente o gel solidificado duas a três vezes para dispersar o aglomerado com uma pipeta de 1 mL.
   11. Adicionar 9 mL de Meio I e transferir a suspensão celular para uma placa de cultura celular de 10 cm.
   12. Mova o prato para uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ e defina o dia como dia 0.
   13. Examine as células usando um microscópio no dia 1.
       NOTA: Milhares de cistos ocos podem ser observados no prato. Em média, 3 a 4 cistos são observados em um pedaço de gel.
   14. Mude o meio no dia 5. Colete o sobrenadante em um tubo de 15 mL, espere que os cistos se depositem no fundo e, em seguida, remova o meio e substitua-o por um meio I fresco.
       NOTA: Se o meio ficar amarelo no dia 4, mude o meio no dia 4, caso contrário, no dia 5. Adicione 10 mL de Medium I fresco ao prato original. Centenas de cistos já se ligaram à superfície da cultura; mantê-los lá.
   15. Disperse os cistos no tubo em dois pratos de 10 cm.
       NOTA: Certifique-se de que pelo menos 300 cistos estão em um prato. Se os cistos não forem confluentes, não separe os cistos em outros pratos; devolva-os ao prato original de 10 cm.
   16. No dia 7, a maioria dos cistos (acima de 95%) se liga ao prato, se espalha e forma colônias aderentes.
       NOTA: Já no dia 3, as colônias aderentes podem ser observadas.
   17. No dia 10, troque o meio com o meio fresco I. Certifique-se de que todos os cistos estejam presos ao prato.
   18. Prepare o Medium II antes do passo seguinte, misturando o seguinte: 36 ml de DMEM, 12 ml de F12, 2% de suplemento B (v/v), 0,1 mM MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA).
   19. Certifique-se de que as células estão espalhadas até o dia 13-17. Execute o próximo passo no dia 15, quando as células estão espalhadas, mas não interagindo com as colônias vizinhas.
   20. Enxaguar as células uma vez com 1 ml de DPBS e adicionar 1 ml de solução de dispase durante 5 min a 37 °C.
       NOTA: Dentro de 5 minutos, a borda das células se eleva.
   21. Retire o tampão de dispase e lave suavemente as culturas com 1 mL de 1x DPBS.
   22. Adicionar 10 mL de Meio II a cada prato de 10 cm e cultura em incubadora de CO₂ a 37 °C e 5%.
   23. As culturas aderentes se desprendem espontaneamente após 24 h e se reúnem em organoides da retina.
       NOTA: Numerosas células que não formam os organoides morreriam nos 2 dias seguintes.
   24. Três dias após o descolamento, colete as células da placa de cultura celular e permita que os organoides se depositem em um tubo de 15 mL.
   25. Retire o sobrenadante do tubo e transfira os organoides para uma nova placa não aderente (placa de Petri) com 10 mL de Meio II nos quatro dias seguintes.
   26. Prepare o Meio III misturando DMEM: F12 na proporção de 3:1 (v/v), suplemento B a 2% (v/v), Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (NEAA) a 0,1 mM, Soro Fetal Bovino a 8% (FBS) (v/v), 100 μM de Taurina e 2 mM de Glutamina.
   27. Uma semana após o desapego, mude o meio para o Médio III.
   28. A partir deste dia, cultive os organoides no meio III e atualize o meio duas vezes por semana.
3. Estabelecimento da linhagem celular RB.
   NOTA: Todos os reagentes são pré-aquecidos em RT.
   1. No dia 90, os RBs (80%-90%) abrangem os organoides da retina. Portanto, escolha os organoides RB de 90 dias para a geração da linhagem celular RB.
   2. Prepare o meio 1640 misturando o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 com 10% de FBS.
   3. Corte o RB em pedaços (20-25 pedaços por RB) com uma faca microcirúrgica sob um microscópio em meio RPMI-1640.
   4. Retire o meio RPMI-1640 e trate as peças com 0,25% de tripsina/EDTA por 10 min a 37 °C.
   5. Adicione o meio RPMI-1640 para terminar a reação e centrifugar a 200 x g por 5 min.
   6. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em meio de 1640 em um prato não aderente.
   7. A linhagem celular RB é uma cultura flutuante. Mude o meio duas vezes por semana e passe as células RB dentro de 2 semanas.
      NOTA: A taxa de proliferação de células RB primárias é bastante lenta.

O procedimento de geração de RB é elucidado na Figura 1, que combina a cultura aderente e flutuante. Foi possível colher o RB humano do RB1-KO hESC e obter a linhagem celular RB isolando os organoides RB.

Aqui, o protocolo fornece os detalhes da diferenciação em diferentes estágios (Figura 2). Esferas ocas são formadas nos primeiros 3 dias que se ligam à superfície da cultura e depois se expandem (Figura 2A-E). A partir do dia 15, as células estão elevadas e a cultura em suspensão (Figura 2F). No dia seguinte ao descolamento, formam-se organoides da retina e as bordas brilhantes são visíveis (Figura 2G, setas pretas). Além disso, é provável que as células fora dos organoides morram na semana seguinte (Figura 2G, setas laranjas). No dia 27, a arquitetura da vesícula óptica é evidente e cerca de 90% dos organoides apresentam essa estrutura (Figura 2H); os organoides sem essa estrutura poderiam ser descartados. A primeira detecção do RB ocorre no dia 45 e, em seguida, torna-se palpável no dia 50 (Figura 2I). Quando cresce até o dia 90, as estruturas da vesícula óptica são envolvidas principalmente pela RB (Figura 2J). Enquanto isso, o RB poderia ser isolado como uma linhagem celular RB para cultura adicional (Figura 2K). Acima de 80% os organoides da retina seriam totalmente envolvidos pelo RB no dia 105 (Figura 2L). Eles mostram expressão de Ki67 (marcador de proliferação) e SYK (marcador oncogênico) em comparação com os organoides da retina derivados de H9, o que indica a tumorigênese nos organoides RB (Figura 2M,N). Além disso, a alta expressão de ARR3 (fabricante de precursores de cones) e CRX (marcador precursor de fotorreceptores) nos organoides RB demonstra que eles se originam de células precursoras de cone (Figura 2O,P).

O procedimento de geração de RB passa principalmente por três estágios com alterações morfológicas antes da formação de RB; aqui, o estudo fornece os resultados inferiores e superiores nessas etapas (Figura 3). A hESC diferenciada e indiferenciada (Figura 3A,B) é fácil de distinguir da morfologia, e a hESC indiferenciada é escolhida para a formação de RB. No dia 5, uma esfera oca deve gerar (Figura 3D) em vez da sólida (Figura 3C). O RB é derivado dos organoides da retina, que apresentam arquitetura de vesícula óptica (Figura 3F). Não há RB que gere nos organoides inferiores (Figura 3E).

Figura 1: Visão esquemática da diferenciação dos organoides RB. Dia 0-dia 15, as células são cultura 2D em meio I, e após o dia 15, as células são cultura de suspensão. RB é formado por volta do dia 45. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Geração e caracterização de RB. (A-C) O procedimento do estágio inicial, hESC é elevado para formar os cistos. As setas pretas em (B) mostram as bordas enroladas do hESC após o tratamento de dispase. (D,E) Os cistos se ligam às placas (D) e depois se expandem (E). (F) As células aderentes são elevadas para formar os organoides da retina. Setas pretas indicam as bordas enroladas após o tratamento de dispase. (G,H) Organoides da retina dos primeiros dias sem RB. (I, J) Os organoides da retina com RB no dia 50 (I) e no dia 90 (J), os círculos verdes evidenciam as partes RB. (K) A linhagem celular RB isolada de organoides da retina de 90 dias. (L) Os organoides RB no dia 105. (M-P) As imagens de imunofluorescência para os marcadores oncogênicos (M,N) e marcadores fotorreceptores (O,P). Em A-L, barras de escala = 200 μm; em M-P, barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação dos resultados negativos e positivos. As imagens inferiores e superiores para diferenciação no dia 0 (A,B), dia 5 (C,D) e dia 30 (E,F). Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não estão cientes de quaisquer afiliações, associações, financiamento ou participações financeiras que possam afetar a objetividade deste estudo.