Caracterização unicelular de influxo de cálcio e infecção pelo HIV-1 usando uma plataforma optofluidica multiparmétrica

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.

Resumo

O HIV-1 causa uma infecção crônica que afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. Pessoas vivendo com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) experimentam comorbidade relacionada à inflamação crônica, apesar da terapia antirretroviral. No entanto, essas sinalizações inflamatórias não foram totalmente caracterizadas. O papel dos eventos de entrada precoce na ativação de eventos de sinalização celular e expressão genética a jusante não foi capturado no nível de célula única. Aqui, os autores descrevem um método que aplica princípios da microscopia de fluorescência de células vivas a uma plataforma automatizada de células únicas que culturas e células de imagens ao longo de cursos de tempo personalizados pelo usuário, permitindo a análise de alto rendimento de processos celulares dinâmicos. Este ensaio pode rastrear a microscopia de fluorescência ao vivo unicelular de eventos precoces que seguem imediatamente a infecção pelo HIV-1, notadamente o fluxo de cálcio que acompanha a exposição ao vírus e o desenvolvimento de infecção produtiva usando um vírus repórter fluorescente. As células MT-4 são carregadas com um corante sensível ao cálcio e cultivadas em canetas isoladas em um dispositivo nanofluido. As células cultivadas estão infectadas com um vírus repórter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Um microscópio de fluorescência posicionado acima do dispositivo nanofluido mede o fluxo de cálcio ao longo de um curso de tempo de 8 minutos após a exposição aguda ao HIV-1. A infecção produtiva do HIV-1 é medida nessas mesmas células durante um intervalo de 4 dias. Os dados de imagem desses cursos de tempo são analisados para definir interações receptoras de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Os autores apresentam uma alternativa integrada e escalável aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic capaz de classificação unicelular, cultivo, imagem e automação de software. Este ensaio pode medir a cinética dos eventos em várias condições, incluindo tipo de célula, efeito agonista ou antagonista, enquanto mede uma série de parâmetros. Este é o primeiro método estabelecido para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade de alta throughput: Esta técnica pode ser amplamente adaptada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas.

Introdução

A inflamação crônica é uma das principais causas de morbidades precoces associadas ao HIV e mortalidade^1,2,3. Existem múltiplos mecanismos pelos quais o HIV pode ativar a sinalização inflamatória, e evidências recentes sugerem um papel para os receptores P2X na entrada do HIV que são receptores de adenosina triptosfato de adenosina (ATP) de cálcio^3,4,5,6,7,8,

Protocolo

1. Preparação de células para imagem

1. Prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca: Adicione 25 μL de solvente concentrado de detergente de 100x e adicione 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x a um tubo de 1,5 mL. Vórtice para misturar.
2. Pipeta 2,5 mL de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Proteja-se contra a luz.
3. Centrífuga 2 x 10⁶ células MT-4 a 500 x g por 3 min.
4. Remova a mídia e resuspense a pelota em 2 mL da solução de carregamento Fluo-4 AM preparada. Proteja-se contra a luz.
5. Células resuspended pipeta em uma placa de Petri de 35 mm. Incubar a 37 °C por 15-30 min, depo....

Resultados

A Figura 1 ilustra o formato do chip e dados de imagem bruta adquiridos através do microscópio de fluorescência. A identificação e agrupamento de células não infectadas e infectadas através da medição mCherry são mostradas na Figura 2. Esses aglomerados são analisados para cinética de influxo de cálcio na Figura 3,o que demonstra o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. A Figura 4 mostr.......

Discussão

A metodologia descrita para estudar a relação entre o fluxo de cálcio e a infecção produtiva pelo HIV-1 em células únicas pode ser adaptada para estudar cinética de cálcio intracelular em resposta a outros agonistas ou antagonistas de interesse. A preparação de células para imagens é simples, minimamente intensiva em tempo, e os reagentes estão disponíveis em kits convenientes de fabricantes amplamente utilizados. A medição de cálcio à base de fluo-4 é bem descrita na literatura, e o HIV-1 pode ser facilmente substituído.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema Optofluídico Beacon	Berkeley Lights
Soro Fetal Bovino	Gibco
Software	de código aberto	FIJI PMID: 22743772, 22930834
Kit de Imagem de Cálcio Fluo-4	Thermo Fisher	F10489
Laboratório HIV-1 NLCINL4-3	de Benjamin Chen	PMID: 28148796
Hyclone Pennecillin Estreptomicina solução	GE Healthcare Life sciences	SV30010
Células MT-4	NIH AIDS Reagente		ARP-120
Chip OptoSelect 3500	Berkeley Lights
Pontas de Pipetador	Denville Scientific	P3020-CPS
Prism 9.0.0	GraphPad
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758
Pipetas Sorológicas	Marca Fisher	13-678-11E
Capuz de cultura de tecidos	Vários modelos
Frascos T75 Corning		3073

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