Artigo de método

Caracterização unicelular de influxo de cálcio e infecção pelo HIV-1 usando uma plataforma optofluidica multiparmétrica

DOI:

10.3791/62632

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18 de maio de 2021

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.

Resumo

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O HIV-1 causa uma infecção crônica que afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. Pessoas vivendo com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) experimentam comorbidade relacionada à inflamação crônica, apesar da terapia antirretroviral. No entanto, essas sinalizações inflamatórias não foram totalmente caracterizadas. O papel dos eventos de entrada precoce na ativação de eventos de sinalização celular e expressão genética a jusante não foi capturado no nível de célula única. Aqui, os autores descrevem um método que aplica princípios da microscopia de fluorescência de células vivas a uma plataforma automatizada de células únicas que culturas e células de imagens ao longo de cursos de tempo personalizados pelo usuário, permitindo a análise de alto rendimento de processos celulares dinâmicos. Este ensaio pode rastrear a microscopia de fluorescência ao vivo unicelular de eventos precoces que seguem imediatamente a infecção pelo HIV-1, notadamente o fluxo de cálcio que acompanha a exposição ao vírus e o desenvolvimento de infecção produtiva usando um vírus repórter fluorescente. As células MT-4 são carregadas com um corante sensível ao cálcio e cultivadas em canetas isoladas em um dispositivo nanofluido. As células cultivadas estão infectadas com um vírus repórter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Um microscópio de fluorescência posicionado acima do dispositivo nanofluido mede o fluxo de cálcio ao longo de um curso de tempo de 8 minutos após a exposição aguda ao HIV-1. A infecção produtiva do HIV-1 é medida nessas mesmas células durante um intervalo de 4 dias. Os dados de imagem desses cursos de tempo são analisados para definir interações receptoras de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Os autores apresentam uma alternativa integrada e escalável aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic capaz de classificação unicelular, cultivo, imagem e automação de software. Este ensaio pode medir a cinética dos eventos em várias condições, incluindo tipo de célula, efeito agonista ou antagonista, enquanto mede uma série de parâmetros. Este é o primeiro método estabelecido para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade de alta throughput: Esta técnica pode ser amplamente adaptada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas.

Introdução

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A inflamação crônica é uma das principais causas de morbidades precoces associadas ao HIV e mortalidade1,2,3. Existem múltiplos mecanismos pelos quais o HIV pode ativar a sinalização inflamatória, e evidências recentes sugerem um papel para os receptores P2X na entrada do HIV que são receptores de adenosina triptosfato de adenosina (ATP) de cálcio3,4,5,6,7,8,9,10. O subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) pode ser importante facilitador desta inflamação. No entanto, os mecanismos moleculares das interações HIV-P2XR são amplamente desconhecidos e podem impactar as etapas do ciclo de vida viral do HIV-1. Definir os caminhos e cinéticas que conduzem a inflamação crônica associada ao HIV é fundamental para o avanço das opções de tratamento para pessoas com HIV.

Para avaliar se o HIV-1 agoniza diretamente os receptores P2X, a ativação P2XR e a infecção pelo HIV-1 devem ser medidos em paralelo. Ensaios da atividade P2XR e infecção pelo HIV-1 foram estabelecidos de forma independente: o fluxo de cálcio celular é um indicador da ativação P2XR, e a infecção produtiva pelo HIV-1 pode ser quantificada pela abundância de RNA. A detecção de fluorescência do fluxo de cálcio é possível com o corante sensível ao cálcio Fluo-4, e a infecção pelo HIV-1 pode ser visualizada com o vírus mCherry fluorescente HIV-NLCI11,12,13,14,15.

Como esses indicadores de ativação P2X (fluxo de cálcio celular agudo) e infecção pelo HIV-1 (síntese de RNA HIV-1) ocorrem em diferentes escalas de tempo (minutos versus dias), falta um método de alta produtividade que permita a análise emparelhada da ativação P2XR e da infecção pelo HIV-1. Técnicas experimentais padrão de alto rendimento, como a citometria de fluxo, permitem a análise populacional, mas não podem avaliar a relação entre eventos agudos e longitudinais em células únicas. Alternativamente, a imagem unicelular com microscopia de fluorescência padrão é de baixa produtividade. Essas limitações experimentais apresentam a necessidade de novas técnicas de alta produtividade para medir associações entre eventos celulares agudos e longitudinais diretamente.

Um sistema optofluido descrito é uma nova plataforma capaz de triagem e isolamento unicelulares, culminando, imagem e automação de software16,17,18,19. Este sistema apresenta uma alternativa integrada e de alto rendimento às limitações dos métodos tradicionais de imagem. A plataforma Beacon consiste em um dióxido de carbono (CO2) e uma incubadora controlada pela temperatura que suporta células contidas em um chip. O chip possui transistores fotosensíveis que geram um gradiente elétrico em resposta à luz direcionada. Esta força dielectrophoretic resultante é usada para mover células individuais através do chip nanofluido para as regiões desejadas. As células são classificadas em canetas no chip, que fornecem uma barreira para isolar células individuais fisicamente. O fluxo contínuo de mídia de crescimento em todo o chip impede a migração celular das canetas, permitindo a difusão de pequenas partículas de nutrientes e reagentes específicos do experimento. Um microscópio de fluorescência fica acima do chip. A automação de software é usada para capturar imagens do chip no ponto de tempo especificado pelo usuário.

Toda a caracterização celular foi realizada utilizando-se um sistema optofluido para seleção e manipulação de células únicas. Este sistema consiste em componentes mecânicos, microfluidos e ópticos integrados que permitem manipulação de células únicas, ensaio, cultura e imagem. As células são carregadas e cultivadas no dispositivo nanofluido descartável composto por 3.500 câmaras individuais (canetas), cada uma capaz de segurar volume sub-nanolílito. As células podem ser posicionadas dentro de canetas usando "gaiolas" dielectrophoretic induzidas pela luz e cultivadas sob condições controladas por temperatura e CO2. Os microfluidos permitem a perfusão de mídia ou buffers no chip para cultura celular ou tratamento medicamentoso. Uma agulha acionada permite a importação e exportação de células de placas de poços incubadas e fechadas. A área do chip pode ser visualizada em ampliação de 4x ou 10x em canais brightfield e fluorescentes (incluindo DAPI, FITC, TRed ou Cy5) para caracterizar fenótipos celulares ou análise funcional. Todo o sistema é automatizado usando software que pode ser usado para fluxos de trabalho pré-projetados ou experimentos personalizados.

Foram estudadas relações entre a infecção pelo HIV-1 e o P2XR, mas não foi relatado um procedimento de alto rendimento para caracterizar diretamente essas interações em paralelo. Aqui, os autores descrevem uma metodologia para estudar as interações HIV-P2XR através do rastreamento do fluxo agudo de cálcio e da infecção produtiva subsequente do HIV-1 no nível unicelular. Notavelmente, isso estabelece uma nova ferramenta que permite a medição direta, de alto rendimento e longitudinal de múltiplos alvos em células únicas.

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Protocolo

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1. Preparação de células para imagem

  1. Prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca: Adicione 25 μL de solvente concentrado de detergente de 100x e adicione 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x a um tubo de 1,5 mL. Vórtice para misturar.
  2. Pipeta 2,5 mL de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Proteja-se contra a luz.
  3. Centrífuga 2 x 106 células MT-4 a 500 x g por 3 min.
  4. Remova a mídia e resuspense a pelota em 2 mL da solução de carregamento Fluo-4 AM preparada. Proteja-se contra a luz.
  5. Células resuspended pipeta em uma placa de Petri de 35 mm. Incubar a 37 °C por 15-30 min, depois incubar por mais 15-30 min em temperatura ambiente.
  6. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga. Centrífugas a 500 x g por 3 min e removam o supernascedor consistindo da solução de carregamento.
  7. Resuspengue a pelota celular pipetando em 1 mL do meio de cultura e centrífuga a 500 x g por 3 min para lavar.
  8. Resuspend a pelota celular por pipetação no meio de cultura a uma concentração de 2 x 106 células/mL (mínimo 50 μL). Proteja-se contra a luz.

2. Preparação do sistema optofluídico, carregamento de células e penning de células

  1. Prepare um chip com a solução de molhar, que facilita a escrita celular.
    1. Para isso, carregue tubos de centrífugas contendo 2 mL de solução de molhar e 50 mL de água DI no instrumento com um novo chip optofluídico e execute a função Chip Molhado. Esta função inundará automaticamente o chip com a solução de molhar através da fluidez do sistema, incubará o chip a 50, °C e lavará o chip com água 3 vezes.
    2. Uma vez feito o flushing de água, lave o chip com 3 ciclos de 250 μL de mídia cultural.
  2. Suplemente a suspensão celular da etapa 1.8 com 1:100 F-127 detergente soluto antes do carregamento para reduzir a probabilidade de as células grudando nos canais do chip.
  3. Use a agulha de exportação de instrumentos para importar células de um tubo de centrífuga de 1,5 mL usando a operação de carga e importação de pequeno volume para um volume de embalagem de célula de 5 μL.
  4. Células de caneta utilizando uma tensão de posicionamento optoeletrônico otimizada (OEP) de velocidade de gaiola de 4,3 V e 5 μm/s. A penning ocorre usando OEP. Realize a escrita usando a função Autopen, que irá autodetectar células únicas, cercá-las com uma gaiola OEP e movê-las para uma caneta próxima. Se as células de interesse permanecerem após a escrita automática, use a função caneta Manual para selecionar células-alvo (com um clique do mouse) e uma caneta de destino (com um clique subsequente do mouse).
  5. Uma vez que a escrita esteja completa (quando a função Autopen for concluída ou quando o número desejado de células escritas tiver sido atingido), lave o chip com 3 ciclos de 250 μL de mídia cultural para limpar qualquer célula não suspensa restante do chip.

3. Infecção de células únicas e imagem funcional

  1. Depois de escrever células, obtenha imagens fluorescentes de células nos canais FITC, Texas Red e DAPI para medir a linha de base Fluo-4, mCherry e autofluorescência.
  2. Infundir HIV-1 no microchip a uma concentração de 13 ng de HIV-1 NL-CI por 2 x 106 células, canalizar lentamente a suspensão para dentro do chip através da agulha de exportação.
  3. Imediatamente após a adição do HIV-1, obtenha repetidamente imagens nos canais FITC e DAPI ao longo de um curso de tempo de 10 minutos.
  4. Obtenha imagens nos canais Texas Red e DAPI em 1-, 2,3 e 4 dias pós-infecção (DPI).

4. Análise de dados de imagem funcional unicelulares com software FIJI

  1. Em cada momento em cada canal de imagem de interesse, use a ferramenta fiji point selection e a função Measure para medir os sinais fluo-4, mCherry e autofluorescência de cada célula. Meça simultaneamente a fluorescência de fundo calculando a intensidade média de fluorescência (IME) da caneta e do chip contendo cada célula.
  2. Controle para a fluorescência de fundo e autofluorescência usando a função Medida para encontrar o MFI em uma Seleção de Região e subtraindo esse valor do valor da fluorescência celular.
  3. Normalize a fluorescência de fundo de cada imagem do chip: Meça o MFI do chip em cada campo. Em seguida, subtraia o MFI do chip com a menor fluorescência de fundo de todas as outras medidas de MFI do chip.
  4. Normalize a fluorescência de fundo de cada caneta contendo células: meça o IMfi da caneta de cada célula em cada campo de visão. Em seguida, subtraia esse valor do MFI bruto da célula para cada campo.
  5. Controle para a autofluorescência celular: Subtraia o dia 0 e o dia 4 DAPI MFI de cada célula do dia 0 e dia 4 mCherry MFIs.

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Resultados

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A Figura 1 ilustra o formato do chip e dados de imagem bruta adquiridos através do microscópio de fluorescência. A identificação e agrupamento de células não infectadas e infectadas através da medição mCherry são mostradas na Figura 2. Esses aglomerados são analisados para cinética de influxo de cálcio na Figura 3,o que demonstra o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. A Figura 4 mostr...

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Discussão

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A metodologia descrita para estudar a relação entre o fluxo de cálcio e a infecção produtiva pelo HIV-1 em células únicas pode ser adaptada para estudar cinética de cálcio intracelular em resposta a outros agonistas ou antagonistas de interesse. A preparação de células para imagens é simples, minimamente intensiva em tempo, e os reagentes estão disponíveis em kits convenientes de fabricantes amplamente utilizados. A medição de cálcio à base de fluo-4 é bem descrita na literatura, e o HIV-1 pode ser facilmente substituído...

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Divulgações

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R.P.S. é um empregado da Sema4. Os outros autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

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Somos gratos pelas discussões científicas com o Dr. Benjamin Chen. Este trabalho foi financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Sistema Optofluídico BeaconBerkeley Lights
  Soro Fetal BovinoGibco
  Softwarede código abertoFIJI PMID: 22743772, 22930834
  Kit de Imagem de Cálcio Fluo-4Thermo Fisher  F10489
  Laboratório HIV-1 NLCINL4-3de Benjamin ChenPMID: 28148796
  Hyclone Pennecillin Estreptomicina soluçãoGE Healthcare Life sciences  SV30010
  Células MT-4NIH AIDS Reagente  ARP-120
  Chip OptoSelect 3500Berkeley Lights
  Pontas de PipetadorDenville Scientific  P3020-CPS
  Prism 9.0.0GraphPad
  RPMI-1640Sigma-Aldrich  R8758
Pipetas SorológicasMarca Fisher  13-678-11E
Capuz de cultura de tecidosVários modelos
Frascos T75 Corning3073
Médio

Referências

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