Amostragem de tecido adiposo subcutâneo humano usando uma técnica de mini-lipoaspiração

Summary

O manuscrito e o vídeo associado demonstram uma técnica de biópsia percutânea para obter amostras de tecido adiposo subcutâneo de áreas ao redor do umbigo. Este método é uma maneira de baixo risco e eficiente para investigar uma série de parâmetros (por exemplo, expressão genética ou proteica, atividade enzimática, conteúdo lipídico) dentro do tecido adiposo.

Abstract

Estudos sobre tecido adiposo são úteis na compreensão metabólica e outras condições. O tecido adiposo subcutâneo humano é acessível. Com treinamento adequado e rigorosa adesão à técnica asséptica, amostras de adiposos subcutâneos podem ser obtidas de forma segura e eficiente em um ambiente não clínico pelos pesquisadores. Após a administração do lado anestésico local ao umbigo, uma agulha de 14 G presa a uma seringa de 5 ou 10 mL é inserida através da pele no tecido subcutâneo. Sob sucção, a seringa é movida em um movimento recíproco e fatiado para isolar fragmentos de tecido adiposo. Retirar o êmbolo é suficiente para garantir que fragmentos de tecido adiposo sejam aspirados através da agulha na seringa. Uma única biópsia pode coletar cerca de 200 mg de tecido. Esta técnica de biópsia é muito segura tanto para os participantes quanto para a equipe de pesquisa. Após a biópsia, os participantes podem retomar a maioria das atividades cotidianas, embora evitem natação e atividades excessivamente extenuantes por 48h para evitar sangramento excessivo. Os participantes podem realizar duas biópsias com segurança em um único dia, o que significa que a técnica pode ser aplicada em estudos de intervenção aguda antes do pós-adoeça.

Introduction

O tecido adiposo pode fornecer informações úteis sobre a função metabólica dos seres humanos. O tecido adiposo subcutâneo humano é facilmente acessível. Uma técnica para extração subcutânea de tecido adiposo foi descrita pela primeira vez em meados dos anos 80¹; desde então, o protocolo inicial foi aprimorado para aumentar o rendimento e melhorar a tolerabilidade dos participantes do estudo. O tecido adiposo subcutâneo pode ser obtido de inúmeros locais, mais comumente a partir da glutei¹ e área abdominal². As amostras deste último podem ser mais desejáveis, pois fornecem informações mais valiosas em contextos relacionados à doença metabólica³.

A biópsia subcutânea do tecido adiposo usando o método de mini-lipoaspiração pode ser realizada de forma segura e eficiente em um ambiente não clínico. Após o treinamento adequado por um médico certificado pelo conselho e usando uma técnica asséptica rigorosa, os pesquisadores podem realizar rotineiramente essas biópsias com risco mínimo tanto para o participante quanto para os pesquisadores. A equipe de biópsia deve ser composta por pelo menos 2 indivíduos: a pessoa que fará a biópsia e um assistente.

O responsável pela biópsia é incumbido de confirmar a identidade do participante, verificar se pode submeter com segurança ao procedimento (veja as etapas do protocolo 2.1-2.4 abaixo), garantindo que o participante esteja confortável durante todo o procedimento, garantindo a manutenção da técnica estéril durante todo o procedimento, realizando o procedimento e fornecendo ao participante procedimentos verbais e escritos após o atendimento. O papel do assistente é manusear e processar rapidamente o tecido adiposo obtido para análise e/ou armazenamento posteriores. O assistente também ajuda por ser as "mãos não estéreis" e garantir que o participante esteja à vontade durante todo o procedimento. O objetivo deste vídeo e papel é descrever o procedimento de biópsia passo a passo para obter com segurança tecido adiposo subcutâneo da área abdominal.

Protocol

NOTA: O Comitê de Pesquisa Clínica da Universidade de Stirling, Invasivo ou Clínico aprovou o procedimento de biópsia descrito abaixo. Todos os estudos de pesquisa que utilizam esse procedimento devem ser aprovados pelo comitê de ética independente apropriado. O fazsocedor de biópsia deve ter concluído o treinamento formal na técnica descrita de acordo com as exigências de sua instituição. Normalmente, isso envolve observar uma demonstração da técnica de biópsia de tecido adiposo descrita por um médico certificado pela diretoria, seguida de prática supervisionada. Uma vez que o estagiário tenha realizado 10 biópsias de tecido adiposo prática em assuntos voluntários sob supervisão, eles serão examinados por um médico certificado pelo conselho para garantir o bom conhecimento e a prática do procedimento. O médico certificado pelo conselho, então, fornece ao indivíduo um formulário de exame assinado.

1. Preparação da sala de laboratório

1. Certifique-se de que o laboratório tenha um quarto apropriadamente privado com superfícies não porosas limpas e limpas e uma cama limpa e confortável (de preferência não porosa) na qual o participante possa se deitar supino. Limpe todas as superfícies necessárias para o procedimento de biópsia usando 70% de spray de etanol e toalhas de papel limpas. Forneça travesseiros ou almofadas limpas para apoiar o participante, se necessário.
2. Mantenha as caixas de descarte de nitidez apropriadas e sacos de resíduos de risco biológico ao alcance fácil da área onde a biópsia está sendo realizada e ao fácil alcance da pessoa que faz a biópsia.
3. Prepare os equipamentos necessários para o procedimento e configure-se em um carrinho médico geral recém-limpo antes da chegada do participante ao laboratório (Figura 1). Para obter uma lista completa de materiais de consumo necessários, consulte a Tabela de Materiais.

2. Preparação do participante

1. Certifique-se de que todos os participantes forneçam consentimento por escrito informado antes de se submeterem ao procedimento de acordo com os protocolos exigidos pelo comitê de ética independente da instituição. Além disso, peça aos participantes que completem um questionário escrito para garantir que eles não sejam alérgicos a nenhum material utilizado no procedimento (ou seja, níquel, cromo, anestésico local, iodo, mariscos e plasters).
2. Confirme a identidade do participante. Certifique-se de que o participante entenda o procedimento a ser realizado e potenciais efeitos secundários, incluindo hematomas, dor e infecção (Tabela 1). Reúna o consentimento verbal, além do consentimento informado por escrito previamente obtido.
3. Descreva ao participante como será realizado o procedimento, com ênfase em como será a administração do anestésico e da biópsia em si. Certifique-se de que o participante está confortável com o processo.
   NOTA: O anestésico subcutâneo local produzirá uma sensação de picada, semelhante a uma picada de abelha de curta duração. Muitos participantes relatam a administração anestésico como a parte mais desconfortável da técnica. Uma vez que o anestésico tenha feito efeito, o participante não deve sentir mais do que uma leve sensação de puxão durante a biópsia.
4. Certifique-se de que o participante não tenha alergia ao anestésico local (especificamente do tipo amino-amido, se usar lidocaína ou similar), certos metais (níquel e cromo) e mariscos (se usar soluções à base de iodo). Além disso, certifique-se de que os participantes não estejam tomando nenhuma forma de medicação anticoagulante.
5. Proporcionar ao participante a oportunidade de ir e esvaziar sua bexiga, se necessário, para garantir que ele não tenha que interromper o procedimento ou sentir desconforto indevido na etapa 4.1.

3. Procedimento de biópsia - instruções para o tomador de biópsia

1. Uma vez que o participante esteja deitado em uma posição supina, identifique o local da biópsia aproximadamente 5-10 cm lateral ao umbigo.
   NOTA: Se o participante for submetido a múltiplas biópsias no mesmo dia, identifique locais de biópsia em lados opostos do umbigo para cada biópsia. Isso garantirá a distância máxima entre cada local da biópsia.
2. Lave as mãos com sabão e água morna de acordo com as diretrizes médicas padrão⁴.
3. Coloque a folha estéril no carrinho limpo ou na área de trabalho, tomando o cuidado de tocar apenas as bordas externas da folha.
4. Coloque luvas cirúrgicas estéreis usando técnica asséptica adequada. Que o assistente abra o resto do equipamento de tal forma que ele caia sobre a folha estéril preparada sem tocar/contaminar o equipamento. Certifique-se de que o assistente tome cuidado para não tocar nos itens ao remover ferramentas de suas embalagens estéreis.
5. Instrua o assistente a dispensar uma pequena quantidade de solução à base de iodo em alguma gaze estéril (sem saturar demais a gaze) na superfície de trabalho.
6. Esterilize aproximadamente 5-10 cm² em torno do local de biópsia escolhido usando a gaze estéril e a solução à base de iodo. Certifique-se de que a pele está limpa em um movimento em espiral movendo-se para fora do local da biópsia proposta. Repita o procedimento de limpeza da pele duas vezes. Remova o excesso de líquido (por exemplo, saindo da área estéril) limpando com gaze estéril fresca.
7. Junto com o assistente, confirme verbalmente o conteúdo do frasco anestésico local (2% lidocaína neste protocolo) e que isso está dentro do prazo de validade. Instrua o assistente a segurar o frasco aberto de cabeça para baixo e desenhe 5 mL de anestésico local em uma seringa, usando uma agulha de 21 G. Descarte a agulha na caixa afiada e garanta que a seringa esteja livre de bolhas de ar.
8. Aplique uma agulha de 26 G na seringa e expulse quaisquer bolhas de ar. Belisque suavemente a pele abdominal e o tecido adiposo, afastando-o da parede abdominal. Em seguida, insira a agulha horizontalmente no tecido subcutâneo em um ângulo não superior a 10° em relação à superfície da pele.
   1. Retire o êmbolo da seringa um adicional de 0,5 mL (para garantir que a agulha não esteja em um vaso sanguíneo). Se o sangue aparecer na seringa, retire e reinsera a agulha em um ângulo diferente.
   2. Levante um bleb de 2-4 mm de diâmetro para anestesiar a área de inserção.
   3. Avance a agulha para o tecido subcutâneo e administre ~1 mL de lidocaína em um padrão em forma de ventilador (Figura 2), tomando o cuidado de retirar o êmbolo cada vez antes de injetar o anestésico.
   4. Retire e descarte a agulha de 26 G, aplique uma agulha de 21 G na seringa, expulse quaisquer bolhas de ar e administre o restante de ~4 mL de lidocaína em um padrão em forma de ventilador (Figura 2), tomando o cuidado de retirar o êmbolo cada vez antes de injetar o anestésico.
9. Espere aproximadamente 5 min para que o anestésico local faça efeito. Use um bisturi estéril para fixar suavemente a área de biópsia para i) garantir que o anestésico local tenha efeito e ii) identificar os limites da área anestesiada. Se necessário, espere um minuto ou dois adicionais e reavalie.
10. Uma vez satisfeito que o anestésico local está funcionando, belisque suavemente a pele e o tecido adiposo (como na etapa 3.8) e use um bisturi estéril para fazer uma pequena punção de 1-2 mm na pele.
    NOTA: Isso só precisa ser grande o suficiente para facilitar a entrada da agulha de 14 G e deve ser pequeno o suficiente para que nenhuma sutura seja necessária para fechá-la. É comum que algum sangramento ocorra a partir deste ponto, que pode ser controlado com um pedaço de gaze estéril.
11. Primeiro, aplique uma agulha de 14 G em uma seringa de 5 ou 10 mL. Em seguida, ao beliscar suavemente a pele e o tecido adiposo, insira gradualmente a agulha através da punção no tecido adiposo aproximadamente centralmente na área anestesiada e em um ângulo não superior a 10° em relação à superfície da pele.
    NOTA: Para todos os casos de avanço da agulha na etapa 3.11, deve-se manter um ângulo de seringa não superior a 10°.
    1. Aplique a sucção retirando o êmbolo para aproximadamente a marca de 2,5 mL. Faça a biópsia movendo a agulha em um movimento rápido para trás e para frente para cortar fragmentos de tecido adiposo. Após aproximadamente 30 s, torça a agulha e a seringa através de 90° e repita este procedimento para quebrar os fragmentos do tecido adiposo, que são então aspirados na seringa pela sucção.
       NOTA: Outros tamanhos de seringa podem ser usados. É essencial que o pesquisador selecione um tamanho de seringa que permita tanto uma boa aderência na seringa quanto para manter confortavelmente a retração do êmbolo para manutenção do vácuo. Estão disponíveis seringas de bloqueio que mantêm o vácuo, o que pode melhorar o controle da agulha e reduzir a dificuldade percebida para o tomador de biópsia ⁵.
    2. Após aproximadamente 45-60 s da etapa 3.11.1, remova a agulha e esvazie o conteúdo da seringa em uma camada de gaze cobrindo um barco de pesagem. Certifique-se de que o lúmen da agulha está voltado para baixo para evitar possíveis respingos de sangue.
    3. Repetir as etapas 3.11.1 e 3.11.2 para um máximo de 3 vezes. Verifique se o participante está contente em prosseguir antes de cada repetição do procedimento acima.
    4. Ao realizar as etapas 3.11.1 e 3.11.2, instrua o assistente a processar e preparar as amostras para análise/armazenamento (ver seção 5).

4. Procedimento pós-biópsia

1. Uma vez que uma amostra satisfatória (ou seja, ~200 mg) de tecido adiposo tenha sido obtida, coloque 1-2 camadas de gaze estéril sobre a ferida de perfuração, em seguida, coloque uma bolsa de gelo sobre estes, e aplique pressão firme por aproximadamente 10 minutos para induzir hemostase.
2. Quando a hemostasia ocorrer, limpe qualquer solução/sangue seco à base de iodo com gaze estéril e aplique um curativo de ferida adesiva com almofada absorvente no local. Verifique se o participante se sente bem e forneça instruções verbais e escritas no aftercare do local da biópsia.
   1. Enfatize que os participantes provavelmente exibirão algumas contusões nos próximos dias. Informe-os que isso pode ser substancial, embora seja minimizado pela bolsa de gelo na etapa 4.1 e resolverá sem efeitos duradouros.
   2. Recomendo que, caso os participantes sintam algum desconforto/dor uma vez que o anestésico tenha passado, eles devem tomar analgésicos como paracetamol seguindo as instruções no pacote, mas abster-se de tomar analgésicos que tenham atividades anticoagulantes (por exemplo, ibuprofeno ou aspirina).
   3. Explique que inchaço, vermelhidão ou descarga do local da biópsia são indícios de infecção. No caso improvável de que esses sinais ou sintomas ocorram, instrua o participante a procurar urgentemente orientação médica de um médico ou unidade local de Acidente & Emergência. Informe o participante que, caso procure orientação médica, também deve notificar a equipe de pesquisa.
      NOTA: Como equipe de pesquisa, nem o usuário da biópsia nem o assistente podem fornecer orientação médica ou tratamento; no entanto, é importante que a equipe de pesquisa esteja ciente e regisse todos os casos de complicações decorrentes do procedimento de biópsia.
   4. Recomendo que os participantes evitem nadar ou atividade excessivamente extenuante por 48h até que o local da incisão seja fechado.
3. Limpe todos os pontiagudos e materiais contaminados usados em pontiagudos e/ou recipientes de resíduos clínicos.
4. Limpe todas as superfícies utilizadas no procedimento de biópsia usando spray de etanol de 70% e toalhas de papel limpas. Coloque itens descartáveis e não descartáveis de roupa de cama em sacos clínicos apropriados para descarte ou limpeza, respectivamente.

5. Processamento de amostras - instruções para o assistente

1. Use pinças estéreis e 0,9% soro fisiológico para enxaguar a amostra de tecido adiposo para remover contaminantes visíveis (ou seja, sangue, vasculatura). Em seguida, pese as amostras de tecido adiposo usando escamas digitais. Divida o tecido em pedaços de tamanho adequado para análise a jusante e coloque-os em tubos de armazenamento apropriados usando pinças estéreis. Mergulhe os tubos contendo as biópsias de tecido adiposo em nitrogênio líquido a -190 °C até que as amostras sejam armazenadas a -80 °C.
   NOTA: O assistente deve concluir o processamento da amostra o mais rápido possível, normalmente dentro de 3 minutos de aspiração amostral, para minimizar a degradação potencial da amostra.

Results

O procedimento descrito de biópsia de tecido adiposo é uma técnica eficiente e de baixo risco para os pesquisadores obterem amostras de tecido adiposo subcutâneo de voluntários humanos. Foram realizadas 39 biópsias subcutâneas de tecido adiposo utilizando o procedimento descrito em 11 mulheres saudáveis e de peso normal (idade, 27,4 ± 3,3 anos; índice de massa corporal (IMC), 22,6 ± 1,5 kg.m²). Todos os participantes compareceram ao laboratório entre 7h e 10h, após um período de jejum de 8 a 12 horas. O rendim...

Discussion

O protocolo descrito e o vídeo associado fornecem uma visão geral passo a passo de uma técnica de mini-lipoaspiração para obter amostras de tecido adiposo subcutâneo da área abdominal. Este grupo de pesquisa realizou um total de 124 biópsias ao longo de 19 meses sem efeitos adversos nos participantes. O procedimento é seguro e associado ao risco mínimo aos participantes ou à equipe de biópsia, desde que sejam seguidas as medidas de segurança descritas. A técnica asséptica (incluindo abertura e dispensação de equipamentos...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item: 14 G agulha 14 G x 3 1/8" 210 mm x 80 mm	B Braun	4665473	Por biópsia: 1
Item: 21 G agulha 21 G x 1 1/2" 0.8 mm x 38 mm	Terumo	AN*2138R1	Por biópsia: 2
Item: 26 G  agulha 26 G x 1/2" agulha microlance 0.45 mm x 13 mm	BD	303800	Por biópsia: 2
Item: Seringa de 5 mL 5 mL luer	DB plastipak	302187	Por biópsia: 2
Item: Curativo adesivo para feridas Curativo pós-operatório Opsite 9,5 x 8,5	Smith & Sobrinho	6600709	Por biópsia: 1
Item: Bisturi estéril descartável Bisturi descartável Lâmina estéril nº 10	Swann Morton	/0501	Por biópsia: 1
Item: Icepack BlueDot Reutilizável Hot/Cold Pack 26,5 cm x 13,0 cm	NuCare	F711	Por biópsia: 1
Item: Solução antisséptica à base de iodo Solução antisséptica Videne	Ecolab Videne	3030440	Per biópsia: q.s
Item: Lidocaína 2% sem epinefrina Lidocaína 2% injeção 5 mL	B Braun	3558553	Por biópsia: 5 mL
Item: Luvas não estéreis Luvas de nitrilo sem pó sensível Starguard	Starguard	SG-N-S	Por biópsia: par
Item: Cloreto de sódio 0,9% Chlride de sódio 0,9% p/v infusão intravenosa BP	BBraun	S8004-5384	Por biópsia: q.s.
Item: Solução de estabilização* Solução de estabilização de RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	Por biópsia: q.s
Item: Pinça estéril Pinça estéril	Rocialle	RML109-006	Por biópsia: 1
Item: Cotonetes de gaze estéreis Cotonetes não tecidos estéreis 7,5 x 7,5 cm	Prestige	1860	Por biópsia: 5
Item: Luvas estéreis Luvas médicas sem pó estéril de vinil macio Prestige		S: P4301 M:P3302 L:P3301	Por biópsia: par
Item: Tubos de microcentrífuga estéreis 1,5 mL Tubos de microcentrífuga estéreis	StarLab	I1415-5510	Por biópsia: q.s
Item: Folha estéril Papel branco liso 90 x 90 cm	Rocialle	RML 126-216	Por biópsia: 1
Item: Barco de pesagem Barcos de pesagem em forma de diamante	Heathrow Scientific	HS1427C	Por biópsia: 1
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