Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

Resumo

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Resumo

Assim como a análise típica de RNA-Seq para medir a expressão gênica diferencial (DGE) em condições experimentais / biológicas, os dados de RNA-seq também podem ser utilizados para explorar outros mecanismos regulatórios complexos no nível do éxon. O splicing alternativo e a poliadenilação desempenham um papel crucial na diversidade funcional de um gene, gerando diferentes isoformas para regular a expressão gênica no nível pós-transcricional, e limitar as análises a todo o nível do gene pode perder essa importante camada reguladora. Aqui, demonstramos análises detalhadas passo a passo para identificação e visualização do uso diferencial do éxon e do local de poliadenilação em todas as condições, usando Bioconductor e outros pacotes e funções, incluindo DEXSeq, diffSplice do pacote Limma e rMATS.

Introdução

O RNA-seq tem sido amplamente utilizado ao longo dos anos, tipicamente para estimar a expressão gênica diferencial e a descoberta de genes¹. Além disso, também pode ser utilizado para estimar o uso variável do nível de éxons devido ao gene que expressa diferentes isoformas, contribuindo assim para uma melhor compreensão da regulação gênica no nível pós-transcricional. A maioria dos genes eucarióticos gera diferentes isoformas por splicing alternativo (AS) para aumentar a diversidade de expressão de mRNA. Os eventos AS podem ser divididos em diferentes padrões: pulando éxons completos (SE), onde um éxon ("") é completamente removido da transcriç....

Protocolo

1. Instalação de ferramentas e pacotes R utilizados na análise

1. Conda é um gerenciador de pacotes popular e flexível que permite a instalação conveniente de pacotes com suas dependências em todas as plataformas. Use 'Anaconda' (gerenciador de pacotes conda) para instalar 'conda', que pode ser usado para instalar as ferramentas/pacotes necessários para a análise.
2. Baixe 'Anaconda' de acordo com os requisitos do sistema de https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads e instale-o seguindo as instruções no instalador gráfico. Instale todos os pacotes necessários usando 'conda' digitando o seguint....

Resultados

Depois de executar o fluxo de trabalho passo a passo acima, as saídas de análise AS e APA e os resultados representativos estão na forma de tabelas e gráficos de dados, gerados da seguinte maneira.

COMO:
O principal resultado da análise AS (Tabela Suplementar 1 para diffSplice; Tabela 2 para DEXSeq) é uma lista de éxons mostrando o uso diferencial entre as condições, e uma lista de genes mostrando atividade de splicing global significativa .......

Discussão

Neste estudo, avaliamos abordagens baseadas em éxons e eventos para detectar EA e APA em dados de RNA-Seq e sequenciamento final de 3'. As abordagens AS baseadas em éxons produzem uma lista de éxons diferencialmente expressos e uma classificação em nível de gene ordenada pela significância estatística da atividade de splicing diferencial geral em nível de gene (Tabelas 1-2, 4-5). Para o pacote diffSplice, o uso diferencial é determinado pelo ajuste de modelos lineares ponderados em um nível de éxon para .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

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computacional