Artigo de método

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

DOI:

10.3791/62643

⸱

22 de fevereiro de 2022

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A reprogramação cardíaca tornou-se uma terapia potencialmente promissora para reparar um coração danificado. Ao introduzir múltiplos fatores de transcrição, incluindo Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados em cardiomiócitos induzidos (iCMs). Esses iCMs, quando gerados in situ em um coração infartado, integram-se eletricamente e mecanicamente com o miocárdio circundante, levando a uma redução no tamanho da cicatriz e uma melhora na função cardíaca. Devido à eficiência, pureza e qualidade relativamente baixa da reprogramação dos iCMs, a caracterização dos ICMs continua sendo um desafio. Os métodos atualmente utilizados neste campo, incluindo citometria de fluxo, imunocytoquímica e qPCR, concentram-se principalmente na expressão genética e proteína específica do coração, mas não na maturação funcional dos ICMs. Desencadeada por potenciais de ação, a abertura de canais de cálcio fechados com tensão em cardiomiócitos leva a um rápido fluxo de cálcio na célula. Portanto, quantificar a taxa de influxo de cálcio é um método promissor para avaliar a função cardiomiócito. Aqui, o protocolo introduz um método para avaliar a função do ICMS por fluxo de cálcio (Ca2+). Uma cepa de rato αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 foi estabelecida cruzando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referido como Myh6-Cre abaixo) com gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo). Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) de camundongos neonatais P0-P2 foram isolados e cultivados in vitro, e uma construção policistrônica de MGT foi introduzida aos NCFs, o que levou à sua reprogramação para iCMs. Como somente os iCMs reprogramados com sucesso expressarão o repórter GCaMP3, a maturação funcional dos iCMs pode ser avaliada visualmente pelo fluxo Ca2+ com microscopia de fluorescência. Em comparação com os NCFs não reprogramados, os NCF-iCMs apresentaram fluxo transitório de cálcio significativo e contração espontânea, semelhante aos CMs. Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento da cepa do camundongo, isolamento e seleção de corações de camundongos neonatais, isolamento de NCF, produção de retrovírus para reprogramação cardíaca, indução de ICMS, avaliação do fluxo de ICMS Ca2+ utilizando nossa linha de repórteres, e análise estatística relacionada e apresentação de dados. Espera-se que os métodos aqui descritos forneçam uma plataforma valiosa para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca.

Introdução

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O infarto do miocárdio (MI) é uma doença grave em todo o mundo. As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte no mundo e respondem por aproximadamente 18,6 milhões de mortes em 20191,2. A mortalidade total de DCV diminuiu ao longo do último meio século. No entanto, essa tendência tem sido desacelerada ou até mesmo revertida em alguns países não desenvolvidos1, o que exige tratamentos mais eficazes dos DCV. Como uma das manifestações fatais da DCV, o MI é responsável por cerca de metade de todas as mortes atribuídas aos DCV nos Estados Unidos2. Durante a isquemia, com o bloqueio das artérias coronárias e o fornecimento limitado de nutrientes e oxigênio, o miocárdio sofre alterações metabólicas graves, prejudica a função sistólica dos cardiomiócitos (CMs), e leva à morte de CM3. Inúmeras abordagens na pesquisa cardiovascular têm sido exploradas para reparar lesões cardíacas e restaurar a função do coração ferido4. A reprogramação cardíaca direta surgiu como uma estratégia promissora para reparar o coração danificado e restaurar sua função5,6. Ao introduzir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), os fibroblastos podem ser reprogramados para iCMs in vitro e in vivo, e esses iCMs podem reduzir a área da cicatriz e melhorar a função cardíaca7,8.

Embora a reprogramação cardíaca seja uma estratégia promissora para o tratamento de MI, ainda há uma série de desafios. Em primeiro lugar, a eficiência, pureza e qualidade da reprogramação nem sempre são tão altas quanto o esperado. O indução MGT só pode atingir 8,4% (cTnT+) ou 24,7% (αMHC-GFP+) do total de CFs a serem reprogramados para iCMs in vitro7, ou até 35% in vivo8, o que limita sua aplicação. Mesmo com mais fatores induzidos no sistema, como Hand29 ou Akt1/PKB10, a eficiência de reprogramação ainda é pouco satisfatória para ser usada em um ambiente clínico. Assim, mais estudos focados na melhoria da eficiência de reprogramação são necessários neste campo. Em segundo lugar, as características de integridade elétrica e contração dos ICMs são importantes para a melhoria eficiente da função cardíaca, mas estas são desafiadoras de avaliar. Atualmente, métodos de avaliação amplamente utilizados no campo, incluindo citometria de fluxo, imunocitoquímica e qPCR de algumas expressões fundamentais de genes de CMs, estão todos focados na similaridade de iCMs e CMs, mas não diretamente relacionados com as características funcionais dos ICMs. Além disso, esses métodos têm procedimentos relativamente complicados e são demorados. Enquanto os estudos de reprogramação geralmente envolvem uma triagem de potenciais fatores de reprogramação que promove a maturação do ICMs11, a reprogramação cardíaca exige um método rápido e conveniente baseado na função iCMs.

Os CMs abrem os canais de íons de cálcio fechados de tensão no citomembano durante cada ciclo de contração, o que leva a um fluxo transitório de íon de cálcio (Ca2+) do fluido intercelular ao citoplasma para participar da contração do miofilamento. Tal fluxo ca2+ e ciclo outflux é o traço fundamental da contração do miocárdio e constitui a função normal dos CMs12. Assim, um método que detecta o fluxo de Ca2+ pode ser uma maneira potencial de medir a função de CMs e células semelhantes a CM, incluindo iCMs. Além disso, para os ICMs, tal método fornece outra forma de avaliar a eficiência da reprogramação.

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para indicar atividades celulares, especialmente potenciais de ação. Geralmente, os GECIs consistem em um domínio de ligação Ca2+ , como calmodulin, e um domínio fluorescente como o GFP, e o GCaMP3 é um com alta afinidade e intensidade de fluorescência. O domínio de fluorescência do GCaMP3 será ativado quando a concentração local de cálcio for alterada13. Neste artigo, uma cepa de rato que expressa especificamente um repórter GCaMP3 em células Myh6+ é descrita. Ao introduzir o MGT nos NCFs isolados dos recém-nascidos desta cepa, a reprogramação pode ser monitorada por fluorescência, que irá exibir com sucesso iCMs reprogramados. Tal cepa e método do rato fornecerá uma plataforma valiosa para investigar a reprogramação cardíaca.

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Protocolo

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Todos os procedimentos e práticas experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Todos os procedimentos experimentais e práticas envolvendo a cultura celular devem ser realizados no Gabinete de Segurança Biológica BSL2 em condições estéreis. Para os procedimentos e práticas envolvendo vírus, seguiu-se a diretriz do descarte adequado de células transfeinadas, pontas de pipeta e tubos para evitar o risco de riscos ambientais e à saúde.

1. Estabelecimento de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (referido como Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) cepa de rato (Figura 1)

  1. Prepare a estirpe do rato Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (009074 de estoque de laboratório jackson, referido como Myh6-Cre) e Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Cepa de rato Hze/J (014538 de estoque de laboratório jackson, referido como Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectivamente.
  2. Crie cada cepa até 8 semanas de idade para obter camundongos Myh6-Cre adultos e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivamente.
  3. Crossbreed o adulto Myh6-Cre e os ratos Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
    NOTA: Configure Myh6-Cre masculino/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 feminino ou vice-versa. Não há diferença significativa entre seus descendentes. Normalmente, os camundongos fêmeas darão à luz 8-10 filhotes 19-21 dias após a cruzamento.

2. Isolamento e seleção de corações de camundongos myh6-cre/rosa26A-flox-stop-flox-GCaMP3 neonatantes.

  1. Obtenha filhotes P0-P2. Certifique-se de que 8-10 filhotes estão presentes para isolar 10 milhões de NCFs com este protocolo.
  2. Anestesiaram profundamente os filhotes por hipotermia. Coloque os filhotes em uma luva de látex e mergulhe até o pescoço em gelo e água esmagados (2°C - 3°C).
  3. Higienize brevemente os filhotes com 75% de etanol.
  4. Sacrifique os filhotes por decapitação com tesouras estéreis.
  5. Faça uma incisão horizontal perto do coração, aperte o coração e, em seguida, isole-o separando-o na raiz da aorta com uma tesoura.
  6. Observe o coração batendo sob um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que os corações com genótipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mostre fluxo Ca2+ indicado por GCaMP3 com batimentos cardíacos. Os outros genótipos não mostram fluorescência (Figura 2, Vídeo 1 e Vídeo 2).

3. Isolamento de fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs)

NOTA: Por esta parte, o protocolo do Laboratório14 do Dr. Li Qian foi adotado com pequenas otimizações quando aplicável a este estudo.

  1. Após o isolamento dos corações αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, corte-os em quatro pedaços que estão vagamente conectados. Lave-os em DPBS gelados em uma placa de 6 cm completamente várias vezes para limitar a poluição das células sanguíneas nas células isoladas.
  2. Transfira os corações para um tubo cônico de 15 mL.
  3. Digerir os corações com 8 mL de aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA a 37 °C por 10 min.
  4. Descarte o supernatante de trippsina e adicione 5 mL de colagenase tipo II quente (0,5 mg/mL) em HBSS.
  5. Vortex a mistura completamente, e incubar a 37 °C por 5 min.
  6. Após a incubação, o vórtice completamente e deixe o tecido não digerido se acalmar pela gravidade.
  7. Colete o supernatante em um tubo cônico de 15 mL com fibroblasto frio de 5 mL (FB) médio (IMDM com 20% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina).
  8. Repita as etapas 3.4-3.7 para o tecido não digerido 4-5 vezes.
  9. Colete todos os supernaspentes juntos e filtre o supernante com um coador de 40 μm.
  10. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
  11. Resuspengem as células em 10 mL de tampão de classificação celular ativado por magnético (tampão MACS; 1x PBS com 2 mM EDTA e 0,5% BSA).
  12. Determine o número de celular viável por coloração azul trypan.
    1. Retire 10 μL de células a partir de 10 mL de suspensão celular na etapa 3.11.
    2. Misture com 10 μL de solução azul trypan de 0,4% e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    3. Adicione a mistura a um hemócito e determine o número viável da célula. As células mortas estão manchadas de azul, enquanto as células viáveis estão sem manutenção.
  13. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min a 4 °C e descartar o sobrenante.
  14. Resuspend as células com 10 μL de microesferas Thy1.2 em 90 μL de tampão MACS refrigerado para menos de 10 milhões de células viáveis. Adicione mais contas proporcionalmente se houver mais de 10 milhões de células viáveis. Pipeta bem a mistura e incuba a 4 °C por 30-60 min.
  15. Adicione 10 mL de tampão MACS e misture bem.
  16. Centrifugar a 200 x g por 5 min, descarte o supernaspe.
  17. Repita as etapas 3.15-3.16 uma vez.
  18. Resuspense as células e contas com 2 mL de tampão MACS.
  19. Configure um separador MACS no capô. Insira uma coluna LS no separador e equilibre a coluna com 3 mL de tampão MACS.
  20. Quando a coluna LS estiver equilibrada, passe as células através da coluna.
  21. Lave a coluna LS com 2 mL de tampão MACS três vezes.
  22. Tire a coluna do separador, elute-a com 2 mL de tampão MACS três vezes e, em seguida, colete a elução a um tubo de 50 mL.
  23. Centrifugar a 200 x g por 5 min e descartar o supernatante.
  24. Resuspend as células com 5 mL de mídia FB.
  25. Determine o número da célula com um hemócito.
  26. Diluir as células com mídia FB e semear as células em pratos ou pratos conforme desejado. Certifique-se de que a densidade de semeadura celular é em torno de 2-2,5 x 104 células/cm2 (otimizar a densidade com base em experimentos individuais). Certifique-se de que os fibroblastos conectados tenham uma forma oval a redonda no segundo dia após a semeadura (Figura 3).

4. Produção de retrovírus codificando vetor MGT policstrônico para reprogramação cardíaca

  1. Mantenha Plat-E com mídia de cultura Plat-E (DMEM suplementada com 10% FBS, 1 μg/mL de puromicina e 10 μg/mL de blasticidina) a 37 °C com 5% de CO2.
  2. No primeiro dia, divida o Plat-E para uma placa de 6 poços a aproximadamente 4-5 x 105 células/densidade do poço.
  3. No dia 2, o Plat-E normalmente atinge 80% de confluência. Transfetá as células com os seguintes procedimentos. Ajuste o volume e a quantidade de cada elemento aqui presente com base em cada poço em uma placa de 6 poços.
    1. Diluir 2 μg de pMX-puro-MGT de expressão retrovírus policistrônico vetor plasmídeo (Addgene 111809) a 500 ng/μL com tampão TE.
    2. Prepare a mistura de transfecção misturando 10 μL de Lipofectamina com 150 μL de meio soro reduzido. Pipeta cuidadosamente para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Tenha cuidado para evitar bolhas ao pipetar.
    3. Enquanto isso, prepare uma mistura de plasmídeo misturando o plasmídeo com 150 μL de meio soro reduzido. Pipeta cuidadosamente para misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Tenha cuidado para evitar bolhas ao pipetar.
    4. Misture cuidadosamente as duas misturas e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. A solução pode parecer nebulosa.
    5. Adicione a mistura gota a gota às células para ser transfeinada.
    6. Incubar as células a 37 °C durante a noite.
  4. No dia 3, mude o meio para um meio de cultura celular completo fresco sem puramicina e blasticidina.
  5. No dia 4, 48h após a transfecção, recolhe o supernatante que contém retrovírus e armazena-o em 4 °C.
  6. No dia 5, 72 h após a transfecção, recolha o supernatante que contém retrovírus.
  7. Filtre tanto a supernasce de 48 h quanto 72 h com um filtro de 0,45 μm, precipitar durante a noite a 4 °C adicionando 1/5 volume de 40% de solução poly (etileno glicol) (PEG) para fazer uma concentração final de 8% de PEG.
  8. Centrifugar a 4.000 x g por 30 minutos para precipitar o vírus.
    NOTA: O vírus PEG8000 forma uma pequena precipitação branca.
  9. Resuspenja o vírus com o meio de ICMS contendo 8 μg/mL de polibrene conforme desejado. Use o retrovírus imediatamente.

5. Reprogramação de NCFs para iCMs com infecção por retrovírus de codificação MGT

  1. Crescer ou passar NCFs antes da infecção pelo vírus.
    NOTA: Normalmente, o NCF pode ser passagem duas vezes.
  2. No dia 0, sementes NCF para a densidade em torno de 1-2 x 104 células/cm2 em meio FB.
  3. No primeiro dia, substitua o meio de cultura por um meio contendo vírus para cada um bem como desejado. Use o vírus de um poço Plat-E em uma placa de 6 poços para infectar dois poços em uma placa de 24 poços. Titer o vírus para determinar a concentração ideal do vírus.
    NOTA: Vírus contendo outros fatores de reprogramação de interesse podem ser introduzidos juntamente com o retrovírus MGT.
  4. Incubar a 37 °C durante a noite.
  5. No dia 2, 24 h após a infecção pelo vírus, substitua o meio contendo vírus para um meio regular de ICMS.
  6. Para monitorar a expressão GCaMP3, emplaque-a sob um microscópio de fluorescência invertida. Sob 10x no canal GFP, observe a leve fluorescência basal GCaMP3 de uma porção de células já no dia 5.
  7. Substitua o meio a cada 2-3 dias durante a reprogramação. Se necessário, realize uma seleção positiva para células infectadas por retrovírus MGT adicionando 2 μg/mL de puramicina ao meio de cultura por 3 dias e mantendo-a a 1 μg/mL.
    NOTA: Introduzir produtos químicos de interesse (por exemplo, IGF-1, MM589, A83-01 e PTC-209, referido como IMAP como noticiamos anteriormente15) juntamente com a alteração média.
  8. Após 14 dias de infecção, substitua o meio por meio B27 para induzir ainda mais a maturação do ICMS.

6. Avaliação da maturação funcional do ICMS e eficiência de reprogramação pelo fluxo Ca2+

NOTA: Adicione isoproterenol de 1 μM às células a serem avaliadas antes da avaliação, se necessário.

  1. Avalie o fluxo ca2+ com um microscópio de fluorescência invertida à temperatura ambiente.
  2. No canal GFP, observe as células GCaMP3+ abaixo do objetivo de 10x. Certifique-se de que ele mostra uma célula espontânea batendo no canal de campo brilhante.
  3. Selecione aleatoriamente três campos abaixo de 20x e regise o fluxo ca2+ dos iCMs por 3 minutos para cada campo.
    NOTA: Aqui, o fluxo Ca2+ foi sincronizado com a batida celular espontânea (Figura 4, Figura 5 e Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5, Vídeo 6, Vídeo 7, Vídeo 8).
  4. Quantifique manualmente as células com fluxo Ca2 +.

7. Análise estatística e apresentação de dados

  1. Analise as diferenças entre os grupos de análise unidirecional de variância (ANOVA) e realize os testes de comparação múltipla Student-Newman-Keuls.
    NOTA: Os resultados são tão médios ± S.E com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Cada experimento foi realizado pelo menos três vezes.

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Resultados

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O fluxo de trabalho experimental para gerar a cepa de camundongos Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e a estrutura genética dos camundongos transgênicos é mostrado na Figura 1. Enquanto a cepa do camundongo é estabelecida, os corações dos filhotes foram isolados e observados sob um microscópio de fluorescência reversa para confirmar o genótipo. Corações com genótipo correto mostram fluxo Ca2+ sincronizado com batida, visualizado como fluorescência GCaMP3, enquanto nenhuma fluo...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avaliar a função iCMs é necessário para o campo de reprogramação cardíaca. Neste manuscrito, o protocolo descreve uma cepa de camundongos Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J linhagem de camundongos que foi estabelecida, como usar os NCFs isolados dos camundongos neonatais nesta cepa para a reprogramação para iCMs, e a avaliação da função iCMs por ca2+ flux. Trata-se de um método de novo para avaliar o amadurecimento funcional dos ICMs.

Várias e...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos os esforços de Leo Gnatovskiy na edição do texto em inglês deste manuscrito. A Figura 1 foi criada com BioRender.com. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) dos Estados Unidos (1R01HL109054) para o Dr. Wang.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de Centrífuga Cônicos de 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Tubos de Centrífuga Cônicos de 50mLThermo Fisher Scientific14-959-49A
Placas de Cultura de Células de 6 PoçosAlkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04– 0014
Microscópio de fluorescência tudo-em-umKeyenceBZ-X800EMicroscópio de fluorescência invertida
B-27 Suplemento (50X), sem soroThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidina S HCl (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificA1113903
Albumina de soro bovino (BSA) Pó livre de DNase e proteaseThermo Fisher Scientific
CD90.2 MicroBeads, camundongoMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 microesferas
Colagenase, Tipo 2Thermo Fisher Scientificde Contagem de NC9693955
Thermo Fisher Scientific02-671-51BHemocitômetro
DMEM, glicose alta, sem glutaminaThermo Fisher Scientific11960069
DPBS, cálcio, magnésioThermo Fisher Scientific14-040-133
Etanol, 200 prova (100%)Thermo Fisher Scientific04-355-451
Ácido Etilenodiamina Tetracético (Certificado ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
Soro Fetal BovinoCorning35-010-CV
HBSS, cálcio, magnésio, sem vermelho de fenolThermo Fisher Mídia Científica14025092
IMDMThermo Fisher Microscópio
IX73Fluorescência InvertidaOlympusIX73P2F
Reagente de Transfectamina 2000 Reagente de TransfecçãoThermo Fisher Scientific11-668-019
Colunas LSMiltenyi Biotec130-042-401
Médio 199, Sais Earle's ThermoFisher Scientific11150059
Kits de Partida e Separador MidiMACS MiltenyiBiotec130-042-302
Unidade de Filtro de Seringa Millex-HV, 0.45  µ m, PVDF, 33  mm, esterilizado por gamaMillipore SigmaSLHV033RB
MM589Obtido do Dr. Shaomeng Wang' s laboratório na Universidade de Michigan
Opti-MEM I Soro Reduzido MeioThermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Embalagem Retroviral Linha CelularCélula  BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
Poli(etilenoglicol)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Reagente de Infecção/Transfecção PolybreneMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143– 5MG
Dicloridrato de PuromicinaThermo Fisher ScientificA1113803
Humano Recombinante IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 MédioThermo Fisher Scientific11875093
ST 16 Série CentrífugaThermo Fisher Scientific75-004-381
Filtros de Células EstéreisThermo Fisher Scientific22-363-54740 µ m filtro
Placas de cultura de tecidos tratadas com superfícieThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
solução de azul de tripanoMillipore SigmaT8154
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenolThermo Fisher Scientific25300054
Misturador de vórticeThermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific
BP9706100 Câmara Invertido 12440053 Microscópio de 02215365

Referências

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