Summary
这种简化的实验方案详细介绍了检测和成像复杂组织样品中细菌的工作流程,从固定组织到用荧光 原位 杂交染色微生物。
Abstract
测量微生物在其 体内 环境中的定位是揭示微生物群与脊椎动物肠道之间功能关系的重要一步。肠道微生物群的空间景观受到物理特征(肠粘液、隐窝和褶皱)的严格控制,并受到宿主控制的特性(如pH值、氧气可用性和免疫因子)的影响。这些特性限制了共生微生物和病原体稳定定植肠道的能力。在微米尺度上,微生物组织决定了不同微生物之间的近距离相互作用以及微生物与其宿主之间的相互作用。然后,这些相互作用会影响大规模的器官功能和宿主健康。
该协议能够可视化从细胞之间的距离到器官范围的肠道微生物群空间组织。该方法基于固定肠道组织,同时保持肠道结构和粘液特性。然后将固定样品包埋,切片和染色,以通过荧光 原位 杂交(FISH)突出特定的细菌物种。宿主特征,如粘液和宿主细胞成分,用荧光标记的凝集素标记。最后,使用共聚焦显微镜对染色切片进行成像,利用高放大倍率的瓷砖扫描成像,将微米级与厘米长的尺度连接起来。这种类型的成像可以应用于动物模型的肠道切片和人体组织的活检,以确定健康和疾病中肠道微生物群的生物地理学。
Introduction
微生物可视化技术的起源与微生物学本身一样古老,当时安东尼·范·列文虎克(Antonie Van Leeuwenhoek)在17世纪 使用他的显微镜观察牙菌斑和粪便中的细菌(他称之为"动物")。从那时起,已经开发了许多技术来可视化与宿主相关的细菌,真菌和病毒联盟的空间组织 - 微生物群1。阐明这些微生物的定位对于确定它们在动物宿主体内的功能至关重要。细菌的生物地理学在共生和致病类群中都很重要,因为靠近特定位置(例如,上皮)、营养底物和特定微生物可能决定细菌产生潜在的种间和王国间相互作用的代谢物。
将细菌和宿主组织分离在几个不同的身体部位(如口腔,肠道或肺)中的关键结构是粘液 - 宿主产生的层,既可以防止微生物转移到宿主上皮细胞上,又可以作为微生物群的营养资源2,3,4.表征该屏障的破坏和变化至关重要,可以对宿主 - 微生物群相互作用进行机械学洞察,而仅通过测序无法获得5,6,7。例如,影像学检查发现抗生素暴露可以破坏粘液层和微生物群组织7,8,泻药可能会耗尽粘液,这与免疫参数的大幅变化相关5。
该协议概述了基于Johansson和Hansson9的工作构建的固定,染色和成像微生物群和宿主组织的一般框架(图1)。虽然该协议是在肠道切片的背景下建模的,但它可以很容易地适应其他组织类型。该协议能够处理实验动物或人类临床样本;包括处理这两种样品的注释。在此给出的示例中,宿主上皮和腔内细菌已同时用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚染色(DAPI)标记,粘液与荧光素(FITC)结合凝集素,Ulex europaeus凝集素I(UEA-1)和使用FISH的特定细菌分类群标记。FISH探针通常针对分类群的16S rRNA基因进行设计,以确保通过结合高拷贝转录本获得高信号。
在本例中,探针靶向Muribaculaceae细菌家族的16S rRNA(图2)。然而,染色剂很容易被不同的FISH探针和/或凝集素取代,以适应适当的生物学问题。先前验证的FISH探针可以在ProbeBase10上找到,ProbeBase10是rRNA靶向寡核苷酸探针的在线资源,也可以在RIVA11上找到,SILVA11是核糖体RNA数据库。对于新探针的设计,读者可以参考新的管道,如HiPR-FISH8或Oligominer12。使用该协议,可以观察肠道内细菌的紧密包装以及整个消化道中肠粘液的不同特征。这里描述的工作流程可以在其宿主环境的空间环境中对微生物群进行定量分析。
Protocol
本议定书中描述的所有动物实验和组织收集均按照加拿大动物护理委员会(CCAC)指南进行,并得到不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准。使用无菌瑞士韦伯斯特小鼠。所有动物的年龄均为8-10周,使用两性,所有小鼠与每个笼子至少两只小鼠共同饲养。使用二氧化碳对动物实施安乐死,伴有继发性颈椎脱位或心脏穿刺。
1. 设计成像实验:注意事项和样品收集
- 鱼探针设计
- 如果存在适当的 FISH 探针,请选择预先存在的已发布探针,该探针在标记的细胞中显示与背景相比的强信号。
- 在体外验证新探针,以确定它们与目标细菌的固定样品结合和与其他细菌的脱靶结合的效率。
- 检查所有16S FISH探针,以对抗来自靶生物体的16S序列或来自待分析样品的16S rRNA测序,以确保存在阳性匹配的预期比例,并且探针不会非特异性地与其他微生物群成员结合。
- 使用工具(如Clustal Omega13)将FISH探针与全长序列或扩增子序列变体对齐,以评估探针及其靶标的潜在结合。
- 除计算机模拟测试 外 ,还要测试纯培养物上未经验证的探针的 FISH 染色的准确性和水平8,14。
注意:当对多个群落成员进行染色时,如果所使用的荧光团在激发和发射光谱上不重叠(除非在具有线性解混能力的系统上进行成像),则可以组合使用探针(例如,家族特异性探针和属特异性探针的组合)。此外,特异性可以通过包括特异性对照/加扰探针或通过与非荧光探针竞争来证明。
- 样品类型和组织收集
- 使用锋利干净的工具,从裸鳃瑞士韦伯斯特小鼠身上切下肠段进行成像。尽可能减少对样品的干扰,并通过边缘处理切片以避免影响成像区域。解剖后尽快固定样品,以防止降解。
注意:对于动物研究,最好使用完整,未冲洗的肠切片;膜将有助于保持腔内和粘膜组织的完整。 - 通过在样品和位点之间用70%乙醇擦拭来清洁工具。每个肠切口/活检位置至少获得三个生物学重复,注意对一致的肠道位置进行采样,因为粘液和肠道结构以及微生物群在不同位置发生显着变化。
- 使用锋利干净的工具,从裸鳃瑞士韦伯斯特小鼠身上切下肠段进行成像。尽可能减少对样品的干扰,并通过边缘处理切片以避免影响成像区域。解剖后尽快固定样品,以防止降解。
2. 组织样品固定和浸润
- 固定
- 在兼容的容器中以以下比例制备新鲜的甲基苯甲胺:60%无水甲醇,30%氯仿和10%冰醋酸。在通风橱中分配这些化学品中的每一种。选择可以通过打开盖子来通风的容器。由于甲基苯乙烯与聚苯乙烯不相容,因此在聚乙烯容器中制备,使用玻璃量筒/血清移液管用于氯仿和冰醋酸。
注意:在混合过程中,会产生烟雾,并可能导致压力在容器内积聚。如果样品未被主动添加,建议在从通风橱中取出后保持容器相对紧密的封闭。氯仿有毒;不要吸入、吞咽或通过皮肤吸收。甲醇有毒,高度易燃;不要吸入、吞咽或通过皮肤吸收。冰醋酸易燃,对皮肤和眼睛具有高度腐蚀性。 - 分配后,关闭容器,旋转混合,然后排气;重复此操作,直到排气停止(盖子下的压力不再明显积聚)。
注意:不要在排水管中处理甲基苯甲酸;根据机构准则收集和处置危险化学废物。使用铅笔标记组织学盒,因为许多笔墨会在甲基卡芬溶液中脱落。 - 将肠部分放入组织学盒中,用镊子小心地保持组织的边缘。关闭盒,将其完全浸没在新鲜的甲基吡啶溶液中。确保溶液在浸入盒式磁带后不超过几个小时。
- 对于将在没有通风橱的临床套件中收集的临床样本,请使用聚乙烯储存容器,盖子上有一个盖子,允许组织学盒通过。在不通过样品时用胶带将此翻盖关闭,以防止有毒烟雾逸出。
注意:重要的是要使用遮蔽胶带以避免胶水溶解到容器上 - 某些类型的胶带(例如,塑料包装胶带)可能无法很好地承受甲基苯丙胺烟雾。 - 固定样品至少3小时,最多两周。
注意:较厚的样品可能需要超过3小时的固定时间。可以选择固定时间,以便能够同时对固定在不同甲基苯甲酸溶液中的暗盒进行石蜡浸润处理(例如,同时对收集并在两周内固定的样品组进行石蜡浸润)。
- 在兼容的容器中以以下比例制备新鲜的甲基苯甲胺:60%无水甲醇,30%氯仿和10%冰醋酸。在通风橱中分配这些化学品中的每一种。选择可以通过打开盖子来通风的容器。由于甲基苯乙烯与聚苯乙烯不相容,因此在聚乙烯容器中制备,使用玻璃量筒/血清移液管用于氯仿和冰醋酸。
- 石蜡浸润和嵌入
- 将石蜡放入耐热容器中,并在60°C的烤箱中融化过夜。由于石蜡颗粒在熔化前占用更多空间,因此请确保有足够的石蜡熔化以覆盖所有盒。
注意:温度不应高于60°C,因为它会产生伪影。 - 通过倒出适当的废物容器中的液体并立即用以下化学品代替来清洗组织。
- 在无水甲醇中孵育30分钟,重复一次。
- 在无水乙醇中孵育20分钟,重复一次。
- 在二甲苯中孵育15分钟,重复一次。
- 快速更换洗涤液,注意避免让暗盒变干。确保每次洗涤都完全覆盖烧杯或容器中的盒式磁带。
注意:二甲苯是易燃的,如果吸入,蒸气可能会抑制中枢神经系统,暴露于高浓度(>200 ppm)时可能产生长期的神经系统后果。只能在通风橱内处理二甲苯。由于二甲苯是有害的,因此请注意使用覆盖组织学盒所需的最小量。
- 在包埋过程中,使用镊子将肠段定向平行于盒的长度(而不是直立),以提供纵向的横向截面而不是横截面的圆环,为定量成像提供更多潜在的样品区域(图1B)。
- 稍微打开盒(约1-2厘米或0.5英寸),以使石蜡进入而不会丢失组织片段。在此步骤中使用双手套或镊子,以防止手指过热或轻度灼伤。浸没并关闭熔化石蜡容器中的盒,将容器放回60°C烘箱中。确保盒中装满石蜡,并且没有留下大气泡。
- 在60°C下孵育2小时后,从烤箱中取出容器。使用镊子,小心地取下盒,将它们单独放在一块铝箔上冷却。将它们储存在室温下,直到准备好嵌入和切片。
- 用切片机切割石蜡块,切入足够深的块中,使腔内内容物暴露,除了腔内内容物和粘液外,还可以纵向切片绒毛和/或隐窝。小心更换刀片,因为与组织相比,粪便材料会使刀片迅速变钝。将切片切割成4μm的厚度,以获得最佳的图像清晰度。将截面转移到常规的无涂层幻灯片上。
- 对于FISH染色,尽快染色肠道切片(即,在切片后的几周内),以获得强烈的FISH信号。如果省略FISH染色,凝集素+DAPI染色可以在新鲜度较低(即几个月龄)的样品上进行,而不会造成明显的信号损失。
- 将石蜡放入耐热容器中,并在60°C的烤箱中融化过夜。由于石蜡颗粒在熔化前占用更多空间,因此请确保有足够的石蜡熔化以覆盖所有盒。
3. 染色细菌和宿主特性
- 制备
- 将烤箱加热至60°C。 用玻璃瓶中的二甲苯预热空Coplin罐和足够的体积以两次覆盖罐中的载玻片,注意盖子周围的parafilm以防止二甲苯蒸发。让二甲苯的温度达到60°C。
注意:标准Coplin罐可容纳8张载玻片,载玻片可以覆盖大约50毫升液体(可能因品牌而异,在40至60毫升之间变化)。二甲苯替代品毒性较小,已被其他团体成功用于脱蜡步骤(步骤3.2)8,9。 - 如果有单独的烘箱,请将杂交烘箱预热至50°C。 否则,在步骤3.2.3之后,可以使用用于烘烤载玻片的相同烤箱执行此步骤。
- 制备FISH杂交溶液:20 mM Tris-HCl,pH 7.4;0.9 M 氯化钠;0.01%26 - 0.1%9 (w / v)十二烷基硫酸钠(SDS)在无核酸酶水中。如果需要,添加5-50%(v / v)甲酰胺。在脱石蜡过程中,在50°C下预热该杂交溶液。
注意:甲酰胺是一种作为致畸剂的酰胺;用手套和护目镜处理甲酰胺。在小剂量和暴露于眼睛,皮肤或粘膜时,它是刺激性的。大量甲酰胺蒸气可能需要医疗干预。甲酰胺可以100%储存在-20°C的冰箱中。
- 将烤箱加热至60°C。 用玻璃瓶中的二甲苯预热空Coplin罐和足够的体积以两次覆盖罐中的载玻片,注意盖子周围的parafilm以防止二甲苯蒸发。让二甲苯的温度达到60°C。
- 准备用于染色的载玻片:去蜡化
- 将载玻片放入Coplin罐中,确保切片不与其他载玻片或罐子接触,并在60°C下烘烤载玻片10分钟。
- 在通风橱中,用烤箱中预热的二甲苯填充Coplin罐,注意不要直接倒在样品上并可能移走组织。将Coplin罐放回60°C烘箱中。将剩余的二甲苯留在通风橱中。
- 将用过的二甲苯倒入适当的废物容器中进行处理,注意不要干扰载玻片上的组织部分,并使用一对镊子防止载玻片从Coplin罐中掉落。用剩余的二甲苯补充Coplin罐,并在通风橱中室温下孵育10分钟。
- 在室温下将切片在99.5%乙醇中孵育5分钟。在此孵育步骤之后,从Coplin罐中取出载玻片,用实验室湿巾或纸巾擦拭载玻片的背面,然后短暂风干,直到乙醇液滴消失。
注:擦拭载玻片背面可以更好地显示干燥过程。
- 用鱼染色细菌
- 使用液体阻滞剂或PAP笔,通过环绕每个组织切片的区域来限制液体膨胀的区域。确保墨水不会与该部分本身接触。在不接触组织的情况下,在尽可能靠近每个组织切片的地方创建一个圆圈,以最大限度地减少杂交溶液需要覆盖的表面积。
- 准备杂交溶液:对于每50μL预热的杂交溶液,加入0.5μg探针(例如,0.5μL1μg/ μL探针)。将杂交溶液移液到载玻片上的切片上(约20μL/切片,取决于切片/圆的大小)。在孵育步骤和储存期间,从这一点开始保护杂交溶液和载玻片免受光线照射。
- 确保用柔性塑料盖玻片覆盖时所用液体的体积覆盖整个截面。将载玻片在潮湿的腔室中孵育以减少蒸发。创建一个潮湿的房间,底部有移液器吸头盒,底部有湿巾或纸巾,这些湿巾或纸巾已经用过量的杂交溶液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)浸泡以提供湿度。根据探针组的不同,在45-50°C下孵育切片>3小时。
- 预热FISH洗涤缓冲液:20 mM Tris-HCl,pH 7.4;在孵育期间0.9M NaCl至50°C。准备足够的洗涤缓冲液以覆盖Coplin罐中的载玻片。
- 取下塑料盖玻片;将载玻片在COPLIN罐中的FISH洗涤缓冲液中孵育,两者都预热至50°C。 将Coplin罐放回50°C烘箱10-20分钟。对于厚样品,通过添加缓冲液并轻轻移开盖玻片来去除Coplin罐中的盖玻片,以避免涂抹盖玻片。
- 染色粘液和宿主特征
- 在PBS中准备一般的DNA/粘液复染:最终10μg/ mL DAPI + 40μg/ mL粘液染色UEA-1。准备足够的复染剂,以便在没有盖玻片的情况下覆盖斑点,以避免用额外的盖玻片损坏组织。
注意:在没有盖玻片的情况下覆盖斑点将需要比3.3.2中使用的20μL更大的体积。对于平均尺寸的切片(直径约10毫米),200μL足以覆盖一个点;事先在虚拟幻灯片上测试此卷。 - 取出FISH洗涤缓冲液,并将其替换为Coplin罐中的PBS。在用PBS重新填充Coplin罐后,立即醒酒PBS。
- 从罐子中取出载玻片,在部分顶部移液复染,同时确保不要用移液器吸头接触组织。用气泡覆盖整个部分。在黑暗中在4°C孵育45分钟。
- 用新鲜的PBS快速清洗污渍3次:使用镊子将载玻片固定到位时,将PBS倒入水槽中,然后立即用新鲜的PBS重新填充。
- 用湿巾或纸巾擦拭载玻片的背面,让大部分PBS从部分蒸发掉,并由连接到移液器吸头的真空管路辅助。再次,避免用移液器吸头触摸该部分。
- 使用安装介质(不含DAPI)安装部分,并将其设置为室温,由玻璃盖玻片覆盖,确保盖玻片是平坦的,并且安装介质中没有气泡。
- 用透明的指甲油沿着盖玻片的边缘涂漆,将盖玻片贴在载玻片上,注意远离载玻片的边缘,以确保载玻片在成像过程中与显微镜载玻片支架齐平。
- 在荧光耗尽之前,将载玻片在4°C的黑暗中储存几周。
- 在PBS中准备一般的DNA/粘液复染:最终10μg/ mL DAPI + 40μg/ mL粘液染色UEA-1。准备足够的复染剂,以便在没有盖玻片的情况下覆盖斑点,以避免用额外的盖玻片损坏组织。
4. 成像和图像分析
- 污渍可视化
- 选择同时包含组织和管腔的组织区域,以对微生物群-宿主界面进行成像。对于粘液厚度和腔内生物地理学的定量成像,请选择上皮绒毛和/或隐窝切片为纵向而不是横截面的视野。避免在粘液和上皮之间有较大间隙的区域,以避免切片伪影。
- 定位组织并校正焦平面,利用DAPI信号进行定位和聚焦,以避免FISH荧光信号的光漂白。
- 调整成像设置。为了可视化细菌DAPI染色,增加激光功率并获得来自上皮细胞的DAPI信号过饱和或"吹出"的程度。
注意:不要过度饱和,因为这会导致细胞核中出现无法恢复的光漂白和视觉伪影。 - 对于所有其他通道,请使用最小的激光功率,该功率将在背景上方提供清晰的信号,并注意不要过度饱和。
注意:这在执行切片扫描时尤其重要,因为当对切片之间的重叠进行成像时,光漂白会成为问题。 - 使用40倍或更高的放大倍率对单个细菌进行成像。
- 获取图像。
- 获取瓷砖扫描,以获得有关内腔内粘液厚度和微生物空间分布的定量数据。确保磁贴之间有 15% 的重叠,并检查是否出现晕影/不均匀的照明,<1 倍变焦可能会加剧这种影响。设置切片扫描时,请密切注意所有切片中的组织是否对焦,因为无法分析模糊/失焦的图像(图3B)。
- 如果可能,通过旋转扫描区域,使上皮和粘液层平行于瓷砖而不是成一定角度,最大限度地减少对给定长度的上皮进行成像所需的瓷砖数量。否则,找到平行或垂直于成像区域的上皮部分以达到类似的效果。
Representative Results
为了研究小鼠肠道中特定肠道共生细菌的定位,本研究使用了用单个细菌分离物定植的无菌瑞士韦伯斯特小鼠。对于该实验,标记的细菌物种是i)Muribaculaceae家族5的人类分离物,Muribaculum肠,小鼠微生物群中丰富而普遍的细菌家族15,以及ii)拟杆菌thetaiotaomicron,一种遗传上可处理的常见肠道细菌。经过两周的平衡,小鼠被安乐死,并且含有粪便沉淀的结肠片段被切除并固定在新鲜制备的甲基苯酚中。经过两天的固定,通过甲醇,乙醇和二甲苯处理切片脱水,用石蜡浸润,包埋,然后切片至腔内4μm切片。然后用FISH探针(3'Cy3标记)染色这些样品,该探针(3'Cy3标记)特定于Muribaculum分离物,使用寡头免疫软件12设计,并使用NuPACK和mathFISH16,17检查二级和三级结构以及最小的非特异性结合。样品亦获复染罗丹明结合凝集素UEA-1(可染去粘液中的岩藻糖基化聚糖)及DAPI。使用40倍油物镜和超分辨率模块对染色切片进行成像。
图 1:肠道中微生物群-宿主界面的可视化工作流程 。(A) 管道的图示工作流程。(B)两个截面将产生横向截面(此管道首选)或横截面"甜甜圈"。(C)嵌入厚度非常不同的组织可能导致切片仅对一种或另一种组织最理想。缩写:FISH =荧光 原位 杂交;DAPI = 4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:结肠成像显示了在生殖细胞小鼠模型中相对于粘液的 Muribaculum肠 的定位。 切片用DAPI(蓝色), Muribaculaceae FISH探针(红色)和UEA-1(绿色)染色。(A)小鼠远端结肠单定植 与肠 杆菌和(B)小鼠远端结肠双定植 于肠杆菌肠 和 拟杆菌。比例尺 = 20 μm.(C 和 D)Cy3-FISH(左)、DAPI(中)和组合 Cy3-FISH + DAPI 通道,分别用于 (A) 和 (B) 的腔内插入部分。比例尺 = 5 μm。在(A)和(C)中,所有细菌形状和细菌大小的DAPI信号都标有Cy3(单箭头),而在(B)和(D)中,除了这些Cy3和DAPI双阳性细胞(单箭头)之外,还有DAPI染色的细菌细胞是Cy3阴性(双箭头),正如单定植和双定植状态所预期的那样。除较长的丝状细菌外,较大的(长度为>4μm)DAPI阳性结构(钝箭头)是来自宿主细胞的植物材料或细胞核。缩写:FISH =荧光 原位 杂交;DAPI = 4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:常见问题。 (A)浅切片不会提供肠道的腔内切片。(左)在深度切片的肠段,可提供管腔视图以及上皮的纵向视图。(右)切得太浅的肠段,仅显示隐窝的横截面,没有恒定的粘液层或细菌。(B) 组织/盖玻片覆盖不均匀可能导致模糊和不均匀的照明瓷砖扫描。设置了拼贴扫描,其位置失焦(右上角)。(C) 普通背景(左)和高背景(右)的示例。在这个例子中,对于DAPI信号-音符,信号来自细胞核外的上皮细胞。所有比例尺 = 20 μm。缩写:DAPI = 4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
上述方案提供了一种可重复的方法来可视化宿主 - 微生物群界面。这些检测方法从方案开发中受益匪浅,从 FISH 标记优化18 到粘液保存和成像9。固定和包埋也提供了有用的样品储存;此外,石蜡浸润的盒可以不受任何限制地邮寄,因为样品是完全固定和惰性的。
意义和替代方法
FISH和粘液染色的结合可以分析特定组织位置的微生物群组成以及单个细菌与宿主之间的相互作用。涉及微生物群内特定位点分析的替代技术通常无法探索这些相互作用的单细胞性质,例如在激光捕获显微切割结合测序的情况下19。然而,基于测序的技术具有能够在比16S rRNA探针更精细和更广泛的水平上捕获微生物群的遗传组成的优势。
所提出的方案的一个缺陷是,它提供了与宿主相关的微生物群的一次性快照。对于活体动物的实时成像,需要特殊的成像技术来促进深层组织中荧光信号的采集(例如,活体内双光子显微镜和光片荧光显微镜20,21)。在这些方法中,模型生物要么被细菌定植,这些细菌被染色的分子与其包膜结合20 ,要么被含有荧光蛋白的转基因细菌21。在后一种情况下,荧光蛋白的成熟是一个关键问题,因为大多数标准荧光蛋白需要氧气来发光。因此,需要具有至少厌氧环境(纳摩尔氧气浓度)的模型生物,例如需氧斑马鱼肠道21。
在该协议中,甲醇 - Carnoy被用作固定剂而不是多聚甲醛或福尔马林,因为它不含水。这可以防止在加工过程中粘液层的水合作用,脱水和塌陷,并有助于准确测量粘液厚度。虽然甲基苯丙胺固定和石蜡包埋已成为该领域的标准,但已经研究了不同的固定剂和包埋技术以优化粘液保存9,22,一些研究表明树脂可能优于石蜡包埋22。石蜡包埋和甲基苯丙烷固定的另一个重要限制是荧光蛋白荧光的损失,这可以通过使用替代固定剂(例如福尔马林或多聚甲醛(PFA))或改良包埋技术来避免23。每种固定剂都有优点和缺点,固定剂的选择取决于成像优先级。如果生物重复固定在PFA和甲基卡恩中,并且从两个样品中获得图像,则可以组合成像方式。
FISH已与免疫荧光结合,在具有特异性抗Muc2C3兔多克隆抗体的分离实例中9,24。这些结果尚未与其他Muc2抗体广泛重现,表明抗体的选择可能对FISH-免疫荧光组合的成功至关重要。对给定抗体成功进行抗体染色的条件可能不允许保留 FISH 染色。
故障 排除
在该协议中,样品收集,切片和染色是防止产生成像伪影的关键步骤。例如,在收集时和包埋之前按压组织可能导致微生物群的位置错位并影响粘液质量。另一个重要的考虑因素是避免将厚度非常不同的片段组合在单个暗盒中,例如小肠的相对空的片段和远端结肠内的沉淀。不同的厚度导致成像困难:嵌入后,一个片段的特定深度的横向切片可能处于另一个片段成像的错误深度(例如,每个组织的管腔将处于不同的深度)(图1B,C 和 图3A)。此外,对于动物模型粪便颗粒的成像,它们可以包裹在腹膜24中。在这种技术中,在方案中概述的洗涤步骤中,将一小段新鲜分离的腹膜轻轻地折叠在粪便周围,并保持沉淀的结构。
与处理含有物的动物组织不同,对人体肠道样本进行成像存在一些挑战。具体而言,腔内内容物和粘膜内壁可能会被通常在肠道活检或切除手术前进行的结肠镜检查肠道准备破坏。此外,当收集活检时,在没有肠道内容物的情况下,记录组织方向有助于识别特定特征(例如,腔与粘膜下)。用3%琼脂和/或琼脂预包埋:明胶混合物可能有助于维持组织极性25;然而,正如文献中报道的那样,琼脂的脱水和切片存在问题,并且可能需要改变处理时间。
实现良好 FISH 染色的一个关键方面是调整特定 FISH 探针的甲酰胺浓度。甲酰胺将控制FISH探针与其靶标的杂交严格性。重要的是要确保a)选择适当的甲酰胺浓度来染色给定的群落,以及b)对于正在使用的探针组合甚至可以选择合适的甲酰胺浓度 - 这可能会影响使用多个探针时的最佳探针选择。诸如mathFISH(http://mathfish.cee.wisc.edu/)之类的网站可能有助于计算给定探针的适当甲酰胺浓度。在没有关于适当甲酰胺浓度的信息的情况下,可以使用0%和10%甲酰胺测试该协议。
切开嵌入的样品需要将块切割到足够的深度以获得腔内切片,因为将切片太浅到块中将导致没有腔内内容物的绒毛/隐窝的横截面视图(图3A)。切片后不久对样品进行染色以获得最佳FISH信号,并使用新鲜的DAPI(或储存在-20°C的DAPI)来解决背景问题(图3C)。对超过一个月大的切片进行 FISH 染色可能会导致染色较差/不一致。
如果组织或盖玻片相对于载玻片不是完全平坦的,则样品可能无法在瓷砖扫描中的每个位置聚焦(图3B),从而导致浪费精力和潜在的光漂白。这可以通过进行较小的磁贴扫描来解决,其中所有位置都已验证为焦点。用钝的刀片切片也可能导致粘液和腔内内容物脱落,在成像时表现为大的黑暗区域。最后,杂交步骤中溶液或气泡的蒸发可导致组织中FISH探针的染色不均匀。
影响FISH探针结合效率的另一个关键参数是不同探针之间的竞争。验证FISH探针是否标记细菌的有用检查是用DAPI检查来自FISH探针的信号的共定位(图2C,D)。在需要使用多个rRNA探针的样品中,调整杂交温度、探针浓度和甲酰胺等参数对于确保探针有效地与正确的物质结合至关重要18。
有关成像的注意事项
FISH染色的细菌最好使用共聚焦显微镜和至少40倍放大倍率的物镜进行可视化。虽然63倍放大倍率比在单细胞水平上成像细菌更可取,但40倍放大倍率也可以通过最大化数字变焦或采用超分辨率系统来使用。配备超分辨率功能的系统还可以提供单个细菌细胞的亚细胞分辨率。可以使用较低放大倍率的物镜来获得细菌定位和粘液厚度的一般感觉。
还强烈建议采集16位图像而不是8位图像,因为更高的动态范围将有助于从上皮的极亮核和腔内细菌的相对微弱的信号中捕获DAPI信号的宽范围。除了使用上述成像设置外,一个重要的成像考虑因素是荧光团的选择。为了在细菌类型之间实现最佳分离,请确保所使用的荧光团在激发和发射光谱中不重叠(除非在具有线性解氧能力的系统上进行成像)。此外,探针可以组合使用(例如,家族特异性探针和属特异性探针的组合)来识别其他群落成员。如果使用线性分离或未经验证的探针,则必须测试纯培养物上FISH染色的准确性和水平8,14。
一旦收集了图像,就可以使用多种工具对宿主 - 微生物群界面进行定量分析,例如BacSpace26,HiPR-FISH8和其他分割工具27。BacSpace是一款MATLAB软件,可以分割组织和腔内成分,并从图像中去除植物材料26。该程序还提供2D粘液厚度分析,并根据不同通道中的像素距离量化空间分布26。相反,HiPR-FISH图像分析软件允许对FISH染色的细胞进行分割8。最后,针对体外实验27优化的其他细菌分割工具也可以适应此应用。
结论
原位 成像能够在其他群落成员的背景下对单个微生物群落以及由饮食,粘液和宿主上皮隐窝产生的各种微环境进行定量分析。生物体之间的相互作用决定了宿主相关微生物系统的生物学,并为扰动期间这些结构的变化提供了对健康有影响的基本分析。值得注意的是,通过上述方案 在原位 成像微生物群的能力为微生物群与动物宿主相关的生物地理学提供了一个令人难以置信的窗口。
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢Kristen Earle博士的宝贵技术开发,Amber Hann博士的故障排除帮助,Jen Nguyen博士和Deanna Pepin博士对手稿的批评性审查,以及Hesham Soliman博士和不列颠哥伦比亚大学的Rossi实验室提供显微镜访问。作者感谢CIHR团队资助的支持:加拿大微生物组倡议2(C.T.),克罗恩病和结肠炎加拿大(C.T.和K.M.N.),CIFAR(C.T.和K.M.N.),迈克尔史密斯健康研究基金会学者奖(C.T.),韦斯顿基金会:韦斯顿家族微生物组倡议(C.T.),保罗艾伦杰出研究员奖(C.T.)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
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