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Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

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DOI:

10.3791/62652

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2 de agosto de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Price Institute of Surgical Research, Department of Surgery, University of Louisville

Neste artigo

Resumo

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Resumo

Os macrófagos associados ao tumor (TAM) podem mudar sua expressão e perfil de citocina de acordo com estímulos externos. Essa notável plasticidade permite que a TAM se adapte às mudanças contínuas dentro do microambiente tumoral. Os macrófagos podem ter atributos principalmente pró-inflamatórios (semelhantes a M1) ou anti-inflamatórios (semelhantes a M2) e podem alternar continuamente entre esses dois estados principais. Macrófagos semelhantes a M2 no ambiente tumoral estão associados à progressão do câncer e ao prognóstico ruim em vários tipos de câncer. Muitos métodos diferentes para induzir diferenciação e polarização das células THP-1 são usados para investigar mecanismos celulares e intercelulares e os efeitos da TAM dentro do microambiente dos tumores. Atualmente, não há um modelo estabelecido para a polarização macrófago semelhante a M2 usando a linha celular THP-1, e os resultados de perfis de expressão e citocina de macrófagos devido a certos estímulos in vitro variam entre estudos. Este protocolo serve como orientação detalhada para diferenciar células semelhantes ao monócito THP-1 em macrófagos M0 e para polarizar ainda mais as células em um fenótipo semelhante a M2 dentro de 14 dias. Demonstramos as alterações morfológicas das células moncidas THP-1, macrófagos diferenciados e macrófagos polarizados semelhantes a M2 usando microscopia leve. Este modelo é a base para modelos de linha celular que investigam os efeitos anti-inflamatórios da TAM e suas interações com outras populações celulares do microambiente tumoral.

Introdução

Macrófagos associados ao tumor (TAM) e seu papel na inflamação crônica, o aparecimento do câncer e o desenvolvimento de tumores são alvos importantes em pesquisas recentes1,2. Monócitos sanguíneos periféricos que são recrutados para o microambiente tecidual do tumor em desenvolvimento se diferenciam em macrófagos e podem ser polarizados em dois subtipos principais de macrófagos3. O macrófago ativado clássicamente representa o fenótipo m1 principalmente pró-inflamatório e o subtipo alternativo ativado como M2 mostra características predominantemente anti-inflamatórias4. Os macrófagos podem alternar dinamicamente entre esses dois fenótipos principais dependendo do metabolismo celular, com subtipos intermediários com atributos inflamatórios e anti-inflamatórios5. A TAM representa uma população heterogênea de ambos os fenótipos. Uma função promotora de tumores e um prognóstico ruim em diferentes tipos de cânceres está, no entanto, particularmente associado aos macrófagos semelhantes a M26,7,8.

Os perfis funcionais de macrófagos e sua interação com outras células dentro do microambiente tumoral são complexos e desafiadores de capturar em um ambiente em constante mudança durante o desenvolvimento contínuo do tumor. As linhas celulares podem proporcionar uma população celular homogênea com viabilidade estável na cultura, o que pode facilitar o processo de demonstração de mecanismos celulares e intercelulares definidos. A linha celular THP-1 semelhante a monócitos é um sistema modelo legítimo para monócitos humanos primários9. Esta linha celular espontaneamente imortalizada foi obtida a partir do sangue periférico de uma criança de um ano de idade com leucemia monocítica aguda9,10. A diferenciação e polarização das células THP-1 têm sido relatadas por diversos estudos e têm sido realizadas de várias formas diferentes11,12,13,14. Ativação e, portanto, a polarização dos macrófagos em um fenótipo semelhante a M1 é seguida por um mecanismo de recuperação anti-inflamatória compensatória, promovendo um fenótipo semelhante a M2 através de citocinas produzidas por macrófagos inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6) ou a itacina15,16. Isso pode servir como um mecanismo de ruptura para atenuar uma resposta inflamatória exagerada após a ativaçãocelular 17. O processo de diferenciação e polarização de monócitos e células monocitos THP-1 em um fenótipo anti-inflamatório semelhante a M2 é também acompanhado por estímulos pró-inflamatórios que devem ser superados. Uma resposta inflamatória de citocinas pode ser causada por estresse mecânico18,como a mudança de mídia para realimentar as células, ou adicionar compostos químicos para diferenciar células THP-1, como phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), e induzir a produção de fator de necrose tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) ou IL-619. Esse perfil de expressão de citocina alterado como resposta ao PMA pode afetar e prevenir a polarização do macrófago subsequente20. Períodos de descanso adequados, como relatado antes após o tratamento da PMA, permitem que essas respostas inflamatórias diminuam e facilitem a polarização celular em um fenótipo21distinto semelhante a M2 .

Este protocolo demonstra um método para diferenciar e polarizar células semelhantes ao monócito THP-1 em um fenótipo semelhante a M2 de macrófagos dentro de 14 dias.

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Protocolo

NOTA: Uma visão geral das etapas descritas neste protocolo é mostrada na Figura 1. A linha celular de leucemia semelhante a monócitos humanos THP-1 foi comprada. A análise de repetição em tandem curto foi realizada para autenticar a linha celular THP-1. Realize todas as etapas em condições estéreis. A linha de células monocíticas THP-1 cresce em suspensão e não se prende a superfícies de cultura celular. A adesão pode ser induzida pela diferenciação de monócitos em células semelhantes a macrófagos através, por exemplo, estresse mecânico ou tratamento específico com PMA.

1. Culturação e manutenção de células semelhantes a monícitos THP-1

  1. Estabeleça um temporizador para 150 s. Remova o frasco congelado contendo a linha celular THP-1(Tabela de Materiais) do nitrogênio líquido e descongele-o imediatamente em um banho de água limpa (37 °C). Inicie o temporizador assim que o frasco for colocado no banho de água. Solte a tampa para liberar a pressão que está aumentando devido ao processo de descongelamento, mas certifique-se de que a abertura do tubo não entre em contato com a água, para evitar contaminação. O período ideal para descongelar as células está entre 120-150 s. Continue descongelando a suspensão da célula até que um chip de gelo do tamanho de cerca de 4 mm seja deixado dentro do frasco; em seguida, prossiga para o próximo passo imediatamente.
  2. Transfira a fase líquida da suspensão celular para um tubo de 15 mL contendo 9 mL de mídia de crescimento quente (37 °C)(Tabela de Materiais). Em seguida, transfira 1 mL da suspensão de células médias quentes para o frasco THP-1 e volte para o tubo de 15 mL para derreter o chip de gelo restante e lavar o frasco para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás.
  3. Misture a suspensão suavemente por pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 μL. Remova uma pequena amostra (aproximadamente 10 μL) para contar as células para viabilidade (usando azul trypan para exclusão) enquanto elas são giradas. Gire a suspensão da célula quente a 200 x g por 7 min a 37 °C.
  4. Remova o supernatante completamente e resuspend com um certo volume de meio de crescimento quente para alcançar uma densidade celular de 5 x 105/mL. Misture a suspensão suavemente e transfira 22 mL de volume em frascos de cultura celular T-75(Tabela de Materiais). Armazene frascos eretos em uma incubadora a 37 °C com concentração de 5% de dióxido de carbono (CO2). Troque a mídia de crescimento a cada 3-4 dias.

2. Semeadura de células THP-1 e diferenciação em macrófagos M0

  1. Prepare a célula contendo meio de crescimento com a respectiva densidade celular para células de sementes a uma densidade de 3 x 105/mL/bem em placas de cultura celular de 24 poços(Tabela de Materiais). Misture o meio suavemente e prepare alíquotas de 26 mL, cada uma colocada em um tubo de 50 mL. Use cada alíquota de 26 mL para semear as células em uma respectiva placa.
  2. Transfira 1 mL do meio contendo células em cada poço de uma placa de 24 poços. Misture a mídia suavemente, encanar para cima e para baixo entre as transferências.
  3. Prepare uma solução de estoque de PMA (dissolver 1 mg de PMA em 100 μL de Sulfóxido de Dimetila (DMSO) = ~16 mM solução de PMA em DMSO) e dilui-lo com salina tampão fosfato frio (PBS) para uma concentração final de trabalho de 10 ng/μL logo antes do tratamento celular(Tabela de Materiais). Mantenha a solução no gelo e use-a imediatamente. Não congele novamente. Adicione 100 ng de PMA por poço. Deixe cada placa de célula sentar na incubadora sem qualquer tratamento adicional por 72 h.
  4. Após 72 h, remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Não toque na parte inferior dos poços com pontas de pipeta. Deixe as células descansarem por mais 96 h na incubadora.
  5. Depois de 96 horas, repita o passo 2.4 (mudança de mídia) e deixe as células descansarem por mais 24h.
    NOTA: Os macrófagos M0 estão agora prontos para serem usados para experimentos(Figura 2). Imediatamente antes de tratar as células como parte de outros experimentos, considere uma mudança de mídia apenas com RPMI(Tabela de Materiais),uma vez que suplementos de mídia de crescimento podem causar interferência com reagentes que são adicionados para tratamento celular. No caso de macrófagos semelhantes a M2 serem necessários, proceda com a seção 3.

3. Polarização de macrófagos M0 em macrófagos semelhantes a M2

  1. Prepare uma solução de estoque de IL-4 e IL-13 (dissolver 20 μg de IL-4 ou IL-13 em 200 μL de água sem nuclease) e dilui-a a uma concentração final de trabalho de 2 ng/μL com PBS imediatamente antes do tratamento celular. Mantenha a solução no gelo e use-a imediatamente. Não congele novamente.
  2. Remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Adicione 20 ng de interleucina 4 (IL-4) e 20 ng de interleucina 13 (IL-13) por poço. Deixe as células descansarem por 48 h na incubadora.
  3. Depois das 48h, repita o passo 3.2. Deixe as células descansarem por mais 48 h na incubadora.
  4. Remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Deixe as células descansarem por 48 h na incubadora.
    NOTA: Macrófagos semelhantes a M2 estão agora prontos para serem usados para experimentos(Figura 2). Imediatamente antes de tratar as células como parte de outros experimentos, considere uma mudança de mídia apenas com RPMI(Tabela de Materiais),uma vez que suplementos de mídia de crescimento podem causar interferência.

4. Desapegar e colher macrófagos para citometria de fluxo

NOTA: Use um método mecânico que combine a queima de células e raspagem de células para se desprender e colher os macrófagos polarizados das placas para citometria de fluxo.

  1. Retire o meio da célula quente e substitua-o por uma mistura de PBS gelado (sem cálcio e magnésio) e 5% de soro bovino fetal (FBS), 1 mL por poço. Imediatamente depois disso, coloque a placa de célula no gelo por 45 minutos. Não coloque a placa celular no gelo antes que o meio da célula quente seja removido, uma vez que isso diminuirá significativamente a viabilidade celular. Mantenha as células no gelo somente depois de induzir choque frio com mistura de PBS/5% FBS gelada.
  2. Após 45 min no gelo, raspe as células usando mini raspadores de células(Tabela de Materiais). Transfira suavemente os macrófagos separados em PBS frio/5% FBS em um tubo de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo o tempo todo até que as células estejam manchadas.
    NOTA: Poça oito poços de células para atingir a contagem adequada de células para coloração.

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Resultados

Macrófagos semelhantes a M2 foram caracterizados, e a polarização M2 foi validada usando citometria de fluxo para marcadores de cluster de diferenciação CD14, CD11b, CD80 (marcador semelhante a M1) e CD206 (marcador semelhante a M2). A coloração da citometria de fluxo foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os macrófagos foram lavados com PBS/5% FBS e incubados com bloco de receptor de Fcγ para evitar ligação inespecífica. As células foram então manchadas com anticorpos anti-humanos de camundongos conjug...

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Discussão

Este protocolo de diferenciação e polarização de células monocitos THP-1 dentro de 14 dias fornece um método para obter macrófagos com um fenótipo distinto semelhante a M2 devido à longa incubação de células com períodos de descanso adequados entre as etapas.

Certos passos são fundamentais para este protocolo. O tempo de duplicação dos monócitos THP-1 é de aproximadamente 26 h. As células podem ser divididas a uma densidade celular de 9 x 105/mL e devem ser semeadas a uma densidade ...

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Divulgações

Os autores não declaram potenciais conflitos de interesse.

Agradecimentos

O Price Institute of Surgical Research, Universidade de Louisville, é apoiado financeiramente pela John W. Price e Barbara Thruston Atwood Price Trust. As fontes de financiamento não tiveram papel na concepção e condução do estudo, bem como na coleta, gestão, análise e interpretação dos dados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% azul de tripanoVWR, Radnor, EUA152-5061
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLUSA Scientific, Ocala, EUA1615-5510
Pipeta sorológica de 10 mLVWR, Radnor, EUA  89130-898
1000 μ L TipOne pontas de pipetaUSA Scientific, Ocala, USA1111-2821
15 mL  Tubo de centrífugaVWR, Radnor, EUA89039-664
20 μ L TipOne pontas de pipetaUSA Scientific, Ocala, EUA1120-1810
200 μ Pontas de pipeta L TipOneUSA Scientific, Ocala, USA1120-8810
pipeta sorológica de 25 mLVWR, Radnor, USA  89130-900
pipeta sorológica de 5 mLVWR, Radnor, EUA  89130-896
Tubo de centrífuga de 50 mLVWR, Radnor, EUA89039-662
Solução Accutase 500 mLSigma, St. Louis, EUAA6964
Solução antibiótica antimicótica (100x), estabilizadaSigma, St. Louis, EUAA5955-100 mLcom 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina e 25 μ g de anfotericina B por ml, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células
Incubadora de CO2 aglutinanteVWR, Radnor, EUAC170-ULE3
Frasco CytoOne T-75cm com tampa de filtroUSA Scientific, Ocala, EUACC7682-4875
Dulbecco» s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma, St. Louis, USAD8537-500 mLPBS sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio devem ser usados, pois ambos podem alterar a polarização dos macrófagos
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerada)Eppendorf, Enfield,USA-Álcool
etílico (70%)--
FACSCalibur citômetro de fluxoBD Biosciences, San Diego, EUA-O citômetro de fluxo opera com o software CellQuest (BD Biosciences)
Falcon de placa de 24 poçosVWR, Radnor, EUA353504
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC, Manassas, EUA30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14BD Biosciences, San Diego, EUA555397Citometria de fluxo, marcador de células mielóides (100 testes)
FITC Mouse Anti-Human CD80BD Pharmingen, San Diego, EUA557226Citometria de fluxo, marcador M1 (100 testes)
FITC Mouse IgG1 κ Controle de isotipoBD Pharmingen, San Diego, EUA555748Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD80 (100 testes)
FITC Mouse IgG2a, κ Controle de isotipoBD Biosciences, San Diego, EUA553456Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD14 (100 testes)
Bloco BD Fc humanoBD Biosciences, San Diego, EUA564220Citometria de fluxo, bloco Fc (0,25 mg)
Interleucina humana 13 (IL-13)R& D, Minneapolis, EUAIL-771-10 μ g
Interleucina humana 4 (IL-4)R& D, Minneapolis, EUASRP3093-20 μ g
Gabinete de Biossegurança Labconco (Série Delta 36212/36213)Labconco, Kansas City, EUA-Soluçãode
L-Glutamina, 200 mMATCC, Manassas, EUA30-2214
Lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli 0111:B4Sigma, St. Louis, EUAL2630-100 mg
Mini Raspadores de CélulasBiotium, Fremont, EUA22003
Neubauer hemocitômetroFisher Scientific, Waltham, EUA02-671-5
Microscópio invertido Nikon Eclipse TS100Nikon, Melville,EUA-Água
sem nucleaseInvitrogen, Carlsbad, EUAAM9937
Microscópio óptico Olympus RH-2Microscópio Central, Feasterville, EUA40888
Pipeta variável P10 - GilsonVWR, Radnor, EUA76180-014
Pipeta variável P1000 - GilsonVWR, Radnor, EUA76177-990
Pipeta variável P200 - GilsonVWR, Radnor, EUA76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11bBD Biosciences, San Diego, EUA555388Citometria de fluxo, marcador de células mielóides (100 testes)
PE Mouse IgG1, κ Controle de isotipoBD Biosciences, San Diego, EUA555749Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD11b (100 testes)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206BD Pharmingen, San Diego, EUA551136Citometria de fluxo, marcador M2 (100 testes)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Controle de isotipoBD Pharmingen, San Diego, EUA555750Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD206 (100 testes)
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma, St. Louis, EUAP8139
Powerpette Plus pipetadorVWR, Radnor, EUA75856-448
Banho-maria de precisão (modelo 183)Precision Scientific, Chicago, EUA66551
RPMI-1640 ATCC médio, Manassas, EUA30-2001
Linha celular THP-1, American Type Culture Collection (ATCC)ATCC, Manassas, EUATIB-202

Referências

  1. Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).
  2. Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
  3. Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582(2018).
  4. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  5. Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
  6. Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
  7. Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
  8. Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
  9. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438(2016).
  10. The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
  11. Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721(2020).
  12. Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577(2015).
  13. Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601(2018).
  14. Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
  15. Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
  16. O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
  17. Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
  18. Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3(2019).
  19. Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
  20. Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
  21. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  22. Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097(2017).
  23. Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687(2013).
  24. Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393(2019).
  25. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
  26. Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).

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