Artigo de método
Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.
Os macrófagos associados ao tumor (TAM) podem mudar sua expressão e perfil de citocina de acordo com estímulos externos. Essa notável plasticidade permite que a TAM se adapte às mudanças contínuas dentro do microambiente tumoral. Os macrófagos podem ter atributos principalmente pró-inflamatórios (semelhantes a M1) ou anti-inflamatórios (semelhantes a M2) e podem alternar continuamente entre esses dois estados principais. Macrófagos semelhantes a M2 no ambiente tumoral estão associados à progressão do câncer e ao prognóstico ruim em vários tipos de câncer. Muitos métodos diferentes para induzir diferenciação e polarização das células THP-1 são usados para investigar mecanismos celulares e intercelulares e os efeitos da TAM dentro do microambiente dos tumores. Atualmente, não há um modelo estabelecido para a polarização macrófago semelhante a M2 usando a linha celular THP-1, e os resultados de perfis de expressão e citocina de macrófagos devido a certos estímulos in vitro variam entre estudos. Este protocolo serve como orientação detalhada para diferenciar células semelhantes ao monócito THP-1 em macrófagos M0 e para polarizar ainda mais as células em um fenótipo semelhante a M2 dentro de 14 dias. Demonstramos as alterações morfológicas das células moncidas THP-1, macrófagos diferenciados e macrófagos polarizados semelhantes a M2 usando microscopia leve. Este modelo é a base para modelos de linha celular que investigam os efeitos anti-inflamatórios da TAM e suas interações com outras populações celulares do microambiente tumoral.
Macrófagos associados ao tumor (TAM) e seu papel na inflamação crônica, o aparecimento do câncer e o desenvolvimento de tumores são alvos importantes em pesquisas recentes1,2. Monócitos sanguíneos periféricos que são recrutados para o microambiente tecidual do tumor em desenvolvimento se diferenciam em macrófagos e podem ser polarizados em dois subtipos principais de macrófagos3. O macrófago ativado clássicamente representa o fenótipo m1 principalmente pró-inflamatório e o subtipo alternativo ativado como M2 mostra características predominantemente anti-inflamatórias4<....
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NOTA: Uma visão geral das etapas descritas neste protocolo é mostrada na Figura 1. A linha celular de leucemia semelhante a monócitos humanos THP-1 foi comprada. A análise de repetição em tandem curto foi realizada para autenticar a linha celular THP-1. Realize todas as etapas em condições estéreis. A linha de células monocíticas THP-1 cresce em suspensão e não se prende a superfícies de cultura celular. A adesão pode ser induzida pela diferenciação de monócitos em células semelhantes a macrófagos através, por exemplo, estresse mecânico ou tratamento específico com PMA.
1. Culturação e manutenção de célu....
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Macrófagos semelhantes a M2 foram caracterizados, e a polarização M2 foi validada usando citometria de fluxo para marcadores de cluster de diferenciação CD14, CD11b, CD80 (marcador semelhante a M1) e CD206 (marcador semelhante a M2). A coloração da citometria de fluxo foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os macrófagos foram lavados com PBS/5% FBS e incubados com bloco de receptor de Fcγ para evitar ligação inespecífica. As células foram então manchadas com anticorpos anti-humanos de camundongos conjug.......
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Este protocolo de diferenciação e polarização de células monocitos THP-1 dentro de 14 dias fornece um método para obter macrófagos com um fenótipo distinto semelhante a M2 devido à longa incubação de células com períodos de descanso adequados entre as etapas.
Certos passos são fundamentais para este protocolo. O tempo de duplicação dos monócitos THP-1 é de aproximadamente 26 h. As células podem ser divididas a uma densidade celular de 9 x 105/mL e devem ser semeadas a uma densidade .......
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Os autores não declaram potenciais conflitos de interesse.
O Price Institute of Surgical Research, Universidade de Louisville, é apoiado financeiramente pela John W. Price e Barbara Thruston Atwood Price Trust. As fontes de financiamento não tiveram papel na concepção e condução do estudo, bem como na coleta, gestão, análise e interpretação dos dados.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,4% azul de tripano | VWR, Radnor, EUA | 152-5061 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | USA Scientific, Ocala, EUA | 1615-5510 | |
| Pipeta sorológica de 10 mL | VWR, Radnor, EUA& | nbsp; 89130-898 | |
| 1000 μ L TipOne pontas de pipeta | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Tubo de centrífuga | VWR, Radnor, EUA | 89039-664 | |
| 20 μ L TipOne pontas de pipeta | USA Scientific, Ocala, EUA | 1120-1810 | |
| 200 μ Pontas de pipeta L TipOne | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| pipeta sorológica de 25 mL | VWR, Radnor, USA& | nbsp; 89130-900 | |
| pipeta sorológica de 5 mL | VWR, Radnor, EUA& | nbsp; 89130-896 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | VWR, Radnor, EUA | 89039-662 | |
| Solução Accutase 500 mL | Sigma, St. Louis, EUA | A6964 | |
| Solução antibiótica antimicótica (100x), estabilizada | Sigma, St. Louis, EUA | A5955-100 mL | com 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina e 25 μ g de anfotericina B por ml, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células |
| Incubadora de CO2 aglutinante | VWR, Radnor, EUA | C170-ULE3 | |
| Frasco CytoOne T-75cm com tampa de filtro | USA Scientific, Ocala, EUA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco» s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio devem ser usados, pois ambos podem alterar a polarização dos macrófagos |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerada) | Eppendorf, Enfield, | USA-Álcool | |
| etílico (70%) | - | - | |
| FACSCalibur citômetro de fluxo | BD Biosciences, San Diego, EUA- | O citômetro de fluxo opera com o software CellQuest (BD Biosciences) | |
| Falcon de placa de 24 poços | VWR, Radnor, EUA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, EUA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, EUA | 555397 | Citometria de fluxo, marcador de células mielóides (100 testes) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, EUA | 557226 | Citometria de fluxo, marcador M1 (100 testes) |
| FITC Mouse IgG1 κ Controle de isotipo | BD Pharmingen, San Diego, EUA | 555748 | Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD80 (100 testes) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Controle de isotipo | BD Biosciences, San Diego, EUA | 553456 | Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD14 (100 testes) |
| Bloco BD Fc humano | BD Biosciences, San Diego, EUA | 564220 | Citometria de fluxo, bloco Fc (0,25 mg) |
| Interleucina humana 13 (IL-13) | R& D, Minneapolis, EUA | IL-771-10 μ g | |
| Interleucina humana 4 (IL-4) | R& D, Minneapolis, EUA | SRP3093-20 μ g | |
| Gabinete de Biossegurança Labconco (Série Delta 36212/36213) | Labconco, Kansas City, EUA-Solução | de | |
| L-Glutamina, 200 mM | ATCC, Manassas, EUA | 30-2214 | |
| Lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, EUA | L2630-100 mg | |
| Mini Raspadores de Células | Biotium, Fremont, EUA | 22003 | |
| Neubauer hemocitômetro | Fisher Scientific, Waltham, EUA | 02-671-5 | |
| Microscópio invertido Nikon Eclipse TS100 | Nikon, Melville, | EUA-Água | |
| sem nuclease | Invitrogen, Carlsbad, EUA | AM9937 | |
| Microscópio óptico Olympus RH-2 | Microscópio Central, Feasterville, EUA | 40888 | |
| Pipeta variável P10 - Gilson | VWR, Radnor, EUA | 76180-014 | |
| Pipeta variável P1000 - Gilson | VWR, Radnor, EUA | 76177-990 | |
| Pipeta variável P200 - Gilson | VWR, Radnor, EUA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, EUA | 555388 | Citometria de fluxo, marcador de células mielóides (100 testes) |
| PE Mouse IgG1, κ Controle de isotipo | BD Biosciences, San Diego, EUA | 555749 | Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD11b (100 testes) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, EUA | 551136 | Citometria de fluxo, marcador M2 (100 testes) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Controle de isotipo | BD Pharmingen, San Diego, EUA | 555750 | Citometria de fluxo, controle de isotipo para CD206 (100 testes) |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma, St. Louis, EUA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipetador | VWR, Radnor, EUA | 75856-448 | |
| Banho-maria de precisão (modelo 183) | Precision Scientific, Chicago, EUA | 66551 | |
| RPMI-1640 ATCC médio | , Manassas, EUA | 30-2001 | |
| Linha celular THP-1, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, EUA | TIB-202 |
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