Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).
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Artigo de método
Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As funções potenciais das células semelhantes a hepatócitos (HLCs) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm grande promessa para modelagem de doenças e aplicações de rastreamento de medicamentos. Fornecido aqui é um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hESCs em HLCs funcionais. O estabelecimento de uma linhagem de endoderm é um passo fundamental na diferenciação para os HLCs. Pelo nosso método, regulamos as principais vias de sinalização, suplementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE), seguido pela geração de células progenitoras hepáticas, e finalmente HLCs com morfologia hepatocitada típica em um método de estágio com reagentes completamente definidos. Os HLCs derivados do hESC produzidos por este método expressam marcadores específicos de palco (incluindo albumina, O receptor nuclear HNF4α e o polipeptídeo de cotransportamento de sódio (NTCP) e apresentam características especiais relacionadas a hepatócitos maduros e funcionais (incluindo coloração verde indocitana, armazenamento de glicogênio, coloração de hematoxilina-eosina e atividade CYP3), e pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de aplicações baseadas em HLC no estudo de doenças hepáticas.
Introdução
O fígado é um órgão altamente metabólico que desempenha vários papéis, incluindo desoxidação, armazenamento de glicogênio, e secreção e síntese de proteínas1. Vários patógenos, drogas e herediidade podem causar alterações patológicas no fígado e afetar suas funções2,3. Os hepatócitos, como a principal unidade funcional do fígado, desempenham um papel importante nos sistemas de apoio hepático artificial e na eliminação da toxicidade medicamentosa. No entanto, o recurso dos hepatócitos humanos primários é limitado na terapia baseada em células, bem como na pesquisa de doenças hepáticas. P....
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Protocolo
1. Manutenção de células-tronco
NOTA: O protocolo de manutenção celular descrito abaixo se aplica à linha de células hES03 mantida em uma monocamada aderente. Para todos os protocolos a seguir neste manuscrito, as células devem ser manuseadas sob um gabinete de segurança biológica.
- Prepare o meio de cultura de células-tronco 1x mTesR diluindo 5x meio suplementar para mTesR meio básico.
- Prepare o meio Matrigel qualificado em 30x hESC diluindo 5 mL de Matrigel qualificado pelo HESC com 5 mL de DMEM/F12 no gelo. Armazenar a -20 °C.
- Prepare 1x hESC-qualificado meio Matrigel diluindo 33,3 μL de 30x hESC qualificado ....
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Resultados
O diagrama esquemático da indução de HLC de hESCs e imagens representativas de campo brilhante de cada estágio de diferenciação são mostrados na Figura 1. No Estágio I, Activin A e CHIR99021 foram adicionados por 3 dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. No Estágio II, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por 5 dias. Na Fase III, os hepatócitos precoces amadureceram e se diferenciaram .......
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Discussão
Aqui, apresentamos um método stepwise que induz os HLCs dos hESCs em três estágios. Na primeira etapa, Activin A e CHIR99021 foram utilizados para diferenciar os hESCs em DE. No segundo estágio, ko-DMEM e DMSO foram usados para diferenciar DE em células progenitoras hepáticas. No terceiro estágio, HZM mais HGF, OSM e hidrólio 21-hemisuccinato de sódio foram usados para continuar a diferenciar células progenitoras hepáticas em HLCs.
As seguintes etapas críticas devem ser levadas em consideração.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 para P.N.S.); a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (N. 2020A1515010054 para P.N.S.), Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (N. No. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Para diferenciação de progenitor hepático |
| 488 rotulado cabra contra camundongo IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | Para IF, segundo anticorpo |
| 488 marcado cabra contra Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | Para IF, segundo anticorpo |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | Para passagem celular |
| Activin A | peproTech | 120-14E | Para a formação definitiva da endoderme |
| Anti - albumina (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | Para SE e WB, anticorpo preliminar |
| Anti - humano Oct4 | Abcam Ab19587 | Para IF, anticorpo preliminar | |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | Para SE e WB, anticorpo preliminar |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | Para IF, anticorpo primário |
| Anti-Hepatócito Fator Nuclear 4 alfa (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | Para IF, anticorpo primário |
| B-27 Suplemento | Gibco | 17504-044 | Para formação definitiva de endoderme |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | Para bloqueio celular |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | Para formação definitiva de endoderme |
| DAPI | Beyotime | C1006 | Para coloração nuclear |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | Para dissolução de RNA |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | Para formação definitiva de endoderme |
| DMEM / F12 | Gibco | 11320-033 | Para cultura de células |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | Para diferenciação de progenitor hepático |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Para cultura de células |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | para diferenciação hepática do progenitor |
| H& Kit de coloração E | Beyotime | C0105S | para H & Coloração E |
| Fator de crescimento de hepatócitos (HGF) | peproTech | 100-39 | Para diferenciação de hepatócitos |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | Para diferenciação de hepatócitos |
| Hidrocortisona-21-hemisuccinato | Sigma-Aldrich | H4881 | Para diferenciação de hepatócitos |
| Indocianina | Sangon Biotech | A606326 | Para coloração de indocianina |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | Para diferenciação de progenitores hepáticos |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco A31815-02 | Para diferenciação de progenitores hepáticos | |
| Matrigel hESC-qualificado | Corning | 354277 | Para cultura de células |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | Para diferenciação de progenitores hepáticos |
| mTesR 5X Suplemento | Stem Cell Technologies | 85852 | Para cultura de células |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Para cultura de células |
| Oncostatina (OSM) | peproTech | 300-10 | Para diferenciação de hepatócitos |
| P450 - CYP3A4 (Luciferina - PFBE) | Promega | V8901 | Para CYP450 atividade |
| Kit de coloração PAS | Solarbio | G1281 | Para coloração PAS |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Para diferenciação celular |
| ZSGB-BIO ZB-2305 | cabra conjugada com peroxidase | WB, segundo anticorpo | |
| Tampão de diluição de anticorpo primário para Western Blot | Beyotime | P0256 | Para diluição de anticorpos primários |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | Para síntese de cDNA |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | Para isolamento de RNA |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | Para formação definitiva de endoderme |
| Leite desnatado | Sangon Biotech | A600669 | Para a segunda preparação de anticorpos |
| A25742 | Thermo Fisher | da mistura mestra verde de SYBR | para a análise |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | para a formação definitiva do endoderme |
| WXBB7485V | de Tween | Sigma-Aldrich | para a preparação de lavagem do amortecedor |
Referências
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular....
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Reimpressões e permissões
