Artigo de método

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

DOI:

10.3791/62654

⸱

6 de maio de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As funções potenciais das células semelhantes a hepatócitos (HLCs) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm grande promessa para modelagem de doenças e aplicações de rastreamento de medicamentos. Fornecido aqui é um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hESCs em HLCs funcionais. O estabelecimento de uma linhagem de endoderm é um passo fundamental na diferenciação para os HLCs. Pelo nosso método, regulamos as principais vias de sinalização, suplementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE), seguido pela geração de células progenitoras hepáticas, e finalmente HLCs com morfologia hepatocitada típica em um método de estágio com reagentes completamente definidos. Os HLCs derivados do hESC produzidos por este método expressam marcadores específicos de palco (incluindo albumina, O receptor nuclear HNF4α e o polipeptídeo de cotransportamento de sódio (NTCP) e apresentam características especiais relacionadas a hepatócitos maduros e funcionais (incluindo coloração verde indocitana, armazenamento de glicogênio, coloração de hematoxilina-eosina e atividade CYP3), e pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de aplicações baseadas em HLC no estudo de doenças hepáticas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O fígado é um órgão altamente metabólico que desempenha vários papéis, incluindo desoxidação, armazenamento de glicogênio, e secreção e síntese de proteínas1. Vários patógenos, drogas e herediidade podem causar alterações patológicas no fígado e afetar suas funções2,3. Os hepatócitos, como a principal unidade funcional do fígado, desempenham um papel importante nos sistemas de apoio hepático artificial e na eliminação da toxicidade medicamentosa. No entanto, o recurso dos hepatócitos humanos primários é limitado na terapia baseada em células, bem como na pesquisa de doenças hepáticas. Portanto, desenvolver novas fontes de hepatócitos humanos funcionais é uma importante direção de pesquisa no campo da medicina regenerativa. Desde 1998, quando foram estabelecidos4,os hESCs têm sido amplamente considerados pelos pesquisadores devido ao seu potencial de diferenciação superior (eles podem se diferenciar em vários tecidos em um ambiente adequado) e alto grau de autoconexibilidade, e assim fornecer células de origem ideais para fígados bioartificial, transplante de hepatocito e até mesmo engenharia de tecido hepático5.

Atualmente, a eficiência de diferenciação hepática pode ser muito aumentada enriquecendo o endodermo6. Na diferenciação de linhagem das células-tronco em endoderme, os níveis do fator de crescimento transformador β (TGF-β) sinalização e vias de sinalização WNT são os fatores-chave no nó do estágio de formação do endoderme. A ativação de um alto nível de sinalização TGF-β e WNT pode promover o desenvolvimento do endodermo7,8. Activin A é uma citocina pertencente à superfamília TGF-β. Portanto, a Activin A é amplamente utilizada na indução de endoderme de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e hESCs9,10. GSK3 é uma proteína de serina-threonina quinase. Pesquisadores descobriram que o CHIR99021, um inibidor específico do GSK3β, pode estimular sinais típicos de WNT, e pode promover a diferenciação de células-tronco sob certas condições, sugerindo que o CHIR99021 tem potencial para induzir a diferenciação de células-tronco no endóderme 11,12,13.

Aqui relatamos um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação dos hESCs em HLCs funcionais. A adição sequencial de Activin A e CHIR99021 produziu cerca de 89,7±0,8% de células SOX17 (marcador DE)positivos. Após serem ainda mais maturadas in vitro,essas células expressaram marcadores específicos hepáticos e exerceram morfologia semelhante a hepatocito (baseada na coloração de hematoxilina-eosina (H & E)) e funções, como absorção de verde indociina (ICG), armazenamento de glicogênio e atividade CYP3. Os resultados mostram que os hESCs podem ser diferenciados com sucesso em HLCs funcionais maduros por este método e podem fornecer uma base para pesquisas relacionadas a doenças hepáticas e triagem de medicamentos in vitro.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Manutenção de células-tronco

NOTA: O protocolo de manutenção celular descrito abaixo se aplica à linha de células hES03 mantida em uma monocamada aderente. Para todos os protocolos a seguir neste manuscrito, as células devem ser manuseadas sob um gabinete de segurança biológica.

  1. Prepare o meio de cultura de células-tronco 1x mTesR diluindo 5x meio suplementar para mTesR meio básico.
  2. Prepare o meio Matrigel qualificado em 30x hESC diluindo 5 mL de Matrigel qualificado pelo HESC com 5 mL de DMEM/F12 no gelo. Armazenar a -20 °C.
  3. Prepare 1x hESC-qualificado meio Matrigel diluindo 33,3 μL de 30x hESC qualificado Matrigel com 1 mL de DMEM/F12.
  4. Cubra o poço estéril 6, placas tratadas com cultura tecidual com 1 mL de Matrigel qualificado 1x hESC em cada poço com antecedência e armazene a 4 °C durante a noite. Deixe em temperatura ambiente (RT) por pelo menos 30 minutos antes de usar.
  5. Descongele os hESCs criopreservados em um banho de água de 37 °C por 3 min sem tremer. Em seguida, transfira imediatamente as células pipetando para um tubo de centrífugas de 15 mL contendo 4 mL prewarmed 37 °C mTesR médio, pipet para cima e para baixo suavemente 2 vezes.
  6. Centrifugar os hESCs a 200 x g por 2 min no RT.
  7. Aspire o supernasce e resuspenque suavemente as células em 1 mL de mTesR médio.
  8. Aspire o meio DMEM/F12 da placa e semee as células em um poço de placa de 6 poços a uma densidade de 1 x 105 células em 2 mL de mTesR.
  9. Incubar em uma incubadora de CO2 de 5% e manter as células substituindo por meio mTesR pré-aquecido diariamente. Passagem as células em cerca de 70-80% de confluência ou quando as colônias celulares começam a fazer contato.

2. Passagem e diferenciação de células-tronco

  1. Para células de passagem, aspire o médio e incuba as células com 1 mL por poço de solução enzimática (por exemplo, Accutase por 5 min a 37 °C. Em seguida, transfira as células por tubulação para um tubo centrífuga de 15 mL contendo 4 mL de DMEM/F12 pré-rebocados a 37 °C.
  2. Centrifugar as células a 200 x g em RT por 2 min.
  3. Aspire o médio e suavemente resuspenque a pelota de célula em 1 mL de mTesR médio.
  4. Prepare placas de 24 poços com revestimento com 250 μL de 1x hESC-qualificado meio Matrigel com antecedência. Seed hESCs como descrito acima em uma densidade de 1 - 1,5 x 105 células por poço em 500 μL de mTesR médio.
  5. Deixe as células incubarem por 24 h a 37 °C em uma incubadora de CO2.

3. Formação DE

  1. Prepare soluções de estoque de 100 μg/mL Activin A com DPBS contendo 0,2% BSA e 3 mM CHIR99021 com DMSO.
  2. Prepare o estágio I diferenciar o meio básico complementando o meio RPMI com 1x B27.
  3. Adicione Activin A a uma concentração final de 100 ng/mL e CHIR99021 a uma concentração final de 3 μM em um volume apropriado de meio básico de diferenciação pré-aquecido estágio I.
  4. Aspirar mTesR médio das células e substituir por mídia de diferenciação estágio I contendo fatores de diferenciação adicionais (por exemplo, 0,5 mL por poço de uma placa de 24 poços).
  5. Permita que as células incubam por 3 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2, substituindo a mídia do Estágio I diariamente por fatores de diferenciação recém-adicionados (Dias 0-2).
    NOTA: Após 3 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores de células DE, como FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 e FOXA1 (mínimo de 80% do SOX17 necessário para prosseguir).

4. Diferenciação de células progenitoras hepáticas

  1. Prepare a diferenciação da fase II da mídia básica, dissolvendo a substituição do soro de nocaute (KOSR) para uma concentração final de 20% no DMEM knock out.
  2. Prepare o estágio II de diferenciação contendo 1% de DMSO, 1x GlutaMAX, 1x solução de aminoácido não essencial (NEAA), 100 μM 2-mercaptoethanol e 1x penicilina/estreptomicina (P/S) para o volume apropriado de KOSR/knockout DMEM.
  3. No dia 3 de diferenciação, aspire o médio e substitua pelo meio estágio II (por exemplo, 0,5 mL por poço de uma placa de 24 poços). Em seguida, incubar por 24 horas.
  4. No dia 4 de diferenciação, aspire o médio e substitua pelo meio estágio II (por exemplo, 1 mL por poço de uma placa de 24 poços).
  5. Troque o meio a cada dois dias (substitua o meio no dia 6).
    NOTA: Após 8 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores apropriados de células progenitoras hepáticas, como HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (mínimo 80% de HNF4α necessário para prosseguir).

5. Diferenciação de hepatocitos

  1. Prepare 10 soluções de estoque hepatocyte de μg/mL (HGF), 20 μg/mL Oncostatin (OSM) com DBPS (contendo 0,2% BSA) e filtro com uma membrana de filtro de 0,22 μm.
  2. Preparar o meio básico de diferenciação estágio III (HepatoZYME-SFM) médio suplementado com hidrocortisona 10 μM-21-hemisuccinato e 1x P/S).
  3. Adicione hgf a uma concentração final de 10 ng/mL e OSM a uma concentração final de 20 ng/mL ao volume apropriado do meio de diferenciação pré-aquecido estágio III.
  4. No dia 8 de diferenciação, aspire estágio II médio das células e substitua pelo meio estágio III (por exemplo, 1 mL por poço de uma placa de 24 poços).
  5. Permita que as células incubam por 10 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2, mudando a mídia do Estágio III a cada dois dias com fatores de diferenciação recém-adicionados (Dias 8-18).
    NOTA: Após 18 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores característicos de hepatócitos, como AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. A porcentagem de células albumina-positivas geralmente é superior a 90%.

6. Isolamento do RNA, síntese de CDNA e análise RT-qPCR

  1. Aspirar meio a partir de células e adicionar a quantidade adequada de reagente RNAiso Plus, (por exemplo, 0,3 mL por poço de uma placa de 24 poços). Colete o supernatante em um tubo de 1,5 mL e deixe ficar em RT por 5 minutos.
  2. Adicione 60 μL de reagente de clorofórmio e deixe-o em RT por 5 min. Em seguida, centrífuga a 12.000 x g por 15 min.
  3. Colete o supernatante de 125 μL e transfira-o para outro tubo de centrífuga. Adicione 160 μL de isopropanol, misture bem e fique em RT por 10 minutos.
  4. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min.
  5. Retire o supernascido, adicione 75% de etanol ao precipitado e centrífuga a 7.500 x g por 5 min.
  6. Após a secagem no RT, adicione 40 μL de água tratada com DEPC para dissolver. Para qPCR, transcrever reverso 2 μg de RNA total com um kit de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
  7. Execute o RT-qPCR usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
  8. Normalize a expressão genética em relação às células-tronco não induzidas e determine a variação da dobra após a normalização para GAPDH.

7. Validação de Imunofluorescência de Diferenciação

  1. Prepare 1x tampão de lavagem PBST adicionando 0,1% Tween-20 ao PBS.
  2. Aspirar meio a partir de células aderentes e lavar brevemente com PBS em RT em um shaker.
  3. Aspire PBS e incuba células com 500 μL de metanol gelado por poço de uma placa de 24 poços para fixar as células a -20 °C durante a noite.
  4. Remova o metanol e lave as células 3 vezes com PBS em um shaker por 10 minutos cada vez no RT.
  5. Bloqueie células com 500 μL de 5% de BSA preparadas em PBS para 1-2 h em RT em um shaker.
  6. Diluir o anticorpo primário em 1: 200 na mesma solução usada para o bloqueio.
  7. Incubar as células fixas em uma solução de anticorpos primários de 300 μL durante a noite a 4 °C em um agitador.
  8. Após a incubação durante a noite, lave as células 3 vezes com PBST por 10 minutos cada vez no RT em um shaker.
  9. Prepare a solução de anticorpos secundários na solução de bloqueio às 1:1000.
  10. Incubar em 300 μL de solução de anticorpos secundários protegido da luz por 1 h em RT em um shaker.
  11. Aspirar solução de anticorpos secundários e lavar células 3 vezes com PBST por 10 minutos cada vez em RT em um shaker.
  12. Incubar células com 300 μL de 1 μg/mL DAPI por 3-5 min e, em seguida, lavar duas vezes com PBST.
  13. Após aspirar PBST, adicione uma quantidade apropriada de PBS para tirar fotos sob um microscópio de fluorescência.

8. Análise de manchas ocidentais

  1. Prepare 1x tampão de lavagem TBST adicionando 0,1% Tween-20 à solução salina tamponada por Tris (TBS).
  2. Prepare o buffer de eletroforese SDS-PAGE e o buffer de transferência ocidental usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Resolva a proteína celular total (40 μg) em um gel de poliacrilamida de sulfato de sulfato de sódio de 10% de sódio e execute no tampão de eletroforese SDS-PAGE a 15 mA corrente constante por cerca de 2 h.
  4. Transfira o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilidene (PVDF) a 300 mA de corrente constante por 2 h a baixa temperatura.
    NOTA: O tempo de funcionamento e o tempo de transferência podem variar dependendo do equipamento utilizado e do tipo e porcentagem do gel.
  5. Bloqueie a membrana com 3% de BSA preparado em TBST para 1 h em RT em um shaker.
  6. Incubar em solução de anticorpos primários (diluição de 1:1000) durante a noite a 4 °C em um agitador.
  7. Após a incubação durante a noite, lave a membrana de manchas 3 vezes com TBST por 15 minutos por vez no RT em um shaker.
  8. Incubar em solução de anticorpos secundários (diluição de 1:2000) por 2 h em RT em um shaker.
  9. Descarte a solução de anticorpos secundários e lave a membrana 3 vezes com TBST, por 15 minutos cada vez, no RT em um shaker.
  10. Visualize bandas imunoreativas usando um reagente de chemiluminescência seguido de autoradiografia. Use β-actin como controle de carregamento.

9. Absorção verde da indocianina

  1. Prepare a solução de estoque verde indocyanina de 200 mg/mL em DMSO.
  2. Prepare uma solução de trabalho complementando o estágio III de diferenciação com solução verde indocyanina para uma concentração final de 1 mg/mL.
  3. Incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 1-2 h.
  4. Aspirar médio e lavar as células 3 vezes com PBS.
  5. Fotografia sob um microscópio.

10. Coloração periódica ácido-Schiff (PAS) e coloração de Hemaoxílina-Eosina (H&E)

  1. Aspirar o meio das células aderentes e lavar brevemente duas vezes com PBS.
  2. Para fixação celular, aspire PBS e incubar células com metanol gelado a -20 °C durante a noite.
  3. Visualize o armazenamento de glicogênio por manchas PAS e observe células binucleadas por manchas H & E usando um kit seguindo as instruções do fabricante.
  4. Tire imagens com um microscópio de fluorescência.

11. Ensaio para atividade CYP

  1. Medir a atividade CYP450 usando ensaios baseados em células disponíveis comercialmente (Ensaios P450-Glo) de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Use três repetições independentes para testes. Os dados são representados como a média ± SD.

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Resultados

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O diagrama esquemático da indução de HLC de hESCs e imagens representativas de campo brilhante de cada estágio de diferenciação são mostrados na Figura 1. No Estágio I, Activin A e CHIR99021 foram adicionados por 3 dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. No Estágio II, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por 5 dias. Na Fase III, os hepatócitos precoces amadureceram e se diferenciaram ...

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Discussão

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Aqui, apresentamos um método stepwise que induz os HLCs dos hESCs em três estágios. Na primeira etapa, Activin A e CHIR99021 foram utilizados para diferenciar os hESCs em DE. No segundo estágio, ko-DMEM e DMSO foram usados para diferenciar DE em células progenitoras hepáticas. No terceiro estágio, HZM mais HGF, OSM e hidrólio 21-hemisuccinato de sódio foram usados para continuar a diferenciar células progenitoras hepáticas em HLCs.

As seguintes etapas críticas devem ser levadas em consideração...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 para P.N.S.); a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (N. 2020A1515010054 para P.N.S.), Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (N. No. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoethanolSigmaM7522Para diferenciação de progenitor hepático
488 rotulado cabra contra camundongo IgGZSGB-BIOZF-0512Para IF, segundo anticorpo
488 marcado cabra contra Rabbit IgGZSGB-BIOZF-0516Para IF, segundo anticorpo
AccutaseStem Cell Technologies7920Para passagem celular
Activin ApeproTech120-14EPara a formação definitiva da endoderme
Anti - albumina (ALB)Sigma-AldrichA6684Para SE e WB, anticorpo preliminar
Anti - humano Oct4Abcam Ab19587Para IF, anticorpo preliminar
Anti - α-Fetoprotein (AFP)Sigma-AldrichA8452Para SE e WB, anticorpo preliminar
Anti -SOX17Abcamab224637Para IF, anticorpo primário
Anti-Hepatócito Fator Nuclear 4 alfa (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164Para IF, anticorpo primário
B-27 SuplementoGibco17504-044Para formação definitiva de endoderme
BSABeyotimeST023-200gPara bloqueio celular
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046Para formação definitiva de endoderme
DAPIBeyotimeC1006Para coloração nuclear
DEPC-waterBeyotimeR0021Para dissolução de RNA
DM3189MCEHY-12071Para formação definitiva de endoderme
DMEM / F12Gibco11320-033Para cultura de células
DMSOSigma-AldrichD5879Para diferenciação de progenitor hepático
DPBSGibco14190-144Para cultura de células
GlutaMAXGibco35050-061para diferenciação hepática do progenitor
H& Kit de coloração EBeyotimeC0105Spara H & Coloração E
Fator de crescimento de hepatócitos (HGF)peproTech100-39Para diferenciação de hepatócitos
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021Para diferenciação de hepatócitos
Hidrocortisona-21-hemisuccinatoSigma-AldrichH4881Para diferenciação de hepatócitos
IndocianinaSangon BiotechA606326Para coloração de indocianina
Knock Out DMEMGibco10829-018Para diferenciação de progenitores hepáticos
Knock Out SR Multi-SpeciesGibco A31815-02Para diferenciação de progenitores hepáticos
Matrigel hESC-qualificadoCorning354277Para cultura de células
MEM NeAAGibco11140-050Para diferenciação de progenitores hepáticos
mTesR 5X SuplementoStem Cell Technologies85852Para cultura de células
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851Para cultura de células
Oncostatina (OSM)peproTech300-10Para diferenciação de hepatócitos
P450 - CYP3A4 (Luciferina - PFBE)PromegaV8901Para CYP450 atividade
Kit de coloração PASSolarbioG1281Para coloração PAS
Pen/StrepGibco15140-122Para diferenciação celular
ZSGB-BIO ZB-2305cabra conjugada com peroxidaseWB, segundo anticorpo
Tampão de diluição de anticorpo primário para  Western BlotBeyotimeP0256Para diluição de anticorpos primários
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Para síntese de cDNA
RNAiso PlusTaKaRa9109Para isolamento de RNA
RPMI 1640Gibco11875093Para formação definitiva de endoderme
Leite desnatadoSangon BiotechA600669Para a segunda preparação de anticorpos
A25742Thermo Fisherda mistura mestra verde de SYBRpara a análise
Torin2MCEHY-13002para a formação definitiva do endoderme
WXBB7485Vde TweenSigma-Aldrichpara a preparação de lavagem do amortecedor
IgG de para Científico de de RT-PCR

Referências

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Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

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