Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Células hepatócitas derivadas de células-tronco humanas são úteis na modelagem de doenças e na triagem de medicamentos. Este é um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células funcionais semelhantes a hepatócitos. Um status indiferenciado e a confluência apropriada das células-tronco embrionárias humanas são fundamentais para uma diferenciação bem sucedida das células semelhantes à hepatocita.

Para manutenção de células-tronco, cubra placas estéreis de seis poços tratados com um mililitro de 1X matrigel embrionário humano qualificado por célula-tronco por poço, e armazene-as a quatro graus Celsius durante a noite. Deixe as placas em temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Descongele os HESEs preservados por crio-lírios em um banho de água de 37 graus Celsius por três minutos sem tremer, em seguida, transfira imediatamente as células-tronco pipetando-as em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio mTESR pré-aquecido, 37 graus Celsius.

Centrifugar os HESEs e aspirar o supernasce, em seguida, suspender suavemente as células em um mililitro de mTESR médio. Aspire o meio DMEM F-12 da placa. Semear as células em uma placa de seis poços a uma densidade de 1 x 10 para a 5ª células em dois mililitros de mTESR, e incubar em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%.

Mantenha as células substituindo o meio por meio mTESR pré-aquecido diariamente. Passagem das células em cerca de 70 a 80% de confluência, ou quando as colônias celulares começam a fazer contato. Para a passagem de células, aspire o meio e incuba as células com um mililitro por poço de solução enzimápica por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Transfira as células pipetando-as para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo quatro mililitros de DMEM F-12 pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Prepare placas de 24 poços revestindo-as com 250 microliters de 1X hESC-qualificados meio Matrigel. Seed hESCs a uma densidade de 1 a 1,5 vezes 10 para a 5ª células por poço em 500 microliters de mTESR médio.

Adicione a ativação A a uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro e CHIR99021 a uma concentração final de três micromolares em um volume apropriado de meio básico de diferenciação pré-aquecido. Após três dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores de células de endoderme definitivas, como FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 e FOXA1. No terceiro dia de diferenciação, aspire o meio, substitua-o pela fase dois média, e incuba por 24 horas.

Troque o meio a cada dois dias nos dias quatro a oito. Após oito dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores apropriados de células progenitoras hepáticas, como HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. No oitavo dia, aspire o estágio dois médio das células, e substitua-o por meio estágio três.

Permita que as células incubam por 10 dias a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, e mude a mídia a cada dois dias com fatores de diferenciação recém-adicionados. Após 18 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores característicos de hepatócitos, como AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. O diagrama esquemático de células semelhantes a hepatócitos de hESCs e imagens de campo brilhantes de cada estágio de diferenciação são mostrados.

Na primeira fase, a ativação A e CHIR99021 foram adicionadas por três dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. Na segunda fase, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por cinco dias. Na terceira etapa, após 10 dias, os hepatócitos precoces amadureceram e se diferenciaram em células semelhantes a hepatócitos no fator de crescimento hepatocito e na oncostatina.

Na fase final de diferenciação, as células apresentaram um fenótipo típico de hepatócito. RT-PCR, coloração de imunofluorescência e manchas ocidentais foram usados para detectar marcadores de células de endoderme, células precursoras hepáticas e hepatócitos maduros. As células diferenciadas apresentaram altos níveis de expressão de genes e proteínas relacionados à diferenciação em cada estágio, como marcadores de endoderme SOX17 no terceiro dia, marcador precursor hepático HNF4 alfa no oitavo dia, AFP no dia 14, e marcador hepatocito maduro ALB no dia 18.

Os HLCs apresentaram coloração verde e extensa coloração de mudança de ácido citoplasmósmico. Os hepatócitos mostraram morfologia binucleada típica. A atividade enzimática do CYP3A4, o CYP metabólico essencial no fígado em HLCs, foi confirmada com um ensaio enzimático.

O siting de células-tronco embrionárias humanas em uma densidade apropriada e a diferenciação inicial na data seguinte são críticos. No estágio um, toque a mídia suavemente porque as células são propensas a flutuar para cima. A combinação de ativação A e outras pequenas moléculas pode melhorar ainda mais a eficiência de diferenciação, e produzir células mais maduras semelhantes ao hepatocitado neste procedimento.

Essa técnica pode fornecer uma plataforma para explorar transplante de hepatocita, engenharia de tecidos hepáticos, fígados bioartificial e modelagem de doenças.