Artigo de método

Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

DOI:

10.3791/62655

⸱

30 de maio de 2021

 , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Neste artigo

Resumo

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O aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas de molécula única é um sensor de proximidade espectroscópico de fluorescência útil sensível às mudanças estruturais locais nas proteínas. Aqui mostramos que pode ser usado para descobrir conformações locais estáveis em α-Synuclein, que também é conhecida como globularmente desestruturada e instável quando medida usando a régua FRET de longo alcance.

Resumo

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O uso de réguas espectroscópicas para rastrear múltiplas conformações de biomoléculas únicas e sua dinâmica revolucionou a compreensão da dinâmica estrutural e suas contribuições para a biologia. Enquanto a régua baseada em FRET relata distâncias inter-corantes na faixa de 3-10 nm, outras técnicas espectroscópicas, como o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE), relatam a proximidade entre um corante e uma superfície proteica na faixa mais curta de 0-3 nm. Independentemente do método de escolha, seu uso na medição de biomoléculas livremente difusas uma de cada vez recupera histogramas do parâmetro experimental produzindo subpopulgãs separadas distribuídas centralmente de biomoléculas, onde cada subpopo representa uma única conformação que permaneceu inalterada dentro de milissegundos, ou múltiplas conformações que intervertem muito mais rápido do que milissegundos, e, portanto, uma subpopoização média. Em fret de molécula única, onde o parâmetro relatado em histogramas é a eficiência fret inter-tingitária, uma proteína intrinsecamente desordenada, como o monômero α-Synucleína em buffer, foi previamente relatado como exibindo uma única subpopução média de múltiplas conformações interconverting rapidamente. Embora esses achados passados dependam da faixa de 3-10 nm da régua baseada em FRET, procuramos colocar essa proteína à prova usando pife de molécula única, onde rastreamos a vida de fluorescência de proteínas de α-sinucleína rotuladas no local uma de cada vez. Curiosamente, usando este sensor de proximidade espectroscópica de curto alcance, α-Synuclein com a marca Synuclein, com uma gama de tamanhos largos, exibe várias subpoporas vitalícias com vidas médias distintas que interconvertem em 10-100 ms. Esses resultados mostram que, embora α-Sinucleína possa ser desordenada globalmente, ela atinge estruturas locais estáveis. Em resumo, neste trabalho destacamos a vantagem de usar diferentes sensores de proximidade espectroscópicas que rastreiam mudanças estruturais locais ou globais uma biomolécula de cada vez.

Introdução

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Nas últimas duas décadas, os métodos baseados em fluorescência de moléculas únicas tornaram-se uma poderosa ferramenta para medir biomoléculas1,2, sondando como diferentes parâmetros biomoleculares se distribuem, bem como como eles interconvertem dinamicamente entre diferentes subpopulgências desses parâmetros na resolução sub-milissegundo3,4,5. Os parâmetros nestas técnicas incluem a eficiência da transferência de energia nas medições de FRET 6,7, anisotropia de fluorescência8,9, rendimentos quânticos de fluorescência e vidas10,11, em função de diferentes mecanismos de fluorescência que saciem12 ou aprimoramento13 mecanismos. Um desses mecanismos, mais conhecido como aumento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE)14 introduz o aprimoramento do rendimento quântico da fluorescência e da vida como uma função da obstrução estérica à isomerização livre do fluorohore quando em estado animado, causado por superfícies proteicas nas proximidades do corante14,15,16,17,18,19 . Tanto o FRET quanto o PIFE são considerados governantes espectroscópicos ou sensores de proximidade, uma vez que seu parâmetro medido está diretamente ligado a uma medida espacial dentro da biomolécula rotulada sob medição. Enquanto a eficiência do FRET está relacionada à distância entre um par de corantes dentro de uma faixa de 3-10 nm20,o PIFE rastreia aumentos nos rendimentos quânticos da fluorescência ou vidas relacionadas à distância entre o corante e uma superfície de uma proteína próxima na faixa de 0-3 nm19.

O FRET de molécula única tem sido amplamente utilizado para fornecer insights estruturais em muitos sistemas proteicos diferentes, incluindo proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs)21, como α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn pode formar estruturas ordenadas seguindo a ligação a diferentes biomoléculas e em diferentes condições23,24,25,26,27,28,29,30. No entanto, quando desvinculado, o monômero α-Syn é caracterizado por alta heterogeneidade conformacional com conformações rapidamente interconversas31,32.

As conformações de α-Syn têm sido estudadas anteriormente utilizando-se de diversas técnicas diferentes que ajudam na identificação da dinâmica conformacional de sistemas tão heterogêneos e dinâmicos33,34,35,36,37,38,39. Curiosamente, as medições de FRET (smFRET) de molécula única de α-Syn no buffer relataram uma única população de FRET39,40 que é um resultado da média de tempo de conformações interconvertidas dinamicamente às vezes muito mais rápido do que o tempo típico de difusão de α-Syn através do ponto confocal (vezes tão rápido quanto poucos microssegundos e ainda mais rápido do que isso, em relação aos tempos típicos de difusão de milissegundos)40, 41. No entanto, o uso de uma régua espectroscópica FRET com a sensibilidade à distância de 3-10 nm às vezes relata apenas mudanças estruturais globais em uma pequena proteína, como α-Syn. Medições de molécula única utilizando sensores de proximidade espectroscópicos com sensibilidades de distância mais curta têm o potencial de relatar a dinâmica das estruturas locais. Aqui realizamos medições pife de molécula única de α-Syn e identificamos diferentes subsu populações de vida fluorescência mapeando para diferentes estruturas locais com transições entre elas tão lentas quanto 100 ms. Este trabalho resume as medidas smPIFE resolvidas pelo tempo de moléculas α-Syn livremente difundidas uma de cada vez, em buffer e quando ligadas a membranas baseadas em SDS como um sensor de proximidade espectroscópico de molécula única de curto alcance.

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Protocolo

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1. Transformação plasmida

  1. Preparação de 0,5 L de meio SOC
    1. Pesar 10 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura, 0,25 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,1 g de cloreto de potássio (CTI).
    2. Adicione água duplamente destilada (DDW) até o volume total de 0,5 L.
    3. Ajuste ao pH 7 adicionando hidróxido de sódio (NaOH).
    4. Prepare alíquotas de estoque de 100 mL e autoclave.
    5. Antes de usar, adicione 0,5 mL de cloreto de magnésio estéril (TM2) e 1,8 mL de glicose estéril a 100 mL de SOC.
  2. Descongelar células Escherichia coli competentes no gelo.
  3. Misture as células competentes suavemente.
  4. Prepare dois tubos de 15 mL. Rotule um como tubo de reação de transformação e o outro como o tubo de controle.
  5. Alíquota de 100 μL de células competentes nos tubos.
  6. Adicione 1 μL de plasmídeo a uma concentração de 0,1 ng/μL no tubo de reação de transformação.
  7. Aqueça o meio SOC em banho-maria de 42 °C para uso na etapa 1.8.
  8. Pulso de calor os dois tubos em banho-maria de 42 °C por uma duração de 45 segundos. (Passo crítico!)
  9. Adicione 900 μL de soc aquecido médio a cada tubo.
  10. Incubar os tubos a 37 °C por uma duração de 45 minutos com agitação a uma velocidade de 225 rpm.
  11. Espalhe 200 μL das células com o plasmídeo transformado em uma placa de ágar LB (Luria-Bertani)-ágar contendo 100 μg/mL ampicillin, usando um espalhador de células estéril.
  12. Espalhe 200 μL das células com o plasmídeo transformado em uma placa LB-ágar sem ampicilina, utilizando um espalhador estéril (controle positivo).
  13. Espalhe 200 μL das células de controle (não contendo um plasmídeo) em uma placa LB-ágar contendo 100 μg/mL ampicillin, utilizando um espalhador estéril(controle negativo).
  14. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.

2. Preparação de proteínas

  1. Expressão e purificação de α-sinucleína recombinante
    1. Escolha uma única colônia e cresça em 100 mL de meio líquido LB autoclaved (Luria-Bertani) contendo 100 μg/mL ampicillin a 37 °C (entrada).
    2. Prepare quatro frascos 2 L Erlenmeyer, cada um contendo 1 L de meio LB autoclavado e 100 μg/mL ampicillin (grande inoculação).
    3. Meça a densidade óptica (OD a λ = 600 nm) da solução celular. Quando a densidade celular da partida atingir um ODλ=600nm de 0,6-0,7, adicione 10 mL de solução inicial por cada 1 L de meio LB preparado na etapa anterior.
    4. Cresça os meios bacterianos em um agitador de incubadora a 37 °C e uma velocidade de 200 rpm.
    5. Quando a densidade celular atingir um ODλ=600nm de 0,6-0,8, induza a expressão proteica adicionando isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) por cada 1 L de meio de crescimento a uma concentração final de 1 mM.
      NOTA: Dissolva 0,96 g de IPTG em 4 mL de DDW e adicione 1 mL da solução IPTG resultante por cada 1 L de crescimento bacteriano.
    6. Cresça as células por uma duração de 4 horas e colete-as por centrifugação em tubos de 50 mL a uma velocidade de 5.170 x g por uma duração de 8 minutos.
      NOTA: Em cada rodada, descarte o supernasal, mantenha a pelota e encha novamente os mesmos tubos com crescimento bacteriano.
    7. Armazene a pelota bacteriana no armazenamento de congelamento profundo (por exemplo, -80 °C) para o dia seguinte.
    8. No dia seguinte, prepare 200 mL de tampão de lise: 40% (w/v) sacarose e tampão A, que inclui 30 mM Tris-HCl, 2 mM de ácido trienediaminetetraacético de 2 mM (EDTA), dithiothreitol (DTT) em pH 8.0.
    9. Adicione 25 mL de tampão de lise a cada tubo com pelota bacteriana.
    10. Suspenda-a dem boleira (use pipetas pasteur de plástico estérei) no tampão de Lysis (ver 2.1.8).
    11. Prepare o frasco estéril de 250 mL Erlenmeyer com um ímã de agitação no gelo.
    12. Adicione 5 mL de tampão de lise e, em seguida, transfira as células homogêneas re-suspensas para ele.
    13. Mexa as células por uma duração de 20 minutos a 200 rpm a temperatura ambiente.
    14. Divida a solução em tubos de 50 mL e centrífuga a 4 °C por uma duração de 30 minutos a uma velocidade de 17.400 x g.
    15. Descarte o supernatante.
    16. Prepare o frasco estéril de 250 mL Erlenmeyer com ímã de agitação no gelo.
    17. Adicione 15 mL de tampão de dissolução (90 mL tampão resfriado A e 37 μL de MgCl2 dissolvido além do limite de solubilidade e filtrado) em cada tubo. Use pipetas pasteur de plástico estéreis e dissolva a pelota.
    18. Quando parte da solução se tornar homogênea, mova-a para um frasco de Erlenmeyer agitado no gelo.
    19. Determine o volume da solução no Erlenmeyer.
    20. Adicione 10 mg de sulfato de estreptomicina por cada 1 mL de solução (antes de adicionar, dissolva sulfato de estreptomicina em 2 mL de tampão A).
      NOTA: Este passo é realizado a fim de remover o DNA e ribossomos afastados.
    21. Mexa a solução por uma duração de 10-20 minutos em temperatura ambiente.
    22. Divida a solução em tubos de 50 mL e centrífuga a 4 °C e a uma velocidade de 20.700 x g por uma duração de 30 minutos.
    23. Pegue o supernatante e descarte a pelota.
    24. Prepare um frasco estéril de 250 mL Erlenmeyer no gelo com um agitador.
    25. Filtre o supernatante usando filtro de seringa de 0,22 μm no frasco erlenmeyer limpo.
    26. Determine o volume da solução e pese 0,3 g de sulfato de amônio por cada 1 mL de solução.
    27. Aos poucos, adicione o sulfato de amônio à solução agitada.
      NOTA: Este passo é realizado para precipitar proteínas. Quando o sulfato de amônio liga as proteínas, a solução fica obscurecida e embaçada, que aparece como cor branca.
    28. Mexa por 30 minutos em temperatura ambiente.
    29. Divida a solução em tubos de 50 mL e centrífuga a 4 °C e a uma velocidade de 20.700 g por uma duração de 30 minutos.
    30. Descarte cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota.
    31. Dissolva a pelota com 20 mL de Buffer A.
    32. Unifique todas as soluções em um tubo e, em seguida, meça o espectro de absorção UV da solução.
      NOTA: Se o espectro mostrar uma assinatura de agregação (absorção acima de um comprimento de onda de 300 nm), continue para o próximo passo. Se não, pule o próximo passo e passe para a etapa 2.1.34.
      NOTA: O índice de agregação (A.I.) calculado a partir do espectro UV como ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Use tubos centriprep de corte de 100 kDa e centrífuga a uma velocidade de 3.590 x g a 4 °C por uma duração de 15 minutos. Recolhe o líquido que passou pelo filtro.
    34. Dilisar a solução a 4 °C durante a noite, contra buffer A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa.
    35. Realize outra rodada de diálise por uma duração de pelo menos 4 horas.
    36. Carregue a amostra dialisada em uma coluna de troca de 1 mL MonoQ. Use tampão de hidrocloreto Tris (Tris-HCl) de 30 mM no pH 7.5 como tampão de lavagem e 30 mM Tris-HCl tampão pH 7.5 com 500 mM NaCl como um tampão de eluição.
    37. Injete a amostra na coluna. Em seguida, lave com 20 volumes de coluna (CVs) de 0% tampão de eluição e tampão de lavagem de 100% para remover as proteínas não ligadas.
    38. Lave com 7 CVs de 30% de tampão de eluição.
    39. Elute a amostra de proteína α-Syn usando um gradiente que muda de 30% para 100% tampão de elução para 30 CVs, a uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min.
      NOTA: α-Syn elutes em 46-66 CVs na condutividade 20-24 mS/cm, que se refere a 38-50% de tampão de elução.
    40. Colete as frações do pico de eluição principal. Verifique a presença de α-Syn executando amostras em eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio de sódio de 15% de sódio (SDS-PAGE), seguindo a coloração com a solução de coloração Coomassie Blue ou Fast SeeBand. Uma banda a 15 kDa é esperada.
    41. Unifique as frações relevantes e diálise-as durante a noite, contra o tampão A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa a 4 °C.
    42. Prepare as alíquotas da amostra de proteína e armazene-as a -20 °C.
  2. Α-Synucleína com rótulo Cy3
    1. Reduza o thiol do resíduo de cisteína no mutante α-Syn A56C adicionando DTT a uma concentração final de 2 mM por uma duração de 1 hora à temperatura ambiente.
    2. Remova o DTT realizando duas rodadas de diálise usando sacos de diálise de corte de 3,5 kDa. Para a primeira rodada, dialyze contra 30 mM Tris-HCl pH 8.0 e 2 mM EDTA. Para a segunda rodada, dilímita contra 50 mM HEPES pH 7.2 e 2 mM EDTA.
    3. Reduza os resíduos de cisteína adicionando tris (2 carboxyethyl)hidrocloreto de fosfina (TCEP) à amostra de proteína, a uma concentração final de 50 μM por uma duração de 30 minutos à temperatura ambiente.
      NOTA: O TCEP é um agente redutor de não-sulfhydryl, portanto mantém os grupos de tiol reduzidos sem reagir com o corante. Adicionamos 0,5 μL de uma solução de estoque de 1 M TCEP.
    4. Calcule as quantidades de proteína necessárias para o volume final de reação de 1 mL.
      NOTA: Aqui está um exemplo para o cálculo que usamos:
      20 μM concentração final de proteína × volume final de 1 mL = 56 μM concentração inicial de proteína × v proteína a ser adicionada
    5. Calcule a quantidade de corante necessária para o volume final de reação de 1 mL. A rotulagem de tingimento de uma única cisteína deve ser realizada com excesso de corante, em uma razão de molar de corante:proteína de pelo menos 3:1.
      NOTA: Um exemplo para o cálculo que usamos:
      60 μM concentração final de corante × volume final de 1 mL = 370 μM concentração inicial de corante × V corante a ser adicionado
    6. Calcule a quantidade de tampão do dialise necessário para ajustar o volume total de reação para 1 mL.
      NOTA: Exemplo de cálculo: 1 mL - (V calculado a partir da etapa 2.2.4 + V calculado a partir da etapa 2.2.5)
    7. Prepare o frasco de reação com um ímã em cima de um agitador.
    8. Em primeiro lugar, adicione a quantidade calculada da proteína e do tampão. Posteriormente, adicione a quantidade calculada do corante (sulfo-cy3 maleimida).
    9. Mantenha a reação à temperatura ambiente no escuro por uma duração de 3-5 horas.
    10. Termine a reação adicionando 2 mM DTT e continue por uma duração de 1 hora.
    11. Realize três rodadas de diálise contra buffer A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa para remover o corante livre de excesso da solução.
    12. Carregue a amostra em uma coluna de exclusão de tamanho para separar ainda mais o α-Syn rotulado do corante livre.
    13. Determine a concentração de α-Syn puramente rotulado medindo a absorção do corante (o coeficiente de absorção para sulfo-Cy3 é de 162.000 M-1cm-1em λ=548 nm).
    14. Se necessário, concentre a solução α-Syn puramente rotulada usando um concentrador de vácuo (por exemplo, SpeedVac). Em seguida, realize uma rodada de diálise contra o tampão A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa e determine novamente a concentração da proteína rotulada.
    15. Prepare as alíquotas da amostra de proteína rotulada e armazene-as a -20 °C.

3. Medições

  1. configuração experimental smPIFE
    NOTA: Use a seguinte configuração baseada em confocal ou similar.
    1. Use uma fonte de laser pulsada (no nosso caso, λ= 532 nm picosegundo laser pulsado com largura de pulso de ~100 ps FWHM), operando a uma taxa de repetição adequada (20 MHz em nosso caso) e encaminhado para o SYNC de uma placa de contagem de fótons único correlacionada por tempo (TCSPC), como a fonte de excitação sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Use um espelhodicróico com alta reflexividade a 532 nm, para separar a excitação e a dispersão da fluorescência.
    3. Use um pinhole de 100 μm de diâmetro no foco da luz emitida, depois que o feixe de emissão colidido foi focado por uma lente, e antes que o feixe de emissão tenha sido re-colidido por outra lente.
    4. Use um filtro de passe de banda (585/40 nm em nosso caso) para filtrar ainda mais a fluorescência sCy3 de outras fontes de luz.
    5. Detecte a fluorescência usando um detector (diodo de avalanche de fótons ou fotomultiplier híbrido, no nosso caso) encaminhado (através de um roteador 4-para-1, no nosso caso) para um módulo TCSPC (Becker & Hickl SPC-150, no nosso caso).
      NOTA: No nosso caso, a aquisição de dados é realizada através do software VistaVision (ISSTM)no formato de arquivo TTTR (Time-Tagged-Time- Resolved).
  2. preparação da amostra smPIFE
    1. Prepare 25 pM sCy3-labeled α-Syn em tampão de medição: 10 mM acetato de sódio, Fosfato de dihidrogênio de sódio de 10 mM, 10 mM de glicina pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM de cisteamina e 1 mM 6-hidroxi-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxílico ácido TROLOX, em um tubo de ligação de proteína baixa.
      NOTA: Se α-Syn for medido na presença de vesículas SDS, adicione também a quantidade SDS apropriada.
    2. Enxágüe um slide de deslizamento de microscopia de 18 câmaras com 100 μL de 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) por uma duração de 1 minuto e, em seguida, remova o BSA.
    3. Adicione 100 μL da amostra de α-Syn de 25 pM rotulada por SCy3 a uma câmara no slide de deslizamento de tampa.
    4. Realize a medição smPIFE da amostra usando a configuração descrita, conforme segue nos próximos passos.
  3. aquisição de dados smPIFE
    1. Use uma lente objetiva de imersão de água de alta abertura numérica (no nosso caso, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2), e adicione uma gota de água ultra-pura em cima da lente objetiva.
    2. Corrija o slide do deslizamento de tampas em uma câmara de palco e instale-o em cima do estágio do microscópio.
    3. Leve a lente objetiva para cima, até que a gota d'água em cima da lente objetiva manche na parte inferior do slide da tampa.
    4. Abra o obturador a laser e leve a lente objetiva para cima, enquanto inspeciona o padrão em uma câmera CMOS, coletando luz espalhada da amostra. Observe o padrão dos anéis arejados: o primeiro representa o foco na interface água-vidro e, em seguida, o segundo representa o foco na interface entre o vidro e a solução de amostra.
    5. Aumente a altura da lente objetiva em mais 75 μm, trazendo o foco do laser profundamente para dentro da solução, para minimizar a auto-fluorescência da superfície de vidro do deslizamento de tampas.
    6. Sintonize a potência do laser na lente objetiva para ser ~100 μW.
    7. Inicie a aquisição de fótons detectados por um tempo predefinido (2 horas, em nossas medições).
      NOTA: A maioria do sinal de aquisição deve ter uma taxa (medida em contagens por segundo, cps) semelhante à adquirida ao medir apenas o buffer; os dados de milissegundos binned devem mostrar eventos escassos de explosão de fótons, com a maioria das lixeiras tendo uma taxa média comparável à taxa de fundo típica do detector (<1.000 cps, no nosso caso).

4. análise de estouro smPIFE

  1. Conversão de dados brutos
    NOTA: Os dados geralmente são armazenados em um arquivo binário com um formato que foi predefinido pela empresa que fabrica o cartão TCSPC (.arquivos spc em nosso caso).
    1. Converta o arquivo de dados brutos para o formato de arquivo universal fóton-HDF542, usando o phconvert do pacote de software (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Chame o arquivo de dados brutos como uma entrada e converta em um arquivo de dados brutos .hdf5 usando o código apropriado no conjunto phconvert (os arquivos Convert ns-ALEX Becker-Hickl para o notebook Photon-HDF5.ipynb Jupyter, no nosso caso).
      NOTA: A conversão em um arquivo .hdf5 inclui: (1) determinar os fluxos de fótons relevantes nos dados brutos (ou seja, fluxos de fótons de fótons registrados do ID do detector relevante); (2) os nanotimes de fótons relevantes (os tempos de detecção de fótons relativos ao tempo de sincronização da excitação); e (3) adicionados metadados.
  2. Pesquisa e seleção de estouro usando FRETbursts43
    NOTA: Todos os arquivos de dados brutos fóton-HDF5 das medições smPIFE, bem como o código que resume a análise dos dados brutos, são armazenados no Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Todas as etapas abaixo são detalhadas e mostradas dentro dos notebooks Jupyter, também fornecidos no link do repositório Zenodo.
    1. Abra os Cadernos jupyter (dentro do quadro Anaconda, no nosso caso).
    2. Abra o notebook smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (notebook final).ipynb (ele pode ser encontrado no link Zenodo).
    3. Carregar fretburs.
    4. Carregue o arquivo de dados HDF5 do fóton.
    5. Avaliação da taxa BG: usando o histograma dos tempos interfótons, calcule as taxas de fundo (BG) para cada 30 segundos de aquisição de dados no arquivo de dados HDF5 do fóton.
      NOTA: As seguintes etapas descrevem a pesquisa de estouro usando o algoritmo da janela deslizante44,45,46.
    6. Mova uma janela de tempo de m=20 fótons consecutivos, um fóton de cada vez.
    7. Coletar os dados de fótons somente se a taxa de fótons instantâneos, ( figure-protocol-1 ), for pelo menos F=11 vezes maior do que a taxa BG para esse período da aquisição de dados.
      NOTA: Uma explosão é construída a partir de todos os fótons consecutivos que foram coletados deslizando o fóton da janela de cada vez (passo 4.2.6.) e concordando com o critério de taxa de fótons (etapa 4.2.7).
    8. Calcule as seguintes características de estouro:
      Tamanho da explosão: a quantidade de fótons em uma explosão.
      Duração do estouro: a diferença de tempo entre o último e o primeiro tempo de detecção de fótons em uma explosão.
      Brilho de explosão: o maior valor da taxa de fótons instantâneos em uma explosão.
      Separação de explosão: o intervalo de tempo entre rajadas consecutivas.
      NOTA: Os seguintes pontos descrevem o novo procedimento de seleção de estouro.
    9. Plote o histograma dos valores de brilho de explosão (a maior taxa de fótons instantâneos em uma explosão), com o eixo dos eventos em escala logarítmica.
    10. Defina o limiar de brilho da explosão como o valor mínimo de brilho da explosão a partir do qual o histograma exibe um padrão em decomposição.
    11. Selecione rajadas com valores de brilho maiores do que o limiar de brilho da explosão.
      NOTA: Os próximos passos descrevem a explosão significa vida útil da fluorescência.
    12. Plote o histograma de nanovezess de fótons para todos os fótons em todas as rajadas selecionadas com o eixo de contagem de fótons em escala logarítmica.
    13. Defina o limiar de nanotime como o valor mínimo de nanotime a partir do qual o histograma de nanovezes fótons exibe um padrão decadente.
    14. Selecione apenas fótons com nanovezes maiores que o limiar de nanotime.
    15. Calcule a média algébrica de todos os nanovezes de fótons selecionados.
    16. Subtraia o limiar de nanotime da média algébrica de nanovezes do fóton. O resultado é o nanotime de fótons da explosão, que é diretamente proporcional à vida de fluorescência média.
    17. Traçar o histograma de todas as vidas de fluorescência. Sub-populações distribuídas centralmente de vida fluorescência podem aparecer. Sub-populações com médias de baixo valor representam espécies de moléculas com sCy3 que não foi esticamente obstruída, enquanto sub-populações com médias de valor mais altas representam espécies de moléculas com sCy3 que foi mais obstruída esticamente.
      NOTA: Os próximos passos descrevem dinâmica lenta entre rajadas com base na análise de recorrênciade rajadas 47
    18. Plote o histograma dos tempos de separação de rajadas, com o eixo do tempo de separação em escala logarítmica.
      NOTA: Duas subsumes de tempos de separação de rajadas aparecerão:
      Uma sub-população importante com tempos de separação de segundos, representando explosões consecutivas originárias de diferentes moléculas consecutivas.
      Uma subsu população menor com tempos de separação ~<100 ms, representando rajadas consecutivas ambas originárias da mesma molécula, recorrentes de volta através do volume confocal.
    19. Selecione para salvar todos os pares de rajadas consecutivas que são separados por menos de um tempo máximo de separação que define a subsu população da mesma molécula (<100 ms, no nosso caso).
    20. Traçar um histograma ou um gráfico de dispersão das vidas médias de fluorescência da primeira e segunda rajadas para todos os pares de rajadas que se repetiram abaixo de um certo limiar de tempo de separação

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Resultados

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Como IDP, quando não está vinculado a outra biomolécula, α-Syn exibe dinâmicas estruturais entre múltiplas conformações, com transições em poucos microssegundos40 e até mesmo em centenas de nanossegundos41. Quando α-Syn cruza o ponto confocal, ele pode passar por milhares de transições entre as conformações. De fato, este foi o caso quando o smFRET foi usado39,40. Aqui realizamos medições smPIFE para sondar a dinâmi...

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Discussão

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Foram realizados extensos estudos bioquímicos e biofísicos para o estudo das características estruturais de α-Syn e sua natureza desordenada33,34,35,36,37,38. Vários trabalhos já utilizaram o smFRET de difusão livre para investigar a dinâmica intra-molecular do monômero α-Syn livre de vinculação. Esses trabalhos relataram a a...

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Divulgações

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Todos os autores não compartilham conflito de interesses.

Agradecimentos

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O pT-t7 codificando o mutante A56C α-Syn foi dado a nós como presente do Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir e Dr. Elisha Haas. Este artigo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, conceder R01 GM130942 à E.L. como subaward), pela Israel Science Foundation (conceder 3565/20 dentro do KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), o Milner Fund e a Universidade Hebraica de Jerusalém (fundos de startup).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15MercC7715corte: 100 kDa
sulfato de amônioSigma-AldrichA4418
BSASigma-AldrichA9647
cisteaminaBolsas de diálise Sigma-Aldrich30070
- MEGA GeBaFlex-tubeGene Bio-ApplicationMEGA320
ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Solução de coloração Fast SeeBandGene Bio-ApplicationSB050
GlicinaSigma-Aldrich50046
D-GlicoseSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-Aldrich54457
HiTrap Dessalinização 5 mLSigma-AldrichGE17-1408
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico (TROLOX)Sigma-Aldrich238813
isopropil β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Sigma-AldrichI5502
LB caldoSigma-AldrichL3152
Magnésio cloretoSigma-Aldrich63068
MonoQ colunaSigma-Aldrich54807
proteína Tubo LoBindSigma-AldrichEP00301080940,5 mL
Enxágue uma µ-lâmina 18Ibidi81816
SDSSigma-Aldrich75746
Acetato de sódioSigma-AldrichS2889
Hidróxido de sódioSigma-AldrichS8045
Fosfato de sódio monobásico monohidratadoSigma-Aldrich71507
Espalhadores de células estéreis, espátulas Drigalskimini-plast815-004-05-001
sulfato de estreptomicinaSigma-AldrichS9137
sulfo-Cy3  maleimidaabcamab146493
Cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)Sigma-Aldrich75259
Tris-HClSigma-Aldrich93363
TriptonaSigma-AldrichT7293
Extrato de leveduraSigma-AldrichY1625

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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