Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

Yuhong Wang

doi:10.3791/62664

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Artigo de método

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

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DOI:

10.3791/62664

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6 de julho de 2021

Yuhong Wang¹

¹Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Neste artigo

Resumo

Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e intermediários-chave de baixa população, que não são acessíveis por métodos convencionais de conjunto devido ao efeito médio.

Resumo

O ribossomo é um grande complexo de ribonucleoproteína que reúne proteínas processivamente ao longo de modelos de mRNA. O diâmetro do ribossomo é de aproximadamente 20 nm para acomodar substratos de tRNA grandes nos locais A, P e E. Consequentemente, a dinâmica ribossoma é naturalmente desagum rapidamente. O método de molécula única pode detectar cada ribossomo separadamente e distinguir populações inhomogêneas, o que é essencial para revelar os complicados mecanismos dos sistemas multicomponimentos. Relatamos os detalhes de um método smFRET baseado no microscópio invertido Nikon Ti2 para sondar a dinâmica ribossômica entre a proteína ribossômica L27 e tRNAs. O L27 é rotulado em sua posição cys 53 única e reconstituído em um ribossomo que é projetado para falta de L27. O tRNA é rotulado em sua região do cotovelo. À medida que o tRNA se move para diferentes locais dentro do ribossomo durante o ciclo de alongamento, como a pré e pós-translocação, as eficiências e dinâmicas do FRET apresentam diferenças, que sugeriram múltiplas subpopulações. Essas subpopulações não são detectáveis por métodos de conjunto. O microscópio smFRET baseado em TIRF é construído sobre um microscópio invertido manual ou motorizado, com iluminação laser construída em casa. As amostras de ribossomo são purificadas por ultracentrifugação, carregadas em uma célula de amostra multicanal construída em casa e depois iluminadas através de um campo laser evanescente. O ponto laser de reflexão pode ser usado para alcançar o controle de feedback do foco perfeito. Os sinais de fluorescência são separados por uma torre de filtro motorizada e coletados por duas câmeras CMOS digitais. As intensidades são recuperadas através do software NIS-Elements.

Introdução

O ribossomo é um complexo de ribonucleoproteína de 20 nm de grande porte de uma subunidade grande (50S) e uma pequena (30S). Ele monta peptídeos longos ao longo do modelo mRNA de forma processiva e cooperativa. O ribossomo 30S se liga ao fMet-tRNA^fMet e mRNA para iniciar a síntese proteica, e o 50S então se junta para formar o complexo de iniciação 70S. Os tRNAs trazem aminoácidos para o ribossomo no local A (local de ligação aminoacyl-tRNA), enquanto a cadeia de peptidyl alongada é mantida no local P (peptidyl-tRNA binding site). No complexo de pré-translocação, a cadeia de peptidyl é transferida para o tRNA no local A com um aminoácido adicionado. Enquant....