É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Crescimento, Purificação e Titulação do Vírus Herpes Simplex Oncolítico

7.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/62677

⸱

13 de maio de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Jerry H. Hodge School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Molecular Neurosurgery Laboratory and the Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste manuscrito, descrevemos um método simples de crescimento, purificação e titulação do vírus herpes simplex oncolítico para uso pré-clínico.

Resumo

Os vírus oncolíticos (OVs), como o vírus herpes simplex oncolítico (oHSV), são uma estratégia de tratamento em rápido crescimento no campo da imunoterapia contra o câncer. Os OVs, incluindo oHSV, replicam-se seletivamente e matam células cancerígenas (poupando células saudáveis/normais) ao induzir a imunidade anti-tumor. Devido a essas propriedades únicas, as estratégias de tratamento baseadas em oHSV estão sendo cada vez mais utilizadas para o tratamento do câncer, preclinicamente e clinicamente, incluindo talimogene laherparevec aprovado pela FDA (T-Vec). Crescimento, purificação e titulação são três técnicas essenciais de laboratório para quaisquer OVs, incluindo oHSVs, antes que possam ser utilizados para estudos experimentais. Este artigo descreve um método simples passo a passo para amplificar oHSV em células Vero. À medida que os OHSVs se multiplicam, eles produzem um efeito citopático (CPE) nas células Vero. Uma vez que 90-100% das células infectadas apresentam um CPE, elas são colhidas suavemente, tratadas com cloreto de benzonase e magnésio (TMN2),filtradas e submetidas à purificação usando o método de suênula-gradiente. Após a purificação, o número de oHSV infecciosos (designados como unidades formadoras de placas ou PFUs) é determinado por um "ensaio de placa" em células Vero. O protocolo aqui descrito pode ser usado para preparar estoque de oHSV de alta titulação para estudos in vitro na cultura celular e experimentos in vivo em animais.

Introdução

Os vírus oncolíticos (OVs) são uma forma emergente e única de imunoterapia contra o câncer. Os OVs replicam-se seletivamente em células tumorais e lises (poupando células normais/saudáveis)1 ao induzir imunidade anti-tumor2. O vírus herpes simplex oncolítico (oHSV) é um dos vírus mais estudados entre todos os OVs. É mais distante na clínica, com Talimogene laherparepvec (T-VEC) sendo o primeiro e único OV a receber aprovação da FDA nos EUA para o tratamento de melanoma avançado3. Além do T-VEC, muitos outros oHSVs geneticamente modificados estão sendo testados pré-clínico e clinicamente em diferentes tipos de câncer3,4,5,6,7,8. A atual biotecnologia avançada de DNA recombinante aumentou ainda mais a viabilidade da engenharia de novos oHSVs codificação para transgenes terapêuticos3,5. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação de oHSV é fundamental antes que qualquer oHSV (recém-desenvolvido) possa ser testado para estudos in vitro e in vivo. Este artigo descreve um método simples passo-a-passo de crescimento oHSV (em células Vero), purificação (pelo método de gradiente de sacarose) e titulação (por um ensaio de placa oHSV em células Vero)(Figura 1). Pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de Nível 2 (BSL2) de Biossegurança para obter um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.

Vero, uma linha de células renais de macaco verde africano, é a linha celular mais usada para propagação oHSV9,10,11,12,13 como as células Vero têm uma via de sinalização antiviral defeituosa14. Outras linhas celulares com estimulador inativado de sinais de genes interferon (STING) também podem ser usadas para o crescimento oHSV12,13. Este protocolo utiliza células Vero para o crescimento e ensaio de placas oHSV. Após a propagação, as células infectadas pelo OHSV são colhidas, lised e submetidas à purificação, onde as células lised são tratadas pela primeira vez com nuclease de benzonase para degradar o DNA das células hospedeiras, prevenir a agregação nucleico ácido-proteína e reduzir a viscosidade do lisato celular. Como a ativação adequada da benzonase muitas vezes requer Mg2+, 1-2 mM MgCl2 é usado neste protocolo15. Os detritos de células hospedeiras do lysato celular tratado com benzonase são ainda mais eliminados pela filtragem serial antes da centrifugação de sáuera-gradiente de alta velocidade. Uma almofada viscosa de solução de sacarose de 25% ajuda a garantir uma taxa mais lenta de migração de vírus através da camada de sacarose, deixando componentes relacionados com células hospedeiras no sobrenante, melhorando assim a purificação e limitando a perda de vírus na pelota16. O oHSV purificado é então titulado em células Vero, e placas virais são visualizadas por giemsa manchando17 ou X-gal staining (para LacZ codificando oHSVs)18.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1) crescimento do OHSV

NOTA: Garantir a aprovação do comitê de biossegurança institucional antes de trabalhar com o OHSV. Este estudo foi realizado sob o Protocolo IBC aprovado nº 18007. Mantenha as precauções BSL2: alvejante todas as tubulações, pontas, tubos e outros materiais que entram em contato com o vírus. Luvas de spray com 70% de álcool isopropílico antes que as mãos deixem o capô de cultura celular BSL2. Lave sempre as mãos com água com sabão depois de trabalhar com um vírus.

  1. No dia -1, as células vero de baixa passagem em 20 frascos T-150 cm2 a uma densidade de 7-8 × 106 células/frascos em meio de célula vero regular.
    NOTA: O meio Vero é preparado suplementando o meio de águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com soro de bezerro fetal inativado a calor de 10% (IFCS).
  2. No dia 0 (as células são 80-90% confluentes), adicione ohsv inóculo nas células Vero.
    1. Preparação do vírus inóculo
      1. Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 (MOI pode variar de 0,01 a 0,1, dependendo da capacidade de replicação do vírus) para amplificação do vírus. Use a fórmula (1) para calcular a quantidade de vírus (mL) para 20 frascos.
        Quantidade de vírus (mL) para 20 frascos = quantidade de vírus necessária (pfu)/titer de estoque de vírus (pfu/mL)(1)
      2. Use a solução salina tamponada de fosfato de alta glicose Dulbecco (DPBS) suplementada com 1% de IFCS para preparar o inóculo do vírus (7 mL por frasco T-150 cm2, ou seja, ~140 mL para 20 frascos). Adicione a quantidade necessária de oHSV a 140 mL de solução DE ALTA glicose DPBS/1% IFCS, vórtice por 1 min, e mantenha a mistura pronta para adição às células Vero.
    2. Lave os frascos T-150 cm2 2x com DPBS de alta glicose suplementados com 1% de IFCS (10 mL/lavagem). Aspire o DPBS/1% IFCS e adicione 7 mL de vírus inóculo/T-150 cm2 frasco.
    3. Balance suavemente os frascos por 5 min usando um roqueiro de frasco para distribuição adequada do inóculo sobre a monocamadoreira Vero, e, em seguida, incubar os frascos a 37 °C por 1,5-2 h. Certifique-se de que a prateleira da incubadora esteja nivelada.
    4. Remova o inóculo e adicione DMEM suplementado com 1% de IFCS (25 mL/frasco). Incubar os frascos por 2-4 dias.
  3. Verifique os frascos diariamente para 90-100% CPE (ver Figura 2).
  4. Colher as células vero infectadas pelo OHSV.
    1. Colete a cultura supernante (~20 mL) de cada frasco (deixe ~5 mL em cada frasco) em tubos de centrífuga cônica de 50 mL ou recipiente de mídia.
    2. Use um raspador de células para raspar as células do fundo dos frascos suavemente.
      NOTA: As células devem sair rapidamente dos frascos.
    3. Adicione ~15 mL da supernasa cultura (coletada na etapa 1.4.1) a cada frasco (que traz o volume de ~20 mL em cada frasco, ou seja, 400 mL para 20 frascos) e lave suavemente o fundo dos frascos algumas vezes usando um tubo serológico estéril de 10 mL.
      NOTA: Não encosto vigorosamente. Procure manter todas as células intactas.
    4. Colete as células (+ média) em tubos de centrífuga cônica de 50 mL no gelo (use 8 tubos para conter 400 mL de células colhidas de 20 frascos).
    5. Gire as células a 300 g por 10 min a 4 °C e aspire o supernasce.
    6. Adicionar 1,25 mL (50%) de Tampão de Vírus (VB) e 1,25 mL (50%) de supernante de cultura (coletado na etapa 1.4.1) a cada tubo de centrífuga e re-suspender cada pelota completamente. Transfira as células re-suspensas de oito tubos de centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
      NOTA: Consulte a preparação da solução VB na Tabela 1. Esterilize a solução VB por meio de um filtro de esterilização de mídia. Use 0,5 mL de VB + 0,5 mL de supernadante por frasco T-150 cm2 para re-suspensão, ou seja, para 20 frascos (20 mL), use 10 mL de VB e 10 mL de supernanato cultural.
    7. Congele as células re-suspensas usando gelo seco/100% etanol e armazene a -80 °C.

2) purificação oHSV

  1. Snap-freeze (em gelo seco e 100% etanol)/degelo (em um banho de água morna de 37 °C) as células seguidas por sônica de banho de água por 1 min para um total de 3 ciclos para garantir a lise adequada das células para liberar vírus no supernante.
    NOTA: Realize a sonicação por 1 min usando 40 kHz, 120 V de potência. Se um sônico tunable não estiver disponível, use um sonicator de banho de água ultrassônico. Tome uma alíquota de 50 μL para titulação na seção 3, o que ajudará a identificar qual das etapas seguintes é responsável pela perda potencial do vírus durante o procedimento de purificação.
  2. Trate o nuclease celular com Benzonase Nuclease (175 unidades/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M de estoque = 2 μL/mL), vórtice e incubar por 30 min a 37 °C. Coloque o tubo no gelo e realize as seguintes etapas a 4 °C.
  3. Pelota os detritos celulares por centrifugação de baixa velocidade.
    1. Gire a célula lysate a 300 g por 10 min.
    2. Colete o supernante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (suspenda a pelota celular em 0,5 mL de VB, designe-o como pelota-1 e armazene a 4 °C para uso na etapa 2.3.5; veja a Figura 1).
    3. Gire o supernante (obtido na etapa 2.3.2) novamente a 500 g por 10 min.
    4. Colete o supernante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (suspenda a pelota celular em 0,5 mL de VB, designe-o como pelota-2 e armazene a 4 °C para uso na etapa 2.3.5; veja a Figura 1).
    5. Misture a pelota-1 re-suspensa (de 2.3.2) e a pelota-2 (de 2.3.4) em um novo tubo de centrífugo de 1,7 mL, vórtice/sonicato (banho de água) 2x e gire a 400 g por 10 minutos. Recolher o supernante e combiná-lo com o supernacido obtido na etapa 2.3.4; ver Figura 1).
      NOTA: Realize a sonicação por 1 min usando 40 kHz, 120 V de potência para evitar a agregação viral antes do procedimento de filtragem na etapa 2.4. Tome uma alíquota de 50 μL do supernatante combinado para titulação na seção 3.
  4. Filtre o supernante combinado (~21 mL, ou seja, 20 mL de 1,4,6, 0,5 mL de 2,3,2 e 0,5 mL de 2,3,4) utilizando o seguinte método de filtragem de 3 etapas.
    1. Desenhe 21 mL do supernadante usando uma seringa de 10 mL (5-7 mL cada vez para fácil passagem através do filtro) e passe-a através de um filtro de membrana de difluoreto de polivinida de 5 μm estéril (PVDF) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 1).
      1. Adicione 1 mL de VB a um tubo de centrífuga cônica de 50 mL esvaziado em 2,4,1 (para coletar a quantidade restante de vestígios de supernascido do vírus), vórtice, e passar pelo mesmo filtro PVDF de 5 μm colocado no TUBE 1 (elevando o total para 22 mL de filtrado). Prossiga para a etapa 2.4.2.
    2. Retire 22 mL do filtro do TUBE 1 (como em 2.4.1) e passe-o através de um filtro de membrana estéril de 0,8 μm de ester de celulose mista (MCE) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 2).
      1. Adicione 1 mL de VB ao TUBE 1 esvaziado na etapa 2.4.2, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro MCE de 0,8 μm colocado no TUBE 2 (elevando o total para 23 mL de filtrado). Prossiga para a etapa 2.4.3.
    3. Desenhe 23 mL de filtrado do TUBE 2 (como em 2.4.1) e passe-o através de um filtro PVDF de 0,45 μm estéril colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 3).
      1. Adicione 1 mL de VB ao TUBE 2 esvaziado na etapa 2.4.3, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro PVDF de 0,45 μm colocado no TUBE 3 (elevando o total para 24 mL de filtrado).
        NOTA: Tome uma alíquota de 50 μL do filtrado para titulação na seção 3.
  5. Centrifugação de alta velocidade usando o método de gradiente de sacarose
    NOTA: Um rotor F13-14x50cy de ângulo fixo foi usado neste protocolo. Tanto o rotor quanto a centrífuga devem estar a 4 °C antes de prosseguir com as etapas seguintes.
    1. Adicione 10 mL de uma solução de sacarose filtrada 25% filtrada estéril (preparada dissolvendo 25 g de pó de sacarose em 100 mL da Solução de Sal Balanceado da Hank) em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
    2. Lentamente (3 mL/min) adicione 24 mL do filtrado do vírus (obtido a partir da etapa 2.4.3.1) em cima da camada de sacarose. Tome cuidado para manter camadas separadas do vírus filtrado e da solução de sacarose.
      NOTA: Até 30 mL da camada do vírus podem ser adicionados mais de 10 mL da solução de sacarose.
    3. Centrifugar o tubo por 90 min a 22.620 g a 4 °C.
    4. Remova o supernatante e a camada de sacarose do tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
      NOTA: A pelota do vírus deve ser esbranquiçada. Tome uma alíquota de 50 μL do supernante e uma alíquota de 50 μL da camada de sacarose para titulação na seção 3.
  6. Suspenda a pelota em solução de 10% de glicerol/PBS.
    1. Adicione 1 mL de glicerol estéril de 10% (diluído em PBS) ao tubo de centrífuga cônica de 50 mL para cobrir a pelota.
      NOTA: A quantidade da mistura re-suspensa pode variar (como 0,8-1,2 mL) dependendo do tamanho da pelota. Um volume menor daria uma maior concentração de vírus.
    2. Coloque o tubo de centrífuga cônica de 50 mL no gelo por 2-4 h. Durante este período, sonicato/vórtice a pelota a cada 15 minutos por 30 s para ajudar a desalojar/suspender a pelota.
    3. Recolher a pelota re-suspensa (1 mL de 10% de glicerol/PBS + o tamanho da pelota levará o volume total para ~1,3 mL) em um tubo de microcentrifusagem de 2 mL. [Opcional: Adicione mais 0,3 mL de 10% de glicerol/PBS ao mesmo tubo de centrífuga cônica de 50 mL para coletar a quantidade restante de traço da pelota, pipeta para cima e para baixo, e combine com a pelota re-suspensa na etapa 2.6.3 para levar o volume total a ~1,6 mL.]
      1. Se a suspensão na etapa 2.6.3 for turva ou nublada (devido a detritos celulares), centrifugar o tubo a 500 g por 10 min, transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL e prossiga para a etapa 2.6.4.
    4. Tome uma alíquota de 50 μL para titulação oHSV na seção 3. Aliquot o resto da solução (250 μL/aliquot) em tubos de microcentrifusagem estéril com tampas de parafuso (selada bem para armazenamento a longo prazo), snap-freeze e armazenar a -80 °C até o uso (pronto para estudos experimentais uma vez que o oHSV é determinado).
      NOTA: Todos os materiais que entram em contato com o vírus devem ser branqueados ou tratados com radiação ultravioleta antes da remoção do capô ou descarte.

3. titulação oHSV e ensaio de placa

  1. Semente 1.7-1.8 x 105 células Vero/bem em uma placa de cultura celular de 6 poços no meio celular Vero (DMEM com 10% IFCS; ver passo 1.1).
    NOTA: Certifique-se de que as células estão distribuídas de forma homogênea por todo o poço; não gire a placa, o que pode causar acúmulo de células no meio dos poços. Para evitar rodopiar, balance lentamente a placa à mão verticalmente, depois horizontalmente, e, em seguida, coloque suavemente a placa na incubadora.
  2. No dia seguinte (quando as células atingem 70-80% de confluência), aspiram o meio cultura e adicionam 1 mL/poço de PBS de alta glicose suplementada com 1% de IFCS. Deixe a placa no capô da cultura celular até que o passo 3.3 esteja completo.
  3. Diluir o vírus em tubos de polipropileno de 5 mL usando PBS/1% IFCS(Figura 3).
    NOTA: Utilize a alíquota de 50 μL coletada na etapa 2.6.4 para diluição serial. No tubo 1 (10-3 diluição), adicione 2 μL do vírus em 1998 μL de PBS/1%IFCS, vórtice. No tubo 2 (10-5 diluição), tome 10 μL dotubo 1 em 990 μL de PBS/1% IFCS, vórtice. No tubo 3rd (diluição de 10-6), tome 100 μL do tubo2 em 900 μL de PBS/1% IFCS, vórtice; continuar esta diluição serial de 10 vezes até 10-9 diluição. Veja os detalhes na Figura 3.
  4. Aspirar PBS/1% IFCS e adicionar 0,7 mL/bem do vírus diluído serial (a partir de 10-5 a 10-9) às células Vero.
    NOTA: Não deixe as células secarem.
  5. Balance suavemente a placa em um roqueiro por 5 minutos à temperatura ambiente (para garantir a distribuição homogênea do inóculo do vírus).
  6. Incubar a placa por 1,5 h a 37 °C.
    NOTA: Durante este período de incubação, prepare 1:1000 diluição da imunoglobulina humana G (IgG) no DMEM complementada com 1% de IFCS. Para uma placa de 6 poços, prepare 12,5 mL para que 2 mL/bem possa ser usado na etapa 3.7. Ajuste a diluição para explicar as variações de lotes no IgG humano.
  7. Remova o inóculo do vírus dos poços e adicione 2 mL/poço de IgG humano de 0,1% (para neutralizar o oHSV no meio da cultura e evitar a formação de placas secundárias) no DMEM complementado com 1% de IFCS. Incubar a placa a 37 °C durante 3-4 dias.
    NOTA: Placas claras geralmente se formam em 3 dias.
  8. Placas de fixação e coloração
    1. Remova o supernasce e fixe as células em metanol puro (1 mL/bem) por 5 minutos. Retire o metanol e deixe as placas secarem ao ar.
    2. Diluir a mancha de Giemsa (1:5) com água deionizada, e adicionar 1 mL da mancha de Giemsa diluída por poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10-15 min.
    3. Retire a mancha, enxágue com água da torneira e deixe as placas secarem ao ar.
    4. Conte as placas usando um microscópio dissecando.
    5. Opcional para oHSVs com expressão lacZ:
      1. Remova o supernasce e fixe as células com glutaraldeído de 0,2% a frio/2% paraformaldeído por 5-10 min à temperatura ambiente.
      2. Remova a solução fixa e lave as células 3x com PBS.
      3. Adicione a solução X-gal às células (1 mL/bem) e incubar a placa a 37 °C por 2 h.
        NOTA: A mancha X-gal deve ser preparada recentemente no dia da coloração; armazenamento a longo prazo pode levar ao desbotamento de cor. Veja a preparação da solução X-gal na Tabela 1.
      4. Retire a mancha X-gal e lave a placa com água da torneira por 1 min.
      5. Contra-mancha com solução Vermelha Neutra (1 mL/bem) por 2 min a temperatura ambiente.
        NOTA: Veja a preparação da solução Vermelho Neutro na Tabela 1.
      6. Lave a placa com água da torneira por 1 min; permitir que as placas sequem ao ar.
      7. Conte placas azuis usando um microscópio de dissecação(Figura 4).
  9. Calcule o título usando fórmula (2)
    Titer em pfu/mL (unidades formadoras de placas) = Número de placas/0,7 mL × fator de diluição(2)
    NOTA: Por exemplo, se 25 placas forem encontradas no poço de diluição10 -9, o título é 25/0,7 ×10 9 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Este é o último oHSV titer de alíquotas preparadas na etapa 2.6.4.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Uma breve visão geral de todo o protocolo é retratada na Figura 1, que representa as etapas críticas envolvidas no crescimento, purificação e titulação do oHSV. CPE em células Vero pode ser detectado tão cedo quanto 4 h infecção pós-HSV19. A Figura 2 demonstra cpe em células Vero em três pontos de tempo diferentes após a infecção por OHSV. O nível do CPE é aumentado ao longo do tempo. Neste protocolo, 90-100% CPE é geralmente observado de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo começa com o crescimento do oHSV em células Vero de baixa passagem. A confluência da monocamada celular Vero deve ser ~80% no momento da inoculação do vírus, pois as células supercultivadas podem desenvolver estruturas fibrosas apertadas que podem reduzir a entrada de OHSV nas células Vero20. Uma vez observadas 90-100% CPE, a cultura sobrenante é removida, as células são colhidas, resuspended em VB/supernante (ver passo 1.4.6), congelado por snap e armazenado a -80 °C para purificação ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

SDR é um co-inventor de patentes relacionadas a vírus herpes simplex oncolíticos, de propriedade e gerenciado pela Universidade de Georgetown e pelo Hospital Geral de Massachusetts, que receberam royalties da Amgen e ActiVec Inc. e está no Conselho Consultivo Científico da EG 427. Os outros autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

A pesquisa no laboratório Saha foi apoiada em parte por fundos do DOD (W81XWH-20-1-0702) e da Fundação Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey foram parcialmente apoiados pelo NIH (R01 CA160762).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga de 1,7 mL Tubos de centrífugaSigmaCLS3620
15 mL TubosFalcon352097
5 mL TubosFalcon
50 mL PlacasdeFalcon
6 poçosFalcon353046
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KU
Raspador de célulasFisher Scientific179693
Dimetilsulfóxido SigmaD2650-100ML
Dulbecco' s Modified Eagle MediumCorningMT-10-013-CV
Dulbecco' s Fosfato Tampolado com Solução SalinaCorningMT-21-031-CV
Soro Bovino FetalHycloneSH3007003
Giemsa ManchaSigmaG3032
GlutaraldeídoFisher Scientific50-262-23
GlicerolSigmaG5516
Hank's Solução Salar Balanceada (HBSS)CorningMT-21-021-CV
Dulbecco com alto teor de glicose s Solução salina tamponada com fosfatoSigmaD4031
Imunoglobulina humanaGamastanNDC 13533-335-12
Cloreto de magnésioFisher ChemicalM33-500
Filtro de esterilização de mídia, 250 mLNalgene, Fisher Scientific09-740-25E
Filtro de esterilização de mídia, 500 mLNalgene, Fisher Scientific09-740-25C
Solução VermelhaNeutra SigmaN4638
ParaformaldeídoFisher scientific  15710S
Balancim de placaFisher88861043
Ferricianeto de potássioSigmaP8131
Ferrocianeto de potássioSigmaP9387
Cloreto de sódioFisher ChemicalS271-3
Sorvall ST 16R CentrífugaThermoFisher Scientific75004381
Sorvall ST 21R CentrífugaThermoFisher Scientific75002446
Tubos de Microcentrífuga Estéreis com Tampas de RoscaFisher Scientific02-681-371
SucaroseFisher ScientificBP220-1
Filtro de Seringa, 0.45 PVDFMilliporeSigmaSLHV033RS
Filtro de Seringa, 0.8 MCEMilliporeSigmaSLAA033SS
Filtro de seringa, 5 µ m PVDFMilliporeSigmaSLSV025LS
T150 frasco de culturaFalcon355001
Tris-HClMP Biomedicals LLC 816116
ultrassônicoBransonCPX-952-116R
X-galCorning46-101-RF
de polipropileno de polipropileno de centrífuga de polipropileno 352063 cultura de células 352098 Banho-maria

Referências

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).
  5. Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514(2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400(2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407(2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40(2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224(2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Herpesvírus OncolíticoPurificação ViralEnsaio de PlacaEfeito CitopáticoCélulas VeroGradiente de SacaroseImunoterapia do CâncerTitulação ViralTratamento com BenzonasePreparação de Estoque Viral
Crescimento, Purificação e Titulação do Vírus Herpes Simplex Oncolítico
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.