Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Summary

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Abstract

O fracionamento de polissomos por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos sendo traduzidos por ribossomos e analisar fatores associados a polissomos. Embora os fabricantes automatizados de gradientes e os sistemas de fracionamento de gradientes sejam comumente usados com essa técnica, esses sistemas geralmente são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para laboratórios que têm recursos limitados ou não podem justificar a despesa devido à sua necessidade infrequente ou ocasional de executar esse método para suas pesquisas. Aqui, um protocolo é apresentado para gerar perfis de polissomo de forma reprodutível usando equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular sem instrumentos de fracionamento especializados. Além disso, uma comparação de perfis de polissomas gerados com e sem um sistema de fracionamento de gradiente é fornecida. Estratégias para otimizar e produzir perfis de polissomos reprodutíveis são discutidas. Saccharomyces cerevisiae é utilizado como organismo modelo neste protocolo. No entanto, este protocolo pode ser facilmente modificado e adaptado para gerar perfis de ribossomos para muitos organismos e tipos de células diferentes.

Introduction

Os ribossomos são complexos ribonucleoproteicos mega-Dalton que realizam o processo fundamental de tradução de mRNA em proteínas. Os ribossomos são responsáveis por realizar a síntese de todas as proteínas dentro de uma célula. Os ribossomos eucarióticos compreendem duas subunidades designadas como a pequena subunidade ribossomal (40S) e a grande subunidade ribossomal (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. O ribossomo totalmente montado é designado como o monossomo dos anos 80. Os polissomos são grupos de ribossomos envolvidos na tradução de uma única molécula de mRNA. O fracionamento de polissomas por centrifugação de gradiente de densidade de sacaros....

Protocol

1. Preparação de 7% - 47% de gradientes de sacarose

NOTA: O intervalo linear do gradiente de sacarose pode ser modificado para obter uma melhor separação, dependendo do tipo de célula utilizada. Este protocolo é otimizado para perfis polissômicos para S. cerevisiae.

1. Preparar soluções-estoque de 7% e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ e 1 mM TDT). Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.
2. Preparar 14 mL de soluções de sacarose a 17%, 27% e 37%, dispensando e misturando as soluções-estoq....

Results

Três perfis de polissomas representativos são mostrados na Figura 3. Todos os perfis são da mesma cepa de levedura. Um perfil típico de polissomas terá picos bem resolvidos para as subunidades ribossômicas dos anos 40, 60 e 80, bem como polissomos. A crista de cada subunidade ribossomal e o pico do polissomo serão aparentes em cada perfil (Figura 3). Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado na

Discussion

Aqui um método para criar perfis de polissomas sem o uso de sistemas de fracionamento automatizados caros foi descrito. A vantagem desse método é que ele torna o perfil de polissomas acessível a laboratórios que não possuem sistemas de fracionamento automatizados. As principais desvantagens deste protocolo são o tedioso fracionamento manual e a sensibilidade reduzida em comparação com o sistema de fracionamento de densidade dedicado.

Este protocolo envolve a preparação cuidadosa de gradientes .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fracionador Automático	Brandel
Clariostar Leitor de Placas Multimodo	BMG Labtech
Cicloheximida	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Contas de Vidro, lavadas com ácido	Sigma Aldrich	G8772	425-ndash; 600 μ m
Heparina	Sigma Aldrich	H4784
Cloreto de Magnésio, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Agulha, 22 G, Cubo de Metal	Hamilton Company	7748-08	comprimento personalizado 9 polegadas, estilo de ponta 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Tubos de Centrífuga de Polipropileno	Beckman Coulter	331372
Tubo de ensaio de polipropileno Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorômetro	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Kit de ensaio	Thermo Fisher Scientific	Q32855
Inibidor de RNAse	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Rotor de Balde Oscilante Pkg	331336		Coulter Beckman
, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplaca, 96 poços	Greiner Bio-One