Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.
Artigo de método
Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.
O fracionamento de polissomos por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos sendo traduzidos por ribossomos e analisar fatores associados a polissomos. Embora os fabricantes automatizados de gradientes e os sistemas de fracionamento de gradientes sejam comumente usados com essa técnica, esses sistemas geralmente são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para laboratórios que têm recursos limitados ou não podem justificar a despesa devido à sua necessidade infrequente ou ocasional de executar esse método para suas pesquisas. Aqui, um protocolo é apresentado para gerar perfis de polissomo de forma reprodutível usando equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular sem instrumentos de fracionamento especializados. Além disso, uma comparação de perfis de polissomas gerados com e sem um sistema de fracionamento de gradiente é fornecida. Estratégias para otimizar e produzir perfis de polissomos reprodutíveis são discutidas. Saccharomyces cerevisiae é utilizado como organismo modelo neste protocolo. No entanto, este protocolo pode ser facilmente modificado e adaptado para gerar perfis de ribossomos para muitos organismos e tipos de células diferentes.
Os ribossomos são complexos ribonucleoproteicos mega-Dalton que realizam o processo fundamental de tradução de mRNA em proteínas. Os ribossomos são responsáveis por realizar a síntese de todas as proteínas dentro de uma célula. Os ribossomos eucarióticos compreendem duas subunidades designadas como a pequena subunidade ribossomal (40S) e a grande subunidade ribossomal (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. O ribossomo totalmente montado é designado como o monossomo dos anos 80. Os polissomos são grupos de ribossomos envolvidos na tradução de uma única molécula de mRNA. O fracionamento de polissomas por centrifugação de gradiente de densidade de sacaros....
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1. Preparação de 7% - 47% de gradientes de sacarose
NOTA: O intervalo linear do gradiente de sacarose pode ser modificado para obter uma melhor separação, dependendo do tipo de célula utilizada. Este protocolo é otimizado para perfis polissômicos para S. cerevisiae.
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Três perfis de polissomas representativos são mostrados na Figura 3. Todos os perfis são da mesma cepa de levedura. Um perfil típico de polissomas terá picos bem resolvidos para as subunidades ribossômicas dos anos 40, 60 e 80, bem como polissomos. A crista de cada subunidade ribossomal e o pico do polissomo serão aparentes em cada perfil (Figura 3). Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado na
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Aqui um método para criar perfis de polissomas sem o uso de sistemas de fracionamento automatizados caros foi descrito. A vantagem desse método é que ele torna o perfil de polissomas acessível a laboratórios que não possuem sistemas de fracionamento automatizados. As principais desvantagens deste protocolo são o tedioso fracionamento manual e a sensibilidade reduzida em comparação com o sistema de fracionamento de densidade dedicado.
Este protocolo envolve a preparação cuidadosa de gradientes .......
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Os autores não têm nada a revelar.
Os autores agradecem ao Dr. Percy Tumbale e à Dra. Melissa Wells por sua leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fracionador Automático | Brandel | ||
| Clariostar Leitor de Placas Multimodo | BMG Labtech | ||
| Cicloheximida | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Contas de Vidro, lavadas com ácido | Sigma Aldrich | G8772 | 425-ndash; 600 μ m |
| Heparina | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Cloreto de Magnésio, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Agulha, 22 G, Cubo de Metal | Hamilton Company | 7748-08 | comprimento personalizado 9 polegadas, estilo de ponta 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Tubos de Centrífuga de Polipropileno | Beckman Coulter | 331372 | |
| Tubo de ensaio de polipropileno Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorômetro | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Kit de ensaio | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| Inibidor de RNAse | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Rotor de Balde Oscilante Pkg | 331336 | Coulter Beckman | |
| , 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplaca, 96 poços | Greiner Bio-One |
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