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Artigo de método

Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

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DOI:

10.3791/62698

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30 de junho de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shriners Hospitals Pediatric Research Center, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo demonstra um novo método para a aplicação de terapias genéticas a subpopulações de células em ratos neonatais em idades pós-natais de 5 a 10 dias, injetando um modificador quimiogenético anterógrado no córtex somatomotor e uma Cre recombinase retrógrada transportável na medula espinhal cervical.

Resumo

Enfrentar com sucesso os obstáculos que restringem a pesquisa em ratos neonatais é importante para estudar as diferenças nos resultados observados nas lesões da medula espinhal pediátrica (LME) em comparação com as ISCs adultas. Além disso, a introdução confiável de terapias nas células-alvo do sistema nervoso central (SNC) pode ser um desafio, e imprecisões podem comprometer a eficácia do estudo ou da terapia. Este protocolo combina a tecnologia de vetores virais com uma nova técnica cirúrgica para introduzir com precisão terapias genéticas em ratos neonatais no 5º dia pós-natal. Aqui, um vírus projetado para o transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre é introduzido nos terminais axônicos dos neurônios corticoespinhais na medula espinhal, onde é posteriormente transportado para os corpos celulares. Um receptor projetista de orientação invertida (DIO) de dupla floxe exclusivamente ativado pelo vírus da droga (s) designer (DREADD) é então injetado no córtex somatomotor do cérebro. Esta técnica de dupla infecção promove a expressão dos DREADDs apenas nos neurônios do trato corticoespinhal (TSC) co-infectados. Assim, a co-injeção simultânea do córtex somatomotor e dos terminais CST cervical é um método válido para estudar a modulação quimiogenética da recuperação seguindo modelos de LM cervical em ratos neonatais.

Introdução

Embora a LM seja uma ocorrência relativamente rara na população pediátrica, é particularmente traumática e causa uma incapacidade permanente que requer imensa previsão logística. Além disso, uma maior proporção de LME pediátrica é classificada como cervical e completa em comparação com a população adulta 1,2. Uma característica das espécies de mamíferos é que os neonatos se recuperam notavelmente melhor da LM do que os adultos, o que oferece uma oportunidade para avaliar os mecanismos determinantes para a recuperação em populações mais jovens 3,4,5. Apesar disso, há menos estudos multimodais que abordam a pesquisa de recém-nascidos e roedores infantis, em parte devido à dificuldade adicional de direcionar com precisão populações selecionadas de neurônios nos marcos anatômicos muito mais apertados de animais mais jovens6. Este artigo enfoca a injeção direta de vetores adenoassociados ânterogrados e retrógrados altamente eficientes na medula espinhal de ratos para modular as principais vias motoras com a aplicação de DREADDs dependentes de Cre, expandindo o alcance de estudos de regeneração multimodal.

Os vetores virais são importantes ferramentas biológicas com uma amplitude de aplicações, incluindo a introdução de material genético para substituir genes-alvo, regular positivamente as proteínas de crescimento e traçar a paisagem anatômica do SNC 7,8,9. Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras espinhais têm sido estudados usando traçadores clássicos, ou seja, a amina dextrana biotinilada. Embora os traçadores tradicionais tenham sido fundamentais para a descoberta da neuroanatomia, eles não estão isentos de desvantagens: eles rotulam indiscriminadamente as vias, mesmo que corretamente injetados, e estudos descobriram que eles são absorvidos por axônios danificados10,11,12. Consequentemente, isso poderia levar a interpretações incorretas em estudos de regeneração, onde axônios cortados poderiam ser confundidos com fibras regeneradoras.

O método a seguir utiliza o sistema de vetores bivirais recentemente popularizado em estudos de modulação, com dois vetores virais diferentes em duas áreas separadas do mesmo neurônio13,14. O primeiro é um vetor que infecta localmente os corpos celulares dos neurônios de projeção. O outro é um vetor retrógrado sendo transportado dos terminais axônicos dos neurônios de projeção (Figura 1). O vetor retrógrado carrega Cre recombinase, e o vetor local incorpora a sequência de floxe duplo "Cre-On" na qual uma proteína fluorescente (mCherry) é codificada. O transgene nativo que expressa tanto hM3Dq quanto mCherry é invertido em relação ao promotor e é flanqueado por dois sítios LoxP (Figura 2). Assim, o mCherry só é expresso nos neurônios de projeção duplamente transduzidos onde a Cre recombinase induz um evento de recombinação entre os sítios LoxP, invertendo a orientação do transgene para o quadro de leitura apropriado e permitindo a expressão do DREADD e da proteína fluorescente. Uma vez que o transgene viral esteja na orientação correta, e quando aplicável, os DREADDs podem induzir transitoriamente a neuromodulação através de um ligante injetado separadamente, ou seja, clozapina-N-óxido. O protocolo foi projetado para autenticar pesquisas de neuromodulação induzíveis em neonatos, em que os DREADDS são injetados para modular os CSTs seletivamente. O sistema de dois vírus atua como uma apólice de seguro, garantindo que cada célula positiva para DREADD seja rastreável sob fluorescência com alta fidelidade para validar as injeções.

Este método também ajuda a preencher a lacuna na pesquisa neonatal. A LM pediátrica apresenta seus desafios, e pesquisas que analisem a regeneração, a brotação ou a plasticidade devem enfatizar as diferenças entre neonatos e adultos 3,15,16,17. Otimizando o procedimento cirúrgico e realizando estudos anatômicos prévios com coloração de Nissl, as coordenadas para as injeções cranianas e espinhais foram validadas. O objetivo era fornecer um método para injeções duplas em um rato neonatal com maior fidelidade e capacidade de sobrevivência.

Para o modelo atual, o vetor anterógrado foi injetado nos corpos celulares do córtex somatomotor utilizando o bregma como referência18,19. Em relação às injeções espinhais, o vetor retrógrado foi injetado nas lâminas V-VII, onde residem os terminais axônicos CST20,21. Existem muitas questões fundamentais subjacentes a como certos modelos de lesões afetam animais mais jovens de forma diferente e como a recuperação subsequente diverge de um animal mais velho. Este estudo demonstra um meio robusto de estudar lesões cervicais e a recuperabilidade da função dos membros anteriores em roedores neonatais. Em contrapartida, a maioria dos estudos anteriores abordou a locomoção da recuperação após lesões lombares ou torácicas 5,22,23,24. Ao emparelhar o vetor duplo-viral com a nova técnica de injeção descrita aqui, este protocolo ajuda a mitigar certos problemas (ou seja, a capacidade de sobrevivência) que podem atormentar as investigações de roedores neonatais. Este método é robusto, prático e versátil: pequenas variações na técnica permitirão atingir diferentes vias, ou seja, TSC ventral, TSC dorsal e vias dorsais ascendentes.

Para este sistema, um vírus de ação local (por exemplo, AAV2) é injetado na região dos corpos celulares neuronais de interesse. Um segundo vírus transportado retrógrado que controla a expressão do vírus local é injetado nos terminais axônicos para essa população neuronal. Assim, por definição, apenas os neurônios corticoespinhais são rotulados. O vírus retroAAV-Cre foi escolhido com um promotor de CMV constitutivamente ativo, pois o plasmídeo shuttle é usado para gerar vários sorotipos de AAV para expressão dependente de Cre em vários tipos de células. Para injeções corticais, o AAV2 foi escolhido com o transgene acionado pelo promotor de sinapsina-1 para limitar qualquer expressão aos neurônios. Como o sistema 2-viral depende mais da origem e término da população neuronal de interesse, vários promotores diferentes poderiam ser usados, se eles puderem impulsionar a expressão dos genes de interesse dentro da população neuronal de interesse. Por exemplo, o promotor neuronal excitatório, CamKII, poderia ser substituído pela sinapsina-1. Além do uso desses sorotipos de AAV, o transporte retrógrado para imaturos e, em muito menor grau, neurônios motores corticoespinhais adultos também pode ser alcançado usando o lentivírus transportável retrógrado alto (HiRet)25. Os lentivírus HiRet usam uma glicoproteína quimérica de raiva/VSV para direcionar a captação na sinapse para o transporte retrógrado. Combinado com um promotor Tet-On, este sistema 2-viral suporta a expressão induzível de forma retrógrada-dependente26,27.

Os vírus retrógrados inserem vetores no espaço sináptico de um neurônio-alvo, permitindo que ele seja absorvido pelo axônio dessa célula e transportado para o corpo celular. Embora os vetores lentivirais tenham tido anteriormente um tremendo sucesso, proporcionando expressão a longo prazo em estudos de terapia gênica, esse método girou em direção aos vetores virais adenoassociados por algumas razões simples26,28: o AAV é mais econômico, igualmente eficaz e apresenta menos carga logística, uma vez que possui uma designação de nível de biossegurança mais baixa 29,30,31,32 . Enquanto o AAV2, o sorotipo mais utilizado, demonstra transfecção robusta de axônios CST, futuros pesquisadores podem notar que o AAV1 oferece alguma versatilidade ao rotular transinapticamente, apresentando assim várias iterações possíveis em estudos futuros33. A adaptação final é codificar o vírus retrógrado com Cre-recombinase para que múltiplos vetores anterógrados possam ser introduzidos simultaneamente, reduzindo assim o desperdício desnecessário de vírus internos e maximizando a probabilidade de os DREADDs se expressarem na orientação correta.

Em última análise, este protocolo demonstra a injeção simultânea no córtex e na coluna cervical, visando especificamente os corpos celulares e os terminais axônicos do trato corticoespinhal, respectivamente. A transfecção de alta fidelidade é observada no córtex cerebral e na medula espinhal. Embora o protocolo descrito tenha sido aperfeiçoado para ratos Sprague Dawley com 5 dias de idade, é adequado para os dias pós-natais 4-10 com pequenos ajustes na anestesia e coordenadas estereotáxicas.

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Protocolo

Todos os seguintes procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Temple University. O protocolo descrito é uma cirurgia de sobrevida, e os animais foram eventualmente eutanasiados por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico ao término de seus períodos.

1. Preparação pré-cirúrgica

  1. Preparar pelo menos duas agulhas de vidro puxadas para injeção viral usando pipetas capilares de vidro de 3,5 nL; uma agulha para o DREADD e uma agulha para o rCre. Como medida de precaução, prepare 4-5 agulhas no caso de quebrarem no intraoperatório.
  2. Usando microtesouras, corte 1-2 mm de excesso de vidro da agulha.
  3. Para cada agulha, posicione-a a 30°, use um chanfro de micropipeta para criar uma ponta com abertura de 30-40 μm e um ângulo chanfrado de 45°.
  4. Armazene as agulhas em uma placa de Petri coberta e, em seguida, esterilize-as colocando a placa de Petri em um exaustor de biossegurança sob luz UV por 15 min.
  5. Preparar os vírus necessários retirando um volume adequado do congelador a -80 °C antes do procedimento, tendo em conta que cada animal necessitará de 3 μL de cada vírus.
    NOTA: Transporte e armazene o vírus no gelo quando não estiver em uso. Este protocolo foi desenvolvido utilizando AAV2-hM3Dq-mCherry e AAV2-retroCre para injetar 3 μL de cada vírus por animal. O plasmídeo DREADD, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (ver Tabela de Materiais), foi utilizado para fazer o AAV2 anterógrado com um título viral de 1,54 × 1012 cópias do genoma (GC)/mL. O plasmídeo Cre, pAAV-CMV-scCre, foi utilizado para a confecção do AAV2 retrógrado com título viral de 4,27 × 1012 GC/mL.
  6. Ligue o injetor à microbomba e coloque-o num micromanipulador com uma balança Vernier.
  7. Para ajudar a confirmar visualmente a presença ou ausência de vírus na agulha, carregue corante colorido, ou seja, óleo vermelho, na agulha. Evite bolhas na agulha.
  8. Insira a agulha de vidro no injetor, certificando-se de que a agulha se encaixa corretamente.
  9. Se disponível, repita todo o processo com uma bomba injetora separada para cada vírus. Se houver apenas uma bomba injetora disponível, prepare duas agulhas separadas e substitua a agulha usada quando for hora de trocar os vírus.

2. Anestesia e preparação do local cirúrgico

  1. Pese o animal em uma balança digital. Registre o peso pré-operatório para determinar o volume de anestésico necessário.
    NOTA: Este protocolo constatou que a técnica anestésica mais confiável para garantir um plano anestésico satisfatório durante todo o tempo operatório é uma combinação de cetamina e hipotermia. A cetamina é insuficiente para garantir a anestesia por conta própria, e a suplementação com xilazina tem um limiar estreito antes de aumentar a mortalidade intraoperatória. A hipotermia por si só não é suficiente para cirurgias prolongadas (cirurgia dupla de coluna e cérebro provavelmente requer >1 h de anestesia constante).
  2. Anestesiar o filhote injetando cetamina diluída (10 mg/mL) por via subcutânea entre as omoplatas, de modo que o animal receba uma dose de 100 mg/kg de cetamina; aguarde 5 min.
    NOTA: Por exemplo, no 5º dia pós-natal, um filhote de rato pesa 10 g e recebe 0,1 mL da solução diluída de cetamina (10 mg/mL).
  3. Coloque o filhote no gelo triturado por 6-8 min. Proteja-o contra congelamento, colocando o animal em uma luva de látex ou parafilme para evitar o contato direto com o gelo.
  4. Aperte o pé firmemente usando fórceps para confirmar um plano anestésico apropriado. Se ocorrer uma retirada reflexiva, deixe por mais 2 minutos no gelo antes de prosseguir.
  5. Aplicar amplamente antisséptico na cabeça do animal e área das costas usando gaze estéril embebida com uma solução de iodo a 5%. Em seguida, esterilize com gaze embebida em etanol a 70%. Aplique os toalhetes antissépticos três vezes cada, alternando entre iodo e etanol para embeber a gaze.
    NOTA: Não há necessidade de cuidados com os olhos, pois os filhotes jovens só abrem os olhos aos 14 dias de idade.
  6. Se um animal for receber cirurgia dupla (cérebro + coluna vertebral), forneça um bolo fisiológico normal antes da cirurgia (0,02 mL / g) por via subcutânea entre as omoplatas.
    NOTA: se o animal se tornar responsivo durante a cirurgia e for necessária anestesia adicional, substitua o animal no gelo por 5 minutos.

3. Campo cirúrgico e preparação de instrumentos

  1. Autoclave as ferramentas cirúrgicas que incluem um suporte de bisturi, rongeurs, hemostáticos, pinça curva de ponto médio e afastadores
  2. Prepare o microscópio e instale o adaptador estereotáxico de rato neonatal para posicioná-lo firmemente dentro do suporte estereotáxico adulto.
  3. Realizar a cirurgia usando luvas esterilizadas. Abra um pacote de luvas cirúrgicas estéreis pré-embaladas e coloque o envoltório de luvas estéreis sobre a mesa, usando o invólucro como uma área adicional para colocar as ferramentas usadas.
    NOTA: É importante seguir as boas práticas cirúrgicas e manter a esterilidade durante todo o procedimento.
  4. Fixe uma lâmina de 11 no suporte do bisturi. Posicione solução salina estéril, sutura de catgut cromo 4.0, sutura de seda 4.0 e materiais para controlar o sangramento, por exemplo, gaze estéril, aplicadores estéreis com ponta de algodão e triângulos.
  5. Configure dois campos cirúrgicos conforme descrito acima, com um local designado para craniotomia e o outro local designado para laminectomia cervical.
  6. Recupere o animal e prenda-o no adaptador estereotáxico: como os neonatos são muito cartilaginosos, fixe-os suavemente, direcionando as barras auriculares amplamente para as articulações mandibulares. Uma vez estabilizado horizontalmente, introduza suavemente o bocal frontal.
    NOTA: Uma regra de não ligação usada para fornecer uma área cirúrgica "plana" é fixar as barras auriculares na mesma altura e o bocal em aproximadamente 2-3 níveis mais baixos.

4. Realização da craniotomia e exposição do córtex somatomotor

  1. Identifique a área onde a incisão será feita pressionando a pinça na linha média na parte superior do couro cabeludo, sentindo a sutura sagital. Faça uma incisão de 1 cm ao longo do plano de sutura sagital, começando imediatamente acima da linha dos olhos. Mantenha a pele esticada para garantir uma incisão limpa, reta e precisa.
  2. Identifique o bregma (a convergência das suturas coronal e sagital) sondando suavemente a pinça ao longo da superfície do crânio e prestando muita atenção às linhas de sutura, bem como a qualquer recuo causado pela pinça que corre ao longo dos ossos parietais e frontais.
  3. Mantenha a abertura com a aplicação de ganchos ponderados no lado de interesse. Note que a injeção espinhal é feita no lado direito, a injeção craniana é no lado esquerdo.
  4. Limpe a aponeurose com uma combinação das pontas de algodão e microtesouras para maximizar a exposição do bregma para maior precisão. Certifique-se de que a sutura coronal esteja em visão clara o suficiente lateralmente para fornecer um modelo aproximado para injeções subsequentes.
  5. Usando a microtesoura, corte aproximadamente uma seção de 3 x 2 mm do osso frontal esquerdo do crânio imediatamente adjacente ao bregma.
    NOTA: Uma vez que o retalho ósseo tenha sido cuidadosamente removido, deve haver uma janela clara com matéria cerebral exposta pronta para injeção. As linhas de sutura restantes no lado contralateral do cérebro atuarão como um guia visual para manter a precisão ao longo do eixo anteroposterior (AP).
  6. Limpe quaisquer detritos, líquido cefalorraquidiano (LCR) e sangue com pontas de algodão.
    NOTA: É normal que o sangue ou o LCR obscureçam ligeiramente a linha visual, por isso é aconselhável limpar a área com pontas de algodão regularmente.
    figure-protocol-1

Figura 3: Uma ilustração esquemática das coordenadas de injeção craniana (mm) em relação ao bregma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Carregar o vírus e posicionar o injetor

  1. Carregue o vírus no injetor pipetando ~5 μL em um pedaço de parafilme e posicione a agulha de modo que a ponta esteja descansando sobre a gota do vírus.
  2. Certifique-se de que o vírus extra é carregado no injetor para garantir a injeção suave. Por exemplo, ao injetar um total de 3 μL (1 μL para cada local de injeção), retire 4 μL do vírus a uma taxa de 250 nL/s usando a microbomba.
  3. Remova o excesso de vírus com uma limpeza de laboratório.
  4. Posicione o micromanipulador de modo que a escala de Vernier seja visível e posicione a agulha acima da sutura sagital.
  5. Abaixe a agulha para logo acima da área que representa o bregma (Figura 3) e anote as coordenadas AP e médio-lateral (ML).
  6. Dado que as injeções estarão no lado esquerdo, gere coordenadas alvo subtraindo 1, 1,5 e 2,0 mm (ML: -1,0, -1,5, -2,0) das coordenadas ML para bregma.
    NOTA: A posição AP será de +0,5 mm do bregma para todas as três injeções.
  7. Mova a agulha para a posição para a primeira injeção. AP: +0.5, ML: -1.0
  8. Abaixe a agulha para o cérebro exposto até que ele esteja recuando o córtex externo. Anote a altura da agulha e coloque-a na posição subtraindo 0,6 mm da altura da superfície do cérebro. Profundidade de injeção: superfície cortical -0,6 mm.
    NOTA: É importante observar a profundidade da superfície para cada injeção, pois podem ocorrer pequenas interrupções no posicionamento do rato.

6. Injetar vírus no córtex somatomotor

  1. Uma vez que a agulha esteja no lugar, programe o injetor para injetar 1 μL a uma taxa de 250 nL / min.
  2. Uma vez que a injeção esteja concluída, deixe a agulha descansar no córtex por 3 min.
  3. Repita as injeções para as outras coordenadas: um total de 3 injeções ao longo do córtex em relação ao bregma, todas a uma profundidade de -0,6 mm: 1) AP: +0,5 mm, ML: -1,0 mm 2) AP: +0,5 mm, ML: -1,5 mm 3) AP: +0,5 mm, ML: -2,0 mm.
  4. Após a conclusão das injeções, consulte a secção 9 para sutura e transfira o animal para a outra mesa de operação para laminectomia cervical.

7. Criando uma janela espinhal para injeções precisas na medula espinhal

  1. Identifique o local da incisão usando os dedos para palpar a base do crânio. Na linha média, inicie a incisão 1-2 mm posterior à base do crânio usando uma lâmina #11 e estenda a incisão 1 cm posterior para expor o músculo superficial. Mantenha a pele tensa aplicando tensão com o polegar e o dedo indicador para garantir uma incisão limpa.
  2. Usando o ponto afiado da lâmina, faça suavemente uma série de cortes ao longo da linha média do músculo superficial para expor a cavidade espinhal e os músculos espinhais profundos. Use um par de pinças para abrir o músculo e visualizar a janela cirúrgica.
    NOTA: O músculo superficial aparecerá rosa claro, enquanto os músculos espinhais profundos aparecerão um cinza-esbranquiçado claro.
  3. Uma vez que os músculos espinhais profundos tenham sido expostos, insira afastadores na janela cirúrgica. Se necessário, use fórceps para agarrar a pele lateral e os músculos para esticá-los ao redor dos dentes dos afastadores. Retraia a janela cirúrgica para 7-8 mm de largura, permitindo uma visão desobstruída da coluna vertebral.
  4. Identifique a segunda vértebra cervical (C2 ou eixo) por seu proeminente processo espinhoso que se projeta dorsalmente e encapsulamento em um grande músculo em forma de cúpula. Use fórceps ou uma sonda contundente para sentir e identificar esse processo, pois este será o marco orientador.
    NOTA: A vértebra C3 adjacente é frequentemente ligeiramente ocluída pelo grande músculo C2; portanto, a dissecção suave do músculo em C3 com fórceps ou um raspador ósseo ajuda a definir a vértebra e ajuda na contagem vertebral.
  5. Usando a borda plana de um raspador de ossos, exponha as vértebras C3-C7 raspando suavemente o músculo espinhal profundo para os lados. Inicie a mediana e raspe lateralmente ao longo da direção paralela às lâminas vertebrais para garantir a exposição adequada, o que permitirá uma distinção clara das lâminas vertebrais. Controle qualquer sangramento com pontas de algodão.
  6. Usando um par de microtesouras, corte cuidadosamente as bordas laterais das lâminas cartilaginosas em C6 e C7. Use C2 como um guia ao contar os níveis vertebrais.
  7. Usando um par de pinças finas, remova cuidadosamente a porção dissecada da lâmina para expor a medula espinhal. Certifique-se de que a janela da coluna vertebral é grande o suficiente para acomodar o local de injeção desejado. Remova quaisquer partes afiadas ou irregulares do osso que possam perfurar a medula espinhal com microtesouras e pinças, conforme descrito acima.
  8. Coloque o animal no suporte craniano estereotáxico, conforme descrito na secção 3.6. Além disso, coloque um pedaço enrolado de gaze sob o tronco do animal para elevar seus quartos traseiros.
    NOTA: A elevação dos quartos traseiros do animal levanta eficazmente o tórax da superfície do suporte para evitar que os movimentos respiratórios afectem a posição da agulha durante a injecção.
  9. Antes de iniciar as injeções, limpe a janela espinhal de qualquer sangue ou líquido cefalorraquidiano aplicando suavemente pontas de algodão e triângulos de Sugi na área sem insultar a medula espinhal. Além disso, crie uma barreira ao redor do perímetro da janela para evitar a oclusão do local da injeção por sangramento contínuo ou vazamento de LCR. Para fazer isso, coloque um pequeno pedaço de algodão absorvível nas porções laterais da janela espinhal.

8. Injeções diretas na medula espinhal visando terminais axônicos

  1. Usando a ponta da agulha de injeção de vidro, aproxime-se da linha média da medula espinhal, identificando a artéria espinhal. No entanto, se a artéria espinhal estiver visivelmente fora do centro ou se desviar de alguma forma, aproxime-se da linha média usando a posição do processo espinhoso C2 e extrapolando-a pelo comprimento da coluna vertebral.
    NOTA: Consulte a secção 5.1 para obter instruções sobre como carregar o vírus.
  2. Uma vez identificada, situe a agulha logo posterior à lâmina C5 na linha média aproximada e use-a como ponto de referência. Em seguida, usando o micromanipulador, mova a agulha lateralmente para a direita em 0,3 mm. Abaixe a agulha até que ela apenas toque a superfície da medula espinhal; a partir desta profundidade, mergulhe a agulha 0,6 mm na medula espinhal. Se necessário, continue a mergulhar a agulha até que ela perfure a medula espinhal; em seguida, retraia ou abaixe a agulha até a profundidade apropriada.
  3. Injete 1 μL de retroAAV2-scCre a 250 nL/min. Após a injeção estar completa, aguarde 2 minutos para que o vírus se difunda na medula espinhal antes de retirar lentamente a agulha. Repita as injeções usando as mesmas coordenadas laterais e de profundidade em mais dois locais dentro da janela espinhal, um no ponto médio e o final logo anterior à lâmina T1.

9. Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios

  1. Retire o animal do suporte estereotáxico e retire os afastadores ou ganchos. Limpe a área da ferida com algumas gotas de solução salina normal estéril.
  2. Suture o couro cabeludo com 4,0 suturas de seda, duas ou 3 suturas no total.
  3. Ao suturar a abertura cervical, use 4,0 intestino crômico para recolocar firmemente as camadas musculares (2 suturas devem ser suficientes). Suture a abertura da pele cervical com seda 4.0 (4 suturas esperadas).
  4. Uma vez que o animal esteja fechado, aplique criteriosamente bandagem líquida nas suturas.
  5. Coloque o animal sob uma lâmpada de aquecimento e monitore-o de perto até que seja totalmente despertado. Uma vez que o animal esteja acordado, em movimento e seco, limpe suavemente as feridas com gaze estéril. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
  6. Devolva o animal à gaiola com sua mãe. Tome cuidado para evitar a negligência e a canibalização infantil da mãe em relação aos filhotes:
    1. Familiarizar os investigadores com a mãe em antecipação à cirurgia através de manuseio suave (5-10 min) duas vezes ao dia, começando uma semana antes da cirurgia.
    2. Devolva os filhotes à gaiola em casa juntos para limitar a interrupção para a mãe.
    3. Injete a mãe com acepromazina 1,5 mg/kg q12 h por via subcutânea no dia da cirurgia.
      NOTA: O manejo da dor serve ao duplo propósito de proporcionar analgesia para os filhotes e incentivar o retorno precoce à atividade, promovendo assim a reintegração com a mãe.
    4. Injetar buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea q8 h a partir da cirurgia por 3 dias no total (dias pós-operatórios 0, 1, 2).

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Resultados

A injeção e o transporte bem-sucedidos do vetor viral devem resultar na transdução de neurônios unilaterais na medula espinhal e no córtex motor. A Figura 4 demonstra a marcação de neurônios CST da camada V no córtex motor de uma seção coronal cerebral expressando Cre-dependentes-DREADDs-mCherry co-injetados com uma injeção contralateral de rCre na coluna. Os cortes foram corados com anticorpo dsRed.

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Discussão

A modulação genética induzível da atividade cerebral com modificadores quimiogenéticos injetáveis é uma ferramenta poderosa no estudo dos vários mecanismos subjacentes à recuperação da LME. A precisão do direcionamento para os receptores acoplados à proteína G induzíveis (DREADDs) é ainda maior quando se considera que o traçado por fluorescência valida a precisão anatômica na histologia. Este artigo discute um método confiável para explorar se a inibição ou estimulação de vias neuronais selecionadas (com DREADDS excitató...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de estudos do Shriners Hospitals for Children SHC-84706.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#11 lâminas de bisturiRobozRS-9801-11Para uso com o bisturi.
#10 Lâminas de bisturiRobozRS-9801-10Para uso com o bisturi.
Seringas de 1 mLBecton, Dickinson and Company309659Para injeção anestésica SC e bolus fluido
4.0 sutura de sedaEthicon771-683GPara fechamento da pele
4.0 Sutura de categute crômicaDemeTECHNN374-16Para religar o músculo durante o fechamento.
48000 Micropipeta BevelerWorld Precision Instruments32416Usado para chanfrar as pontas dos tubos capilares de vidro puxados para formar agulhas de vidro funcionais.
Solução de Iodo a 5%Purdue Products L.P.L01020-08Para uso na esterilização do local cirúrgico.
70% EtanolN/AN/APara esterilização de agulhas de vidro recém-preparadas, modelos animais durante a preparação cirúrgica
Cetamina (Ketaset)Zoetis240048Para manter o animal no plano correto de consciência durante a cirurgia.
Esterilizador de esferasCellPoint5-1450Para esterilizar instrumentos cirúrgicos por calor.
Balança DigitalOkausREV.005Para pesagem do animal durante o preparo cirúrgico.
Acessório de agulha flexívelWorld Precision InstrumentsMF34G-5Para limpar agulhas de vidro e carregar óleo vermelho em agulhas de vidro.
Instrumentos capilares de vidro4878precisão do mundodos tubos para agulhas de vidro puxadas - deve ser projetado para injetores do nanolitro.
HemostatsRobozRS-7231Para uso geral em cirurgia.
Fórceps Curvo de Ponta MédiaRobozRS-5136Para uso geral em cirurgia.
Micromanipulador com escala de nônioKanetecN/APara direcionamento preciso durante a cirurgia.
MicroscissorsRobozRS-5621Para cortar chiados de vidro de tubos capilares de vidro recém-puxados.
Instrumento estereotáxico padrãode laboratório Stoelting51600Para manter o suporte estereotáxico neonatal no lugar
Padrão de laboratório com mouse e Adaptador de neonatos51615Para fixação do crânio neonatal durante cirurgia craniana e injeções
Microscópio com luz e escala de nônio OcularLeitz WetzlarN/AUsado para visualizar e medir o chanfro de tubos capilares de vidro puxados em agulhas de vidro funcionais.
Controlador de Bomba MicroSyringeWorld Precision Instruments62403Para controlar a taxa de injeção.
Nanolitro 2000 Cabeça de Bomba InjetoraWorld Precision Instruments500150Para carregar e injetar vírus de forma controlada.
Extrator de agulhasNarishigePC-100Para aquecer e separar tubos capilares de vidro para formar agulhas de vidro.
pAAV-CMV-scCreWu lab Cre plasmídeo
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmídeo # 44361)Bryan Roth ' s laboratório atravésplasmídeo
ParafilmBemisPM-996Para auxiliar no carregamento do vírus no nanoinjetor.
Agulhas PrecisionGlide (25G x 5/8)Becton, Dickinson and Company305122Para uso com as seringas de 1mL e 10 mL para permitir a injeção do modelo animal.
Fórceps de dente de ratoRobozRS-5152Para processos espinhosos de gripe.
Óleo VermelhoN/AN/APara fornecer uma frente para visualização do vírus que entra no tecido durante a injeção.
AfastadoresRobozRS-6510Para manter aberta a ferida cirúrgica.
RongeursRobozRS-8300Para remover o músculo da coluna vertebral durante a cirurgia.
Cabo de lâmina de bisturiRobozRS-9843Para cortar a pele aberta e a almofada de gordura do modelo animal durante a cirurgia.
TesouraRobozRS-5980Para uso geral em cirurgia.
Pinça de remoção de gramposKent ScientificINS750347Para remover os grampos, caso sejam aplicados incorretamente.
Produtos de pesquisa estéreisBP-989Phenixde pano Para fornecer uma superfície estéril para a operação.
Aplicadores estéreis com ponta de algodãoPuritan806-WCPara absorver o sangue na ferida cirúrgica, mantendo a esterilidade.
Gaze estérilCovidien2146Para limpar a área cirúrgica e as ferramentas cirúrgicas, mantendo a esterilidade.
Solução salina estérilBaxter Healthcare Corporation281324Para uso na limpeza do sangue e na reposição de fluidos pós-cirurgia.
Luvas cirúrgicasN/AN/APara uso pelo cirurgião para manter o campo estéril durante a cirurgia.
Almofada de aquecimento cirúrgicaN/AN/APara manter a temperatura corporal do modelo animal durante a cirurgia.
Microscópio cirúrgicoN/AN/APara uma melhor visualização da ferida cirúrgica.
Grampeador cirúrgicoKent ScientificINS750546Para aplicar os grampos.
Almofada de aquecimento de convecção de águaBaxter Healthcare CorporationL1K018Para uso na área de recuperação pós-operatória para manter a temperatura corporal do animal inconsciente.
Ganchos ponderadosN/AN/APara manter aberta a ferida cirúrgica.
Bandagem líquidaNewSkin985838Para aplicar ao longo das suturas após a cirurgia e estimular a cicatrização de feridas
Lâmpada de gaiola de arameZooMedLF10ECPara ajudar os animais a se recuperarem da anestesia e reterem a temperatura corporal quente naturalmente
da espinhais do Addgene DREADD de

Referências

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