Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os fibroblastos são células fenotipicamente altamente dinâmicas, que rapidamente se transviam em miofibroblasts em resposta a estímulos bioquímicos e biomecânicos. A compreensão atual dos processos fibrosos, incluindo a fibrose cardíaca, continua fraca, o que dificulta o desenvolvimento de novas terapias anti-fibrosas. Sistemas de modelos humanos controláveis e confiáveis são cruciais para uma melhor compreensão da patologia da fibrose. Trata-se de um protocolo altamente reprodutível e escalável para gerar tecidos conjuntivos projetados (ECT) em uma placa de fundição de 48 poços para facilitar estudos de fibroblastos e da fisiopatologia do tecido fibroso em um ambiente tridimensional (3D). A ECT é gerada ao redor dos polos com rigidez tabilidade, permitindo estudos sob uma carga biomecânica definida. Sob as condições de carregamento definidas, podem ser estudadas adaptações fenotípicas controladas por interações célula-matriz. Testes paralelos são viáveis no formato 48-well com a oportunidade de análise de tempo-curso de múltiplos parâmetros, como compactação tecidual e contração contra a carga. A partir desses parâmetros, podem ser estudadas propriedades biomecânicas como rigidez tecidual e elasticidade.
Introdução
Um grande obstáculo no estudo de doenças fibrosas é a falta de modelos representativos de tecido 3D humano que forneçam insights sobre o comportamento dos fibroblastos e seus derivados patológicos. Para estudar processos fibrosos, os sistemas de cultura 2D padrão são sub-ideais, uma vez que os fibroblastos isolados transdiferem rapidamente em α-smooth muscle actin (SMA) expressando miofibroblasts quando cultivados em substratos 2D não compatíveis1,2,3. Assim, os fibroblastos na cultura 2D padrão não refletem um fenótipo de tecido "saudável" regular3,4,5,6.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todas as etapas devem ser realizadas em uma classe II de biossegurança instalada em laboratórios sob o nível de contenção 1. Dependendo das regulamentações locais e do tipo de manipulações a serem realizadas, como a transferência de genes mediada por virais, o nível de contenção deve ser aumentado para o nível de biossegurança 2 ou 3. Todas as culturas são mantidas a 37 °C em uma incubadora de cultura celular com uma atmosfera umidificada de 5 % de CO2 no ar. Observe que os volumes (Passos 1 e 2) são fornecidos para um frasco de cultura celular T75. Ajuste os volumes para diferentes formatos de cultura de acordo com as recomendações padrão de cultura celula....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A ECT atinge cerca de 95 % de compactação em comparação com o volume inicial de hidrogel celular-colágeno dentro das primeiras 24 horas. A compactação tecidual e a contração sob condições de controle e na presença de FCS segue-se algumas horas após o fundição e notavelmente aumenta até o dia 5 (Figura 5A). A deflexão do polo pode aumentar ainda mais durante os 15 dias seguintes (20 dias foi o maior tempo testado). A magnitude da deflexão do polo depende do tipo celular, estado celular e cond.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo apresentado descreve a geração de ECT a partir de CF humano primário, o que permite estudar o impacto mecânico dessas células em seu ambiente de matriz extracelular e vice-versa.
Os fibroblastos precisam ser expandidos para produzir células suficientes para os experimentos planejados da ECT (0,75 x 106 células/ECT). Para a melhor reprodutibilidade, é aconselhável pré-cultura de fibroblastos congelados ou derivados de tecido na cultura de monocamadas 2D por uma duração pa.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
GLS e SL redigiram o manuscrito. Todos os autores contribuíram para o desenvolvimento do protocolo e editaram o manuscrito. TM, MT e WHZ são conselheiros científicos da myriamed GmbH. WHZ é o fundador e acionista da Myriamed GmbH.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Cardíaca Alemã (DGK Research Fellowship for GLS) e pela German Research Foundation (DFG através do projeto IRTG 1816 para GLS e AD; DFG 417880571 e DFG TI 956/1-1 para MT; SFB 1002 TP C04 para MT e WHZ; SFB 1002 TP S01 para WHZ; e EXC 2067/1-390729940J para WHZ). A WHZ conta com o apoio do Ministério Federal alemão da Ciência e Educação (BMBF), através do projeto IndiHEART, e da Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ e SL são apoiados pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes de cultura celular: | |||
| Solução Accutase | Merk Millipore | SCR005 | |
| Reagente de dissociação - TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) em pó, glicose alta | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Meio de Crescimento de Fibroblastos-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM Crescimento de Fibroblastos Basal Médio | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Meio de Crescimento de Fibroblastos-2 SingleQuots, Suplementos e Fatores de Crescimento | Lonza | CC-4126 | |
| Meio de Crescimento de Fibroblastos 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Meio Basal de Fibroblastos 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Meio de Crescimento 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| Penicilina (10000 U/mL)/ Estreptomicina (10000 μ L/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| Fontes celulares: | |||
| Fibroblastos cardíacos humanos normais do ventrículo (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| Fibroblastos cardíacos humanos (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| Fibroblastos cardíacos humanos ( HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| Fibroblastos primários do prepúcio humano-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
| Colágeno azeda: | |||
| Colágeno tipo I (bovino) em 0,01 M HCl | LLC Soluções de colágeno | FS22024 | 6-7 mg / mL |
| Colágeno tipo I (cauda de rato) em 0,02 M HCl | Corning | 354236 | ~ 4 mg / mL |
| Drogas: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| Utensílios de plástico: | |||
| Utensílios de plástico para cultura de células | Sarstedt e Starlab | ||
| Filtro de células de malha (Nylon, tamanho dos poros 40 μ m) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| Pipetas sorológicas de abertura ampla, estéreis (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
| Instrumentos específicos: | |||
| Lente CORE bi-telecêntrica para detectores 1/2″ | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| Câmera de varredura de área Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
Referências
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
