Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Um grande obstáculo no estudo de doenças fibrosas é a falta de modelos representativos de tecido 3D humano que forneçam insights sobre o comportamento dos fibroblastos e seus derivados patológicos. Para estudar processos fibrosos, os sistemas de cultura 2D padrão são sub-ideais, uma vez que os fibroblastos isolados transdiferem rapidamente em α-smooth muscle actin (SMA) expressando miofibroblasts quando cultivados em substratos 2D não compatíveis1,2,3. Assim, os fibroblastos na cultura 2D padrão não refletem um fenótipo de tecido "saudável" regular3,4,5,6. Culturas em substratos flexíveis foram introduzidas para simular ^{ambientes de} tecidos não fibrosos (10 kPa) e fibrosos (35 kPa), mas estes não têm a terceira dimensão, o que é muito importante no que diz respeito à fisiopatologia. A engenharia de tecidos proporciona a oportunidade de superar essa limitação, permitindo a cultura do fibroblasto em um contexto de matriz extracelular (ECM) definida e experimentalmente, por alterações na celularidade, composição de ECM e concentração de ECM, tudo isso pode determinar a biomecânica tecidual.

Vários modelos 3D foram gerados usando fibroblastos. Discos flutuantes e microesferas estiveram entre os primeiros e demonstram que o colágeno é remodelado e compactado de forma dependente do tempo. Os fibroblastos exercem forças de tração em fibrilas de colágeno, um processo que pode ser facilitado pela adição de agentes pró-fibrosos, como a transformação do fator de crescimento-beta 1 (TGF-β1)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16}. No entanto, culturas livremente flutuantes não permitem o carregamento externo controlado e, portanto, constituem modelos de encolhimento ou compactação continuamente. Tecidos projetados em forma de folha abriram a possibilidade de estudar a regulação homeostática de propriedades biomecânicas dos tecidos, ou seja, através de testes de cepas uni, bi, multiaxial ou cíclica^17,18,19,20. Esses modelos têm sido usados, por exemplo, para demonstrar a influência do número celular na rigidez tecidual, que foi encontrada para se correlacionar positivamente com a integridade do citoesqueleto e a contratilidade do citosqueleto^18,19. No entanto, é importante notar que as conversões de força-a-tensão são complicadas pela deformação de tecido não uniforme em torno de pontos de fixação de transdutores de força e pontos de ancoragem. Essa limitação inerente pode ser contornada por tecidos em forma de osso de cachorro ou anel, oferecendo alguma aplicação tecidual em pontos de ancoragem^21,22,23. Tecidos em forma de anel podem ser preparados distribuindo um hidrogel de colágeno celular em moldes em forma de anel. À medida que o hidrogel compacta, um tecido se forma em torno da haste interna descompressível do molde, que oferece resistência para maior contração tecidual^24,25,26,27. Após a compactação inicial e tipicamente máxima, os tecidos também podem ser transferidos para espaçadores ajustáveis para conter ainda mais a ECT circular em um comprimento de tecido definido^{3,24,25,26,27,28,29,30}. As propriedades biofísicas podem ser avaliadas em dispositivos de tensão horizontal ou vertical padrão com células de carga apropriadas sob tensão unidirecional ou dinâmica³. Como os tecidos possuem uma estrutura circular em grande parte uniforme e podem ser mantidos em barras/ganchos (pontos de ancoragem e/ou transdutores de força), embora estes ainda possam incluir áreas de compressão ao redor das barras de carregamento, este formato permite uma variação de tensão mais uniforme em comparação com a fixação³. Além disso, tecidos ancorados provocam uma forma celular bipolar, e as células se adaptam às forças teciduais pelo alongamento ao longo das linhas de força promovendo tração anisotrópico^{31,32,33,34,35,36}. Nós já aplicamos ECT em forma de anel de fibroblastos cardíacos de ratos e humanos (CF) em torno de um único polo rígido em experimentos funcionais de tensão de estresse e realizamos ganhos e perdas de estudos de função usando fibroblastos viralmente transduzidos^24,25,26 e estudos farmacológicos³⁷. Além disso, poderíamos identificar diferenças sexuais na fibrose mediada por CF no modelo ECT²⁷.

O seguinte protocolo para a geração de ECT humano, exemplificado com CF humano primário obtido como CF criopreservado de fornecedores comerciais (ver Tabela de Materiais), combina as vantagens dos tecidos em forma de anel com uma maneira fácil e rápida de produzir tecidos macroscópicos para uma plataforma de 48 poços projetada para testes paralelos de alto teor de conteúdo.

É importante ressaltar que o modelo ECT não se restringe a um tipo específico de fibroblasto, com o uso documentado na investigação de outros fibroblastos, por exemplo, fibroblastos de ^pele38,39. Além disso, os fibroblastos das biópsias do paciente funcionam igualmente bem, e a escolha dos fibroblastos depende, em última análise, da questão científica a ser abordada.

A plataforma utilizada para a geração de ECT descrita neste protocolo é uma placa de cultura celular/tecido 3D disponível comercialmente (Figura 1A). Os métodos para a formação, cultivo e monitoramento da formação e função ect sob uma geometria definida e carga mecânica com a ajuda da placa de 48 poços são descritos. A ECT formada é mantida por polos flexíveis integrados e a carga mecânica pode ser ajustada de acordo com o propósito final usando postes com dureza diferentes (Valor 36-89 da Costa A), influenciando suas rigidezs de dobra. Polos com uma costa Um valor de 46 são recomendados. O protocolo é, além disso, compatível com um molde circular personalizado descrito anteriormente, onde o ECT é mantido em torno de uma única haste ^rígida37. As dimensões deste molde são dadas na Figura 1B.

Figura 1: Representação esquemática dos moldes de fundição. (A) Desenho técnico e dimensões de um molde de fundição com dois polos flexíveis. O molde compreende uma circunferência interna delimitada por uma parede curta que contém polos de retenção duplas no corpo principal do molde. Os polos flexíveis têm uma distância horizontal livre entre si e estão conectados na base. O molde permite um volume de fundição de 180 μL. O poço de cada molde permite uma capacidade de volume de pelo menos 600 μL de mídia cultural. Diferentes composições materiais podem ser usadas para produzir polos com rigidezs específicas (por exemplo, TM5MED-TM9MED). (B) Desenho técnico e dimensões de um molde em forma de anel com uma única haste dura. Trata-se de um molde alternativo com geometria distinta e ambiente mecânico, que pode ser usado com o protocolo de fundição ^ECT37. O método de montagem do molde em forma de anel foi adaptado a partir de formatos maiores ^{publicados28,41}. Em suma, o método inclui (1) fixação de espaçadores de moldagem politetrafluoroetileno (PTFE) (8 mm de diâmetro) em polidimtilsiloxano (PDMS, silicone) derramado em pratos de vidro (diâmetro de 60 mm) e (2) fixação de um suporte de poste PDMS (1,5 mm de diâmetro) concentricamente dentro da cavidade oca formada, que serve para (3) segurar um poste removível (tubo de silicone de 4 mm de diâmetro). O resultante do espaço oco permite 180 μL de volume de fundição. Cada prato de vidro pode portar múltiplos moldes impressos (exemplarmente mostrados com 5 moldes) e tem capacidade para até 5 mL de meio de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todas as etapas devem ser realizadas em uma classe II de biossegurança instalada em laboratórios sob o nível de contenção 1. Dependendo das regulamentações locais e do tipo de manipulações a serem realizadas, como a transferência de genes mediada por virais, o nível de contenção deve ser aumentado para o nível de biossegurança 2 ou 3. Todas as culturas são mantidas a 37 °C em uma incubadora de cultura celular com uma atmosfera umidificada de 5 % de _CO2 no ar. Observe que os volumes (Passos 1 e 2) são fornecidos para um frasco de cultura celular T75. Ajuste os volumes para diferentes formatos de cultura de acordo com as recomendações padrão de cultura celular.

1. Descongelamento e pré-revestimento do fibroblasto cardíaco primário (CF) para cultura monocameira (5-12 dias)

NOTA: Como alternativa, as células HFF-1 podem ser usadas seguindo o protocolo padrão de subcultura, conforme aconselhado pelo fornecedor.

1. Prepare o meio de crescimento do fibroblasto (FGM) de acordo com as instruções do fabricante. Opcionalmente, adicione antibióticos como penicilina de 100 U/mL e estreptomicina de 100 mg/mL. Consulte a mistura completa de todos os componentes antes de usar. Armazene a 4 °C por até 14 dias.
2. FGM quente a 20-25 °C.
3. Descongele as células criopreservadas CF (idealmente contendo 1 x ¹⁰⁶ a 2 x ¹⁰⁶/mL células por criovial) em um banho de água a 37 °C por aproximadamente 2 minutos, até que apenas uma pequena quantidade de gelo é deixada no frasco.
4. Utilizando uma pipeta sorológica de 2 mL, transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga estéril apropriado contendo 10 mL de FGM. Para a recuperação ideal da célula, enxágue o criovial com 1 mL de FGM e transfira-o para o tubo de centrífuga. Como as células são muito sensíveis nesta fase, resuspend usando uma pipeta sorológica com uma ponta de furo para minimizar os danos celulares pelo estresse da tesoura.
   NOTA: Se o meio de criopreservação contiver uma alta porcentagem de DMSO, certifique-se de que após a ressuspensão celular na FGM, o teor de DMSO seja inferior a 1 %. Alternativamente, centrifugar as células resuspended a 300 x g para 5 min a 20-25 °C para a troca média. Em seguida, aspire o supernatante cuidadosamente, gire o tubo para desalojar as células pelleted, e resuspensá-las no volume desejado de FGM para semeadura.
5. Sementes 0,5 x ¹⁰⁶ células em 12 mL de FGM em um frasco de cultura celular T75. Se outros labwares forem usados, ajuste o número da célula para manter uma densidade de semeadura de 6,7 x ¹⁰³/^cm2.
6. Substitua a FGM a cada dois dias por 5 dias ou até que as células atinjam 80 % de confluência.
   NOTA: O rendimento celular após a expansão depende principalmente do tamanho da célula e da taxa de proliferação, que pode diferir entre doadores celulares. Normalmente, este procedimento de cultura padrão permite a recuperação de 4 x ¹⁰⁶ a 5 x ¹⁰⁶ CF de um frasco de cultura celular T75 após 5 dias de cultura.

2. Dispersão enzimática de CF humano (10-20 min)

NOTA: Esta etapa visa estabelecer uma suspensão única celular de CF humano para ambas as células monocamadas subculturais e preparação de ECT. Este protocolo foi otimizado para culturas de monocamadas CF humanas nas passagens 3-4. Para uma padronização ideal, recomenda-se sub-cultivo cf em monocamada, pelo menos uma vez antes da preparação da ECT. Este protocolo deve ser otimizado para fibroblastos originários de diferentes doadores e fornecedores. Protocolos alternativos de descolamento podem envolver a substituição de reagentes de dissociação recombinantes baseados em protease por, por exemplo, aqueles que contêm enzimas proteolíticas e colagens.

1. FGM quente, PBS (^Ca2+/^Mg2+-free) e reagente de dissociação celular a 20-25 °C.
2. Aspire o meio das células cultivadas.
3. Lave as células com 6 mL de PBS e aspire.
4. Adicione 6 mL do reagente de dissociação celular às células e incubar por 3 min a 20-25 °C até que as células comecem visivelmente a se desprender.
   NOTA: Dependendo da fonte CF, isso pode levar vários minutos a mais. Alternativamente, se as células não se desprenderem à temperatura ambiente, incubar a 37 °C para melhorar a atividade das enzimas. Para garantir a viabilidade celular ideal, monitore o desprendimento celular sob o microscópio.
5. Neutralizar a atividade enzimática adicionando 6-12 mL de FGM às células desalojadas no reagente de dissociação celular. Pipeta suavemente para cima e para baixo 4-8 vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mL para garantir uma única suspensão celular e transferir células para um tubo fresco de coleta de 50 mL. Verifique o rendimento com a ajuda de um microscópio e um hemócito ou um contador automático de células de acordo com as instruções do fabricante.
6. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g por 5 min a 20-25 °C.
   NOTA: Para atingir um rendimento de células suficientes para a geração da quantidade desejada de ECT, as células podem ser subculturadas em uma diluição de até 1:6 para maior expansão. Deixe que as células cresçam até que 80 % de confluência seja alcançada (aproximadamente 5-6 dias), com a mudança média a cada dois dias. Em seguida, repita a dispersão enzimática e prossiga com a etapa 2.7. para continuar com a preparação da ECT.
7. Aspire o supernatante e aperte o tubo para desalojar a pelota. Resuspentive as células em FGM a 20-25 °C para obter uma suspensão celular de ≥ 15 x ¹⁰⁶/mL (aproximadamente 40 % mais células do que o necessário para a etapa 3.3.). Isso explica a perda de celular devido ao esforço na etapa seguinte.
8. Coe a suspensão da célula através de um coador de células de malha de 40 μm.
   ATENÇÃO: Os aglomerados celulares são prejudiciais para a formação ideal da ECT. Ao usar a dispersão enzimática do protocolo CF humano para fundir diretamente a ECT, a suspensão celular garante a ausência de aglomerados celulares principais que interferem na formação homogênea do tecido. Heterogeneidades comprometerão análises confiáveis de tensão de estresse.
9. Reconte o número da célula e avalie a viabilidade celular para garantir um número de célula confiável em uma suspensão com ≥ 80 % de viabilidade para prosseguir com a preparação da ECT.
   1. Use um contador celular automatizado para avaliar o número do celular e a viabilidade por exclusão de corrente elétrica.
   2. Alternativamente, use o teste de exclusão de corante azul trypan (cancerígeno, categoria 2 - tomar medidas de precaução), com a ajuda de um microscópio e um hemótmetro para a identificação direta e enumeração de células vivas (células intactas que excluem o corante) e células mortas (membranas celulares comprometidas que permitem a ligação do corante às proteínas intracelulares).
10. Reserve o tubo de coleta com suspensão celular a 20-25 °C e prossiga imediatamente com a etapa 3.

3. Preparação de ECT (1 h)

NOTA: A visão geral esquemática da geração ECT é descrita na Figura 2.

Figura 2: Visão geral esquemática da geração ECT. Os fibroblastos são expandidos na cultura 2D antes do uso na geração ECT. Após 5-10 dias, as células são enzimáticamente dispersas e a suspensão celular é reconstituída em uma mistura tamponada contendo colágeno bovino tipo 1. A mistura de hidrogel de colágeno celular é pipetada em poços individuais em uma placa de 48 poços para cultura de tecido 3D, projetada como moldes de fundição com dois polos flexíveis para permitir a suspensão de ECT em um comprimento e carga definidos. A ECT é tipicamente cultivada por 1 a 20 dias antes das medições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Prepare uma solução de estoque DMEM 10x dissolvendo o pó DMEM em _ddH2O (134 mg/mL para a formulação especificada na Tabela de Materiais) sob uma rotação constante de 37 °C por 1 h. Esterilizar por filtragem. O estoque é estável por até 14 dias a 4 °C ou -20 °C por até 12 meses.
2. Prepare-se recentemente 2x DMEM diluindo uma solução de estoque DMEM de 10x e adicionando 20 % (v/v) FCS em _ddH2O. Opcionalmente, use antibióticos como penicilina de 200 U/mL e estreptomicina de 200 mg/mL. Consulte a Tabela 1 para volumes de tubulação. O estoque é estável por até 14 dias a 4 °C.
   NOTA: Realizar etapas 3.1. e 3.2. antes de iniciar a dispersão enzimática das células (passo 2.) para a preparação da ECT.

Tabela 1: Composição de 2x DMEM.

ATENÇÃO: Todos os componentes para a mistura de hidrogel de colágeno celular e tubos de centrífuga devem ser mantidos no gelo antes do uso. Isso ajudará a evitar que a automontagem do colágeno ocorra antes de distribuir a mistura de hidrogel de colágeno celular em todos os moldes de fundição.

3. Com base na Tabela 2, ajuste a suspensão celular a uma densidade de 8,88 x 106 células/mL adicionando FGM a 20-25 °C à suspensão celular a partir da etapa 2.10. Em seguida, mova o tubo de coleta com suspensão celular para gelo.
4. Para preparar a mistura de hidrogel ECT, pré-esfrie um tubo de centrífugas de 50 mL no gelo e adicione a ele os diferentes componentes listados na Tabela 2 na seguinte ordem, evitando a formação de bolhas de ar.
   NOTA: O número máximo de ECT a ser preparado depende do número total de células determinado na etapa 2.9. Utilize 0,3 mg de colágeno por ECT, obtido a partir de uma solução de estoque contendo 6-7 mg/mL. A concentração da solução de estoque de colágeno determina o volume necessário para obter um conteúdo ideal de colágeno ECT. Os volumes dos outros componentes do hidrogel ECT devem ser adaptados em conformidade. Consulte a Tabela 2 para volumes ajustados de acordo com uma solução de estoque de colágeno de 6,49 mg/mL. Os volumes descritos na Tabela 2 são usados neste protocolo como uma diretriz exemplar.
   1. Pipeta o hidrogel ácido solúvel-colágeno tipo 1 usando uma pipeta sorológica com uma ponta larga de furo.
   2. Ajuste o teor de sal da solução de colágeno adicionando o DMEM 2x enquanto mistura suavemente girando o tubo.
   3. Neutralize o pH adicionando 0,2 M NaOH enquanto mistura suavemente girando o tubo. O indicador vermelho fenol passará de amarelo para vermelho.
      NOTA: O volume NaOH deve ser titulado para cada lote de colágeno individual para a neutralização ideal do pH. A neutralização depende de fatores como tipo tampão e preparação, bem como concentração absoluta de colágeno, e afeta a montagem da matriz de colágeno e a viabilidade ^celular23,40. Uma vez que o conteúdo iônico é aumentado pela adição de DMEM e o pH é neutralizado, a auto-montagem do colágeno segue e não deve ser interrompida. Portanto, realize o seguinte rapidamente e sem pausas.
   4. Adicione a suspensão celular (da etapa 3.3) em sentido de gota enquanto se mistura suavemente girando o tubo.

Tabela 2: Preparação do hidrogel ECT (incluindo um excedente de 10 % contabilizando erros de tubulação).

5. Misture toda a suspensão por tubos suavemente para cima e para baixo apenas uma vez, usando uma pipeta sorológica com uma ponta larga para evitar a formação de bolhas e minimizar o estresse da tesoura. Certifique-se de uma mistura completa girando suavemente o tubo 10 vezes e mantenha o tubo de centrífugas de 50 mL contendo mistura de hidrogel ECT no gelo durante todo o processo de fundição.
6. Pré-molhe uma ponta de pipeta de 1 mL com mistura de hidrogel ECT e distribua 180 μL dele uniformemente em cada molde da placa de fundição de 48 poços, evitando forças excessivas de cisalhamento que possam afetar a integridade da montagem da matriz de colágeno e garantindo que toda a placa seja feita em 15-20 minutos.
   NOTA: O volume de fundição recomendado é de 180 μL, mas pode ser estendido para 200 ^μL38. Portanto, quando preferido, os volumes na Tabela 2 podem ser adaptados a 200 μL de forma a manter as mesmas concentrações e razão entre células e colágeno.
   1. Certifique-se de que um laço completo seja formado dentro do molde (Figura 3A). Se a mistura de hidrogel ECT for aplicada de forma descontínua, será impedida uma formação completa do anel ECT (Figura 3B).
   2. Evite a tubulação no poço interno (Figura 3C) e a formação de bolhas durante a pipetação (Figura 3D), para garantir uma formação homogênea e funcional do tecido.

Figura 3: Fundição, formação de hidrogel e condensação de ECT em formato multi-bem. Os painéis superiores exemplificam a aparência de ECT diretamente após a fundição. Os painéis do meio exemplificam o aparecimento de ECT após a incubação por 20 minutos a 37 °C. Os painéis inferiores exemplificam o estado de compactação da ECT 24h após a preparação, retirado dos polos. (A) Formação adequada de ECT entre dois polos durante as primeiras 24 h. (B-D) Exemplos de erros de pipetação que impedem a formação adequada da ECT. As setas branca e preta apontam para defeitos estruturais da ECT devido à fundição inadequada. Barra de escala: 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Coloque cuidadosamente a placa de fundição de 48 poços dentro da incubadora de cultura celular e deixe a mistura de hidrogel ECT reconstituída por 15-30 min. Após a incubação, ele aparecerá em gel e opaco (Figura 3, painel do meio).
8. Adicione 600 μL de FGM quente de 37 °C por poço, sem encanar o meio de cultura diretamente na ECT formando, pois isso pode resultar em ruptura tecidual. Adicione suavemente o meio de cultura ao longo da parede do poço, pois neste ponto, a ECT também não deve ser separada da parte inferior (Figura 4).

Figura 4: Adição adequada e inadequada do meio de cultura ao ECT recém-lançado. (A) Ao adicionar o meio de cultura após a solidificação inicial da ECT (20 minutos após a fundição), a ECT condensadora deve ser deixada intacta na parte inferior do poço. Durante as próximas 24 horas, a compactação da matriz movida por células fará com que o ECT deslize pela rampa. A posição final da ECT é controlada por cavidades côncavas em altura de polo definida; isso garante que todos os ECT se estabeleçam na mesma posição para permitir uma comparação da atividade de dobra de polo na cultura ECT paralela. (B) Formação de ECT desvinculada da parte inferior, adicionando o meio de cultura muito rapidamente. ECT flutuante será compacto no nível médio de cultura superior. As forças de contratação de polo não serão diretamente comparáveis se a ECT se estabelecer em posições diferentes. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Incubar por 24 h.
10. Substitua o meio todos os dias depois disso, com 500 μL de FGM até a análise.
    NOTA: Após a fase inicial da gelação independente das células, a CF humana começa a compactar ainda mais a mistura de hidrogel ECT. Dentro de 24 horas, a ECT deve aparecer notavelmente compactada e elevada ao nível em que é mantida nos polos flexíveis (Figura 3 e Figura 4A).

4. Avaliação da compactação da ECT medindo a área transversal (CSA) (5 min por ECT).

NOTA: A compactação tecidual começa imediatamente após a montagem do colágeno e é particularmente significativa durante as primeiras horas. A compactação descreve mudanças desencadeadas principalmente pela compressão orientada por células da matriz perpendicularmente ao eixo longo do tecido. Este parâmetro é avaliado pela determinação da área transversal (CSA) da ECT.

1. Nos pontos de tempo desejados, use um microscópio estéreo para gravar imagens macroscópicas das vistas superiores e laterais do ECT (Figura 5C).
   NOTA: A ECT pode ser imagem dentro dos poços de cultivo da placa de fundição de 48 poços. Alternativamente, transfira o ECT para uma placa multi-bem inferior clara para imagens. Aconselha-se a imagem do ECT nos polos como a remoção das que leva à perda da pré-carga e, consequentemente, em um curto período, o tecido pode contrair ainda mais com eventual torção devido à liberação de tensão, o que pode dificultar a imagem adequada para análises de dimensões.
2. Use um programa de processamento de imagens para realizar uma análise de varredura de linha. Defina uma escala e use a ferramenta Linha Reta para rastrear e medir os diâmetros da ECT no mínimo 6 posições por braço em cada plano de imagem (Figura 5B,C).
3. Calcule o diâmetro médio dos planos de visão superior e lateral e calcule CSA de acordo com uma equação de área elíptica:
   

Figura 5: Monitoramento da compactação da ECT ao longo do tempo por análise de área transversal (CSA). A ECT foi gerada utilizando CF humano e colágeno tipo I e cultivada em torno de dois polos flexíveis por 5 dias. (A) São apresentadas imagens representativas do controle ECT colocadas em moldes flexíveis durante um período de 5 dias. Barra de escala = 5 mm. Essas imagens de campo brilhante também podem ser usadas para determinar a variação de deflexão do polo para estimar a contração do tecido. (B) Representação esquemática da área transversal de um ECT (diâmetro da vista superior em diâmetro de vista verde e lateral em rosa). (C) Imagens macroscópicas de vistas superiores e laterais de um ECT obtidas com um estereótipo e exemplo correspondente de análise de varredura de linha dos diâmetros dos tecidos usando um programa de processamento de imagem. Barra de escala = 2 mm. Os diâmetros médios são calculados a partir da média de todos os comprimentos de linha medidos em cada plano de visão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Monitoramento da contração da ECT por análise de deflexão de polo (15 min por placa de fundição de 48 poços).

NOTA: A cultura ECT é normalmente realizada por 5 dias, mas pode ser estendida por pelo menos até 20 dias. A deflexão do polo ocorre devido à contração tecidual impulsionada pela força de contração celular na direção da tensão ao longo do eixo longo do tecido. A avaliação da contração da ECT pode ser realizada por imagem em qualquer dia durante a cultura.

1. Imagem a placa de fundição de 48 poços sob um dispositivo de gravação com uma câmera de varredura de área integrada colocada a uma distância fixa, equipada com um sensor de imagem monocromática de alta resolução (≥ 5 megapixels).
   1. Use uma fonte de luz quase UV (~390 nm) para maximizar o contraste e, assim, facilitar a detecção automatizada das pontas dos polos, pois eles contêm um corante fluorescente (Figura 6A,C). Se disponíveis, as lentes telecêntricas são recomendadas para imagens, pois minimizam as distorções de imagem.
      NOTA: Alternativamente, podem ser utilizadas imagens macroscópicas de campo brilhante de poços únicos ou da placa completa acompanhadas de uma barra de escala para a análise (Figura 5A).
2. Meça a distância entre os polos dos registros diários (Figura 6C,D) usando um programa de processamento de imagem ou análise automatizada, executando imagens gravadas em software capaz de detectar pixels brilhantes de alto contraste em um fundo escuro.
3. Calcule a deflexão do polo através da variação da distância dos polos quando comparado com a distância inicial no dia zero.

Figura 6: Visão geral esquemática da avaliação da contração tecidual de acordo com a deflexão do polo. (A) Gravação exemplar de alta resolução de postes fluorescentes na placa de fundição de 48 poços sob excitação de luz quase UV. Este método é preferido em vez de imagens de campo brilhante para um rastreamento automatizado de ponta de poste mais preciso. (B) Os desenhos esquemáticos demonstram como a compactação e contração da ECT leva à dobra do polo. (C) Uma linha exemplar da mesma placa registra no dia 0 e dia 5 após o casting. D. O close-up mostra como medir a distância (linha rosa) entre os polos usando um programa de processamento de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Considere que a deflexão do polo medida pela imagem de ponta brilhante é apenas uma estimativa da contração tecidual devido à diferença nos planos de imagem. Além disso, note que a aplicação de substâncias pró-fibrosas como o TGF-β1 durante a cultura tecidual aumenta a compactação e contração da ECT e pode, em última instância, levar à interrupção precoce do tecido.

6. Avaliação da rigidez e outras propriedades biomecânicas da ECT por medição de tração destrutiva e análise de tensão de estresse (20 min por ECT)

NOTA: Uma curva ideal de tensão pode exibir três regiões: região do dedo do dedo do dedo, região elástica e região plástica. Um exemplo de curva de tensão de estresse ECT é mostrado na Figura 7. A análise de uma curva de tensão permite extrair importantes parâmetros biomecânicos do tecido, como por exemplo, rigidez, força máxima, elasticidade, plasticidade, extensibilidade, resiliência e dureza.

1. Colher ECT puxando a maca, incluindo ECT, para fora de seu poço, usando fórceps. A maca pode então ser mantida em sua base, e o ECT escorregou sobre as pontas da maca usando um gancho fino ou ponta de pipeta.
2. Transfira o ECT para dois ganchos fixados no braço estacionário e o braço transdutor de um reômetro de análise mecânica dinâmica extensal (DMA) equipado com um banho de órgão temperado de 37 °C (feito sob medida) preenchido com PBS (Figura 7A).

Figura 7: Análise de medição de tração destrutiva ECT. (A) Medição de tração destrutiva reológica em um reômetro de análise mecânica dinâmica extensal (DMA). Visão superior de alta potência: ECT após a montagem em _L0 em uma câmara ambiental e conectada a um polo superior e inferior para análises de tensão de estresse. Vista de alta potência inferior: ECT tensa a uma taxa constante de 0,03 mm/s até o ponto de falha na tensão final. Barras de escala = 5 mm. (B) Diagrama de tensão de estresse de um ECT mostrando os principais parâmetros medidos. O limite superior da região elástica corresponde ao ponto de rendimento e a região plástica é composta entre o ponto de rendimento e o ponto de falha (ductilidade). A inclinação da fase linear da região elástica corresponde ao módulo do Jovem refletindo a rigidez tecidual. A força máxima corresponde ao estresse máximo de tração que um tecido pode suportar. Devido à microfratura de fibras, o estresse diminui até que o tecido atinja o ponto de falha. Isso ocorre na última extensibilidade da tensão (extensibilidade) onde uma queda repentina do estresse é observada devido à ruptura do tecido. A resiliência corresponde à energia (kJ/^m3) absorvida pelo tecido antes da deformação permanente (até o ponto de rendimento) e é dada pela área sob a curva (AUC) até a tensão do ponto de rendimento. A dureza corresponde à energia total (kJ/^m3) que o tecido pode absorver até a ruptura e é dado pelo AUC até a tensão final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Coloque o reômetro para aplicar tensão uniaxial a uma taxa linear constante de aproximadamente 1 % da distância inicial entre os ganchos por segundo. Uma taxa de alongamento constante de 0,03 mm/s pode ser usada com as dimensões típicas de ECT. Tare o transdutor, inicie o trecho e regise até o ponto de ruptura da ECT.
   ATENÇÃO: As imagens macroscópicas da ECT (etapa 4.1.) devem ser registradas antes do teste de tração, pois o CSA é necessário para a normalização dos dados.
   NOTA: A análise de tensão de estresse, incluindo o cálculo do CSA, pode ser processada mais tarde no momento após o teste de tração. Use um software de planilha e um software de análise estatística para análise dos dados.
4. Normalizar valores de força medidos (mN) por ECT por seu CSA (^mm2) para obter valores de estresse (kPa).
5. Valores de estresse de enredo contra a tensão (uma medida geométrica de deformação tecidual dada pela distância relativa entre o gancho superior e inferior) em um gráfico XY.
   NOTA: O comprimento inicial do tecido (distância entre o gancho superior e inferior) imediatamente antes do trecho seguir, _L0, deve ser ajustado manualmente e corresponde ao início da região do dedo do pé (a região do dedo do pé pode estar ausente dependendo das propriedades teciduais). Cada valor de ponto de tensão deve ser calculado de acordo com a equação, na qual _Ltotal é a lacuna total em cada ponto de medição:
   
   Ao traçar os dados, use o valor de estresse no _L0 selecionado para subtração de fundo.
6. Determine diferentes parâmetros biomecânicos da curva de tensão de estresse (use a Figura 7B como exemplo).
   NOTA: Uma curva de tensão pode exibir três regiões: dedo do dedo dom, elástico e plástico. O limite superior da região elástica, antes do tecido iniciar a microfracisão, corresponde ao ponto de rendimento, e sua tensão é uma medida de elasticidade tecidual. A região plástica é composta entre o ponto de rendimento e o ponto de falha. O ponto posterior corresponde a uma queda repentina do estresse devido à ruptura do tecido, definindo a mancha final, que é uma medida de extensibilidade tecidual. O terceiro ponto de medição corresponde à força máxima, que é definida pelo maior estresse que o tecido pode suportar sem quebrar durante o trecho. A resiliência e resistência, dada pela área sob a curva, corresponde à energia absorvida pelo tecido até o ponto de rendimento e ao ponto de falha, respectivamente. Para cada curva obtida, a inclinação da parte linear da região elástica corresponde ao módulo do Jovem, também conhecido como módulo elástico, e é uma propriedade mecânica que mede a rigidez do tecido.
   1. Extrair de cada curva os valores XY (tensão e estresse, respectivamente) do ponto de rendimento, ponto de falha e ponto máximo de estresse.
   2. Avalie o módulo do Jovem (rigidez em kPa = mN·^mm-2) de cada ECT a partir da inclinação da parte linear da região elástica, traçando uma regressão linear daquela região.
   3. Use um programa estatístico para calcular a área sob a curva (AUC) para determinar tanto a resiliência quanto a dureza, até o ponto de rendimento e o ponto de falha, respectivamente. Compute AUC pelo método trapezoidal. Defina a linha de base a zero e considere apenas os picos acima da linha de base, que são pelo menos 10 % da distância do valor mínimo ao máximo no eixo Y.
      NOTA: O moduli de resiliência e dureza são dados por σ × ε, onde σ é estresse (kPa) e ε é a tensão (L/_ΔL, mm/mm). Assim, resiliência e dureza são a energia em kJ/^m3 (kPa = kN·^m-2 = kN·m·^m-3 = kJ/m·m·^m-3 = kJ/^m3) absorvida pelo tecido antes da deformação permanente e até a ruptura, respectivamente.

A ECT atinge cerca de 95 % de compactação em comparação com o volume inicial de hidrogel celular-colágeno dentro das primeiras 24 horas. A compactação tecidual e a contração sob condições de controle e na presença de FCS segue-se algumas horas após o fundição e notavelmente aumenta até o dia 5 (Figura 5A). A deflexão do polo pode aumentar ainda mais durante os 15 dias seguintes (20 dias foi o maior tempo testado). A magnitude da deflexão do polo depende do tipo celular, estado celular e condições de cultura celular e tecidual. Normalmente, as propriedades biomecânicas são medidas no dia 5 da cultura, mas qualquer ponto de tempo pode ser selecionado. Como exemplo da aplicabilidade do modelo ECT, mostra-se como este protocolo pode auxiliar no estudo do impacto da integridade do citoesqueleto actin na função tecidual. A ECT foi preparada na placa de fundição de 48 poços e tratada com o inibidor de polimerização de actina Latrunculin A (Lat-A, 7 ng/mL). O tratamento reduziu a compactação ECT, conforme indicado pelo aumento significativo de 1,7 vezes no CSA em relação ao controle (Figura 8A,B). Além disso, a contração dos tecidos foi avaliada durante os 5 dias de cultura. Na ausência da droga, a contração aumentou gradualmente até o dia 5, atingindo ~40 % de contração. A contração do tecido afetou lat-A, resultando em apenas ~20 % de contração máxima (Figura 8A,C). Testes de tensão unidirecional destrutivos foram realizados no dia 5. A partir de uma curva típica de tensão de estresse como as obtidas para ECT (Figura 7B), vários parâmetros biomecânicos podem ser extraídos. Exemplarmente, mostra-se que a inibição da polimerização da actina levou a uma redução significativa de ~50 % na rigidez tecidual sobre o controle (Figura 8D). Juntos, os dados exemplares mostram que a integridade citoesquelética actin é essencial para a compactação, contração e endurecimento da ECT.

Figura 8: A inibição da polimerização da actina influencia a compactação, contração e rigidez da ECT. ECT gerada com CF humano e tipo colágeno I foram cultivados por 5 dias em torno de dois polos flexíveis na presença ou ausência de 7 ng/mL Latrunculin-A (Lat-A). (A) São mostradas imagens representativas do controle e da ECT tratadas colocadas em polos flexíveis após 5 dias. Barra de escala = 2 mm. (B) Áreas transversais (CSA) foram calculadas a partir de imagens macroscópicas (n = 22). (C) A deflexão do polo foi calculada durante um período de 5 dias. Os valores são dados como meios±SEM (n = 22). Mudanças significativas foram avaliadas pela ANOVA de 2 vias com os testes pós hoc de Dunnett (*p<0,05 vs. Control) para múltiplas comparações. (D) Os tecidos foram submetidos a medições de tração reológica destrutiva e os moduli do Young foram recuperados das análises de tensão de estresse (n = 16). (B e D) As caixas indicam o quartil inferior e superior. A linha horizontal em cada caixa representa a mediana CSA e rigidez, respectivamente. Os meios para cada grupo são indicados por +. As linhas verticais que se estendem de cada caixa representam os valores mínimos e máximos medidos. Mudanças significativas em B e D foram avaliadas pelo teste t-t do aluno não remunerado de duas caudas (*p<0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

GLS e SL redigiram o manuscrito. Todos os autores contribuíram para o desenvolvimento do protocolo e editaram o manuscrito. TM, MT e WHZ são conselheiros científicos da myriamed GmbH. WHZ é o fundador e acionista da Myriamed GmbH.