Name: Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a criar tecidos conjuntivos de engenharia derivados de fibroblastos humanos para triagem de fármacos. Este protocolo reprodutível permite comparar até 48 condições em paralelo, facilitando estudos mecanicistas de doenças fibroticas.

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Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Cardíaca Alemã (DGK Research Fellowship for GLS) e pela German Research Foundation (DFG através do projeto IRTG 1816 para GLS e AD; DFG 417880571 e DFG TI 956/1-1 para MT; SFB 1002 TP C04 para MT e WHZ; SFB 1002 TP S01 para WHZ; e EXC 2067/1-390729940J para WHZ). A WHZ conta com o apoio do Ministério Federal alemão da Ciência e Educação (BMBF), através do projeto IndiHEART, e da Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ e SL são apoiados pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK).

GLS e SL redigiram o manuscrito. Todos os autores contribuíram para o desenvolvimento do protocolo e editaram o manuscrito. TM, MT e WHZ são conselheiros científicos da myriamed GmbH. WHZ é o fundador e acionista da Myriamed GmbH.

O protocolo apresentado descreve a geração de ECT a partir de CF humano primário, o que permite estudar o impacto mecânico dessas células em seu ambiente de matriz extracelular e vice-versa.
Os fibroblastos precisam ser expandidos para produzir células suficientes para os experimentos planejados da ECT (0,75 x 106 células/ECT). Para a melhor reprodutibilidade, é aconselhável pré-cultura de fibroblastos congelados ou derivados de tecido na cultura de monocamadas 2D por uma duração pa...

Um grande obstáculo no estudo de doenças fibrosas é a falta de modelos representativos de tecido 3D humano que forneçam insights sobre o comportamento dos fibroblastos e seus derivados patológicos. Para estudar processos fibrosos, os sistemas de cultura 2D padrão são sub-ideais, uma vez que os fibroblastos isolados transdiferem rapidamente em α-smooth muscle actin (SMA) expressando miofibroblasts quando cultivados em substratos 2D não compatíveis1,2,3. Assim, os fibroblastos na cultura 2D padrão não refletem um fenótipo de tecido "saudável" regular3,4,5,6. Culturas em substratos flexíveis foram introduzidas para simular ambientes de tecidos não fibrosos (10 kPa) e fibrosos (35 kPa), mas estes não têm a terceira dimensão, o que é muito importante no que diz respeito à fisiopatologia. A engenharia de tecidos proporciona a oportunidade de superar essa limitação, permitindo a cultura do fibroblasto em um contexto de matriz extracelular (ECM) definida e experimentalmente, por alterações na celularidade, composição de ECM e concentração de ECM, tudo isso pode determinar a biomecânica tecidual.
Vários modelos 3D foram gerados usando fibroblastos. Discos flutuantes e microesferas estiveram entre os primeiros e demonstram que o colágeno é remodelado e compactado de forma dependente do tempo. Os fibroblastos exercem forças de tração em fibrilas de colágeno, um processo que pode ser facilitado pela adição de agentes pró-fibrosos, como a transformação do fator de crescimento-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. No entanto, culturas livremente flutuantes não permitem o carregamento externo controlado e, portanto, constituem modelos de encolhimento ou compactação continuamente. Tecidos projetados em forma de folha abriram a possibilidade de estudar a regulação homeostática de propriedades biomecânicas dos tecidos, ou seja, através de testes de cepas uni, bi, multiaxial ou cíclica17,18,19,20. Esses modelos têm sido usados, por exemplo, para demonstrar a influência do número celular na rigidez tecidual, que foi encontrada para se correlacionar positivamente com a integridade do citoesqueleto e a contratilidade do citosqueleto18,19. No entanto, é importante notar que as conversões de força-a-tensão são complicadas pela deformação de tecido não uniforme em torno de pontos de fixação de transdutores de força e pontos de ancoragem. Essa limitação inerente pode ser contornada por tecidos em forma de osso de cachorro ou anel, oferecendo alguma aplicação tecidual em pontos de ancoragem21,22,23. Tecidos em forma de anel podem ser preparados distribuindo um hidrogel de colágeno celular em moldes em forma de anel. À medida que o hidrogel compacta, um tecido se forma em torno da haste interna descompressível do molde, que oferece resistência para maior contração tecidual24,25,26,27. Após a compactação inicial e tipicamente máxima, os tecidos também podem ser transferidos para espaçadores ajustáveis para conter ainda mais a ECT circular em um comprimento de tecido definido3,24,25,26,27,28,29,30. As propriedades biofísicas podem ser avaliadas em dispositivos de tensão horizontal ou vertical padrão com células de carga apropriadas sob tensão unidirecional ou dinâmica3. Como os tecidos possuem uma estrutura circular em grande parte uniforme e podem ser mantidos em barras/ganchos (pontos de ancoragem e/ou transdutores de força), embora estes ainda possam incluir áreas de compressão ao redor das barras de carregamento, este formato permite uma variação de tensão mais uniforme em comparação com a fixação3. Além disso, tecidos ancorados provocam uma forma celular bipolar, e as células se adaptam às forças teciduais pelo alongamento ao longo das linhas de força promovendo tração anisotrópico31,32,33,34,35,36. Nós já aplicamos ECT em forma de anel de fibroblastos cardíacos de ratos e humanos (CF) em torno de um único polo rígido em experimentos funcionais de tensão de estresse e realizamos ganhos e perdas de estudos de função usando fibroblastos viralmente transduzidos24,25,26 e estudos farmacológicos37. Além disso, poderíamos identificar diferenças sexuais na fibrose mediada por CF no modelo ECT27.
O seguinte protocolo para a geração de ECT humano, exemplificado com CF humano primário obtido como CF criopreservado de fornecedores comerciais (ver Tabela de Materiais), combina as vantagens dos tecidos em forma de anel com uma maneira fácil e rápida de produzir tecidos macroscópicos para uma plataforma de 48 poços projetada para testes paralelos de alto teor de conteúdo.
É importante ressaltar que o modelo ECT não se restringe a um tipo específico de fibroblasto, com o uso documentado na investigação de outros fibroblastos, por exemplo, fibroblastos de pele38,39. Além disso, os fibroblastos das biópsias do paciente funcionam igualmente bem, e a escolha dos fibroblastos depende, em última análise, da questão científica a ser abordada.
A plataforma utilizada para a geração de ECT descrita neste protocolo é uma placa de cultura celular/tecido 3D disponível comercialmente (Figura 1A). Os métodos para a formação, cultivo e monitoramento da formação e função ect sob uma geometria definida e carga mecânica com a ajuda da placa de 48 poços são descritos. A ECT formada é mantida por polos flexíveis integrados e a carga mecânica pode ser ajustada de acordo com o propósito final usando postes com dureza diferentes (Valor 36-89 da Costa A), influenciando suas rigidezs de dobra. Polos com uma costa Um valor de 46 são recomendados. O protocolo é, além disso, compatível com um molde circular personalizado descrito anteriormente, onde o ECT é mantido em torno de uma única haste rígida37. As dimensões deste molde são dadas na Figura 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática dos moldes de fundição. (A) Desenho técnico e dimensões de um molde de fundição com dois polos flexíveis. O molde compreende uma circunferência interna delimitada por uma parede curta que contém polos de retenção duplas no corpo principal do molde. Os polos flexíveis têm uma distância horizontal livre entre si e estão conectados na base. O molde permite um volume de fundição de 180 μL. O poço de cada molde permite uma capacidade de volume de pelo menos 600 μL de mídia cultural. Diferentes composições materiais podem ser usadas para produzir polos com rigidezs específicas (por exemplo, TM5MED-TM9MED). (B) Desenho técnico e dimensões de um molde em forma de anel com uma única haste dura. Trata-se de um molde alternativo com geometria distinta e ambiente mecânico, que pode ser usado com o protocolo de fundição ECT37. O método de montagem do molde em forma de anel foi adaptado a partir de formatos maiores publicados28,41. Em suma, o método inclui (1) fixação de espaçadores de moldagem politetrafluoroetileno (PTFE) (8 mm de diâmetro) em polidimtilsiloxano (PDMS, silicone) derramado em pratos de vidro (diâmetro de 60 mm) e (2) fixação de um suporte de poste PDMS (1,5 mm de diâmetro) concentricamente dentro da cavidade oca formada, que serve para (3) segurar um poste removível (tubo de silicone de 4 mm de diâmetro). O resultante do espaço oco permite 180 μL de volume de fundição. Cada prato de vidro pode portar múltiplos moldes impressos (exemplarmente mostrados com 5 moldes) e tem capacidade para até 5 mL de meio de cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Reagentes de cultura celular:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Solução Accutase</td><td>Merk Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação - TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) em pó, glicose alta</td><td>Gibco</td><td>12100061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 Meio de Crescimento de Fibroblastos-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>FBM&nbsp; Crescimento de Fibroblastos Basal Médio</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 Meio de Crescimento de Fibroblastos-2 SingleQuots,&nbsp; Suplementos e Fatores de Crescimento</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Fibroblastos 3 KIT</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>Meio Basal de Fibroblastos 3</td><td>PromoCell</td><td>C-23230</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento 3 SupplementPack</td><td>PromoCell</td><td>C-39350</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10000 U/mL)/ Estreptomicina (10000 &mu; L/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fontes celulares:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos cardíacos humanos normais do ventrículo (NHCF-V)</td><td>Lonza</td><td>CC-2904</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos cardíacos humanos (HCF-c)</td><td>PromoCell</td><td>C-12375</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos cardíacos humanos ( HCF-p)</td> <td>PromoCell</td><td>C-12377</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos primários do prepúcio humano-1 (HFF-1)</td> <td>ATCC</td><td>SCRC- 1041</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno azeda:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Colágeno tipo I (bovino) em 0,01 M HCl</td><td>LLC Soluções de colágeno</td><td>FS22024</td><td>6-7 mg / mL</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I (cauda de rato) em 0,02 M HCl</td><td>Corning</td><td>354236</td> <td>~ 4 mg / mL</td></tr><tr><td>Drogas:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin-A (Lat-A)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Utensílios de plástico:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Utensílios de plástico para cultura de células</td><td>Sarstedt e Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de malha (Nylon, tamanho dos poros 40 &mu; m)</td> <td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>myrPlate-uniform</td><td>myriamed GmbH</td><td>TM5 med</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de abertura ampla, estéreis (10 mL)</td> <td>Corning</td><td>07-200-619</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos específicos:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lente CORE bi-telecêntrica para detectores 1/2&Prime;</td><td>OptoEngineering</td><td>TCCR12096</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de varredura de área Basler ace acA4024</td><td>Basler</td><td>107404</td><td></td></tr></tbody></table>

tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Os fibroblastos são células fenotipicamente altamente dinâmicas, que rapidamente se transviam em miofibroblasts em resposta a estímulos bioquímicos e biomecânicos. A compreensão atual dos processos fibrosos, incluindo a fibrose cardíaca, continua fraca, o que dificulta o desenvolvimento de novas terapias anti-fibrosas. Sistemas de modelos humanos controláveis e confiáveis são cruciais para uma melhor compreensão da patologia da fibrose. Trata-se de um protocolo altamente reprodutível e escalável para gerar tecidos conjuntivos projetados (ECT) em uma placa de fundição de 48 poços para facilitar estudos de fibroblastos e da fisiopatologia do tecido fibroso em um ambiente tridimensional (3D). A ECT é gerada ao redor dos polos com rigidez tabilidade, permitindo estudos sob uma carga biomecânica definida. Sob as condições de carregamento definidas, podem ser estudadas adaptações fenotípicas controladas por interações célula-matriz. Testes paralelos são viáveis no formato 48-well com a oportunidade de análise de tempo-curso de múltiplos parâmetros, como compactação tecidual e contração contra a carga. A partir desses parâmetros, podem ser estudadas propriedades biomecânicas como rigidez tecidual e elasticidade.

A ECT atinge cerca de 95 % de compactação em comparação com o volume inicial de hidrogel celular-colágeno dentro das primeiras 24 horas. A compactação tecidual e a contração sob condições de controle e na presença de FCS segue-se algumas horas após o fundição e notavelmente aumenta até o dia 5 (Figura 5A). A deflexão do polo pode aumentar ainda mais durante os 15 dias seguintes (20 dias foi o maior tempo testado). A magnitude da deflexão do polo depende do tipo celular, estado celular e cond...

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Este protocolo permite que o fibroblasto construa e organize seu próprio ambiente em condições mecânicas definidas. Estes resultam em tecidos anisotrópicos com rigidez e composições matriciais comparáveis ao ambiente natural da célula. Este método permite comparar até 48 condições em paralelo.É flexível em relação ao tipo de célula usada e às condições de cultura. Usando apenas alguns componentes bem definidos, é reprodutível entre laboratórios. Aplicando fatores pró-fibrosos ou antifibrotic, este protocolo pode ser usado para estudar os processos e terapias subjacentes de doenças fibrosas de qualquer tipo.Demonstrando o procedimento estará Alisa Degrave, uma estudante de doutorado do nosso laboratório, e eu. Para começar, descongele os fibroblastos cardíacos preservados por crio-preservados em um banho de água a 37 graus Celsius por aproximadamente dois minutos até que o frasco fique com apenas uma pequena quantidade de gelo. Em seguida, transfira a suspensão celular em sentido de gota usando uma pipeta sorológica de dois mililitros em um tubo de centrífuga estéril apropriado contendo 10 mililitros de meio de crescimento de fibroblasto.Para a recuperação ideal da célula, enxágue o crio-frasco com um mililitro de FGM e transfira-o para o tubo de centrífuga. Levemente resuspenque as células e transfira para um frasco de cultura celular. Reponha a FGM a cada dois dias durante cinco dias ou até que as células tenham atingido 80% de confluência.Depois de aspirar o meio das células cultivadas, lave as células com seis mililitros de PBS e aspira, em seguida, adicione seis mililitros do reagente de dissociação celular às células e incuba até que o descolamento celular seja visível. Neutralizar a atividade enzimática adicionando seis a 12 mililitros de FGM às células desalojadas no reagente da associação celular. Pipeta suavemente para cima e para baixo quatro a oito vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para garantir uma suspensão unicelular e transferir as células para um tubo fresco de coleta de 50 mililitros.Verifique o rendimento com a ajuda de um contador automático de células de acordo com as instruções do fabricante e pelota para baixo das células. Após a centrifugação, aspire o supernasce, flick o tubo para desalojar a pelota e resuspensar as células em FGM. Em seguida, coe a suspensão celular através de um filtro de célula de malha de 40 micrômetros, em seguida, usando um contador celular automatizado, avalie o número celular e a viabilidade por exclusão elétrica de corrente elétrica para garantir números celulares confiáveis antes de prosseguir com tecidos conjuntivos projetados ou preparação de ECT.Para se preparar para a ECT, ajuste a suspensão celular para as 8,9 milhões de células por mililitro a 20 a 25 graus Celsius adicionando FGM e mantendo as células no gelo. Transfira todos os outros tubos contendo os componentes individuais da mistura de hidrogel ECT para gelo e pré-esfrie um tubo vazio de centrífuga de 50 mililitros para preparar a mistura. Comece a preparar a mistura de hidrogel ECT adicionando componentes descritos no texto ao tubo de centrífuga pré-refrigerado de 50 mililitros evitando a formação de bolhas de ar.Em primeiro lugar, pipeta o colágeno solúvel ácido I hidrogel em uma pipeta sorológica com uma ponta larga de furo. Ajuste o teor de sal da solução de colágeno adicionando o DMEM enquanto gira suavemente o tubo para uma mistura adequada. Para neutralizar o pH, adicione 0,2 hidróxido de sódio molar enquanto gira o tubo e confirme a neutralização observando a cor vermelha do indicador vermelho fenol.Em seguida, adicione a suspensão da célula em sentido baixo enquanto gira suavemente o tubo. Misture a suspensão gentilmente encanando para cima e para baixo apenas uma vez usando uma pipeta sorológica com uma ponta larga para evitar a formação de bolhas e minimizar o estresse da tesoura. Gire suavemente o tubo 10 vezes para misturar completamente.Mantenha o tubo de centrífuga contendo mistura de hidrogel ECT no gelo durante todo o processo de fundição. Molhe uma ponta de pipeta de um mililitro na mistura de hidrogel ECT, depois distribua 180 microliters de mistura de hidrogel uniformemente em cada molde da placa de fundição de 48 poços evitando forças excessivas de cisalhamento que podem afetar a integridade da montagem da matriz de colágeno e garantindo que toda a placa termine em 15 a 20 minutos. Certifique-se de que um laço completo se forme dentro do molde, pois a distribuição descontínua da mistura ECT impedirá uma formação completa do anel ECT.Evite a tubulação no poço interno e a formação de bolhas durante a pipetação para garantir uma fundição uniforme de hidrogel ECT para formação homogênea e funcional do tecido. Coloque cuidadosamente a placa de fundição de 48 poços dentro da incubadora de cultura celular para reconstituir a mistura de hidrogel ECT por 15 a 30 minutos. Após a incubação, parece gel e opaco.Adicione 600 microliters de 37 graus Celsius quente FGM por poço ao longo da parede suavemente para evitar o descolamento de ECT a partir da parte inferior. Substitua o meio todos os dias por 500 microliters de FGM até a análise. Nos pontos de tempo desejados, use um microscópio estéreo para gravar imagens microscópicas das vistas superiores e laterais da ECT.Use um programa de processamento de imagens para realizar uma análise de varredura de linha. Defina uma escala e use a ferramenta de linha reta para rastrear e medir os diâmetros da ECT em um mínimo de seis posições por braço em cada plano de imagem. Imagem a placa de fundição de 48 poços sob um dispositivo de gravação com uma câmera de varredura de área integrada colocada a uma distância fixa equipada com um sensor de imagem monocromática de alta resolução e uma fonte de luz quase UV.Realize a detecção automatizada das pontas dos polos contendo corante fluorescente para maximizar o contraste. Meça a distância entre os polos dos registros diários usando uma análise automatizada executando as imagens gravadas em software para detectar pixels brilhantes de alto contraste em um fundo escuro ou em um programa de processamento de imagens. Remova o ECT dos postes de retenção e insira um gancho de transferência e um laço ECT.Em seguida, transfira o ECT para dois ganchos fixados no braço estacionário e o braço transdutor de um riometro mecânico dinâmico extensal equipado com um banho de órgão temperado de 37 graus Celsius cheio de PBS. Aplique tensão uniaxial a uma taxa linear constante, definindo o riometro em aproximadamente 1% da distância inicial entre os ganchos por segundo. Uma taxa de alongamento constante de 0,03 milímetros por segundo pode ser usada com dimensões típicas de ECT.Rasgue a força do transdutor e inicie o trecho. Continue registrando até o ponto de ruptura da ECT após normalizar a força medida por área transversal e plote a curva de tensão determinando diferentes parâmetros biomecânicos. Pouco antes do tecido iniciar a micro fratura, o limite superior da região elástica corresponde ao ponto de rendimento e sua tensão é uma medida de elasticidade tecidual.A região de plástico está entre o ponto de rendimento e o ponto de falha. O ponto de falha corresponde a uma queda repentina do estresse devido à ruptura do tecido, definindo a tensão final que é uma medida de extensibilidade tecidual. O terceiro ponto de medição corresponde à força máxima definida pelo maior estresse que o tecido pode suportar sem quebrar durante o trecho.A resiliência e resistência dada pela área sob a curva corresponde à energia absorvida pelo tecido até o ponto de rendimento e ponto de falha, respectivamente. Para cada curva obtida, a inclinação da parte linear da região elástica corresponde ao módulo de Young, também conhecido como módulo elástico. É uma propriedade mecânica que mede a rigidez do tecido.Usando este protocolo, a compactação e contração da ECT sob condições de controle e na presença de FCS se seguiu algumas horas após o casting e notavelmente aumentou até o quinto dia. Quando a ECT foi tratada com o inibidor de polimerização de actina Latrunculin A, a compactação da ECT foi reduzida conforme indicado pela área transversal significativamente maior em comparação com o controle. A contração dos tecidos foi avaliada durante os cinco dias de cultura.Na ausência de Latrunculin A, a contração aumentou gradualmente até o quinto dia, atingindo cerca de 40% de contração. No entanto, a presença de Latrunculin A afetou a contração tecidual, resultando em apenas uma contração máxima de cerca de 20%. A inibição da polimerização de actina levou a uma redução significativa de cerca de 50% na rigidez tecidual sobre o controle.Esses resultados demonstram que a integridade citoesquelética actin é essencial para a compactação, contração e endurecimento da ECT. É importante selecionar uma solução confiável e de alta qualidade de colágeno e garantir que uma suspensão unicelular com alta viabilidade seja usada para reconstituir tecidos conjuntivos projetados.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este modelo de sistema começa a partir de um gel de fibrina miofibroblastos povoada que pode ser usado para estudar colagénio endógeno (re) organização em tempo real de uma forma não destrutiva. O modelo de sistema é muito sintonizável, como ele pode ser usado com diferentes fontes de células, aditivos médio, e pode ser facilmente adaptada às necessidades específicas.

Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Doença de Dupuytren (DD) é uma doença fibroproliferativa da palma da mão. Aqui, apresentamos um protocolo para espécimes cultura de ressecção de DD em um (3D) sistema de cultura tridimensional. Tal sistema de cultura de curto prazo permite a preservação da estrutura 3D e propriedades moleculares do tecido fibrótico.

Dupuytren Humano do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para o Estudo da Miofibroblastos e Matriz Extracelular Interações

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Muitos pesquisadores geram dados "de tamanho médio", de baixa velocidade e multidimensionais, que podem ser gerenciados de forma mais eficiente com bancos de dados em vez de planilhas. Aqui fornecemos uma visão conceitual dos bancos de dados, incluindo a visualização de dados multidimensionais, a vinculação de tabelas em estruturas de banco de dados relacionais, o mapeamento de pipelines de dados semiautomatizados e o uso do banco de dados para elucidar o significado dos dados.

Bancos de dados para gerenciar eficientemente dados multidimensionais de médio porte, baixa velocidade e multidimensional em engenharia de tecidos

O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).

Sistema de matriz 3D derivado do fibroblasto aplicável ao ensaio de formação do tubo endotelial

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Aqui, apresentamos um sistema modelo assemblóide para mimetizar o crosstalk celular do tendão entre o tecido central do tendão que suporta carga e um compartimento extrínseco contendo populações celulares ativadas por doença e lesão. Como um importante caso de uso, demonstramos como o sistema pode ser implantado para sondar a ativação de células endoteliais extrínsecas relevantes para a doença.

Engenharia de Assemblóides de Tendão para Sondar Crosstalk Celular em Doenças e Reparos

O protocolo a seguir apresenta um método de extrusão baseado em cisalhamento para a fabricação de hidrogéis de colágeno com fibrilas padronizadas em nanoescala, que pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações de engenharia de tecidos.

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

Aprenda a criar tecidos conjuntivos de engenharia derivados de fibroblastos humanos para triagem de fármacos. Este protocolo reprodutível permite comparar até 48 condições em paralelo, facilitando estudos mecanicistas de doenças fibroticas.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

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