Sondagem do metabolismo e viscosidade de células cancerígenas usando microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida

Resumo

Aqui, demonstramos o uso da microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) para obter imagens sequenciais do metabolismo celular e da viscosidade da membrana plasmática em cultura de células cancerígenas vivas. As avaliações metabólicas são realizadas pela detecção de fluorescência endógena. A viscosidade é medida usando um rotor molecular fluorescente.

Resumo

A viscosidade é uma propriedade física importante de uma membrana biológica, pois é um dos parâmetros-chave para a regulação do estado morfológico e fisiológico das células vivas. Sabe-se que as membranas plasmáticas das células tumorais apresentam alterações significativas em sua composição, estrutura e características funcionais. Juntamente com o metabolismo desregulado da glicose e dos lipídios, essas propriedades específicas da membrana ajudam as células tumorais a se adaptarem ao microambiente hostil e a desenvolverem resistência às terapias medicamentosas. Aqui, demonstramos o uso da microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) para obter imagens sequenciais do metabolismo celular e da viscosidade da membrana plasmática em cultura de células cancerígenas vivas. As avaliações metabólicas são realizadas pela detecção de fluorescência de cofatores metabólicos endógenos, como redução do dinucleotídeo de nicotinamida adenina NAD(P)H e flavinas oxidadas. A viscosidade é medida usando um rotor molecular fluorescente, um corante sintético sensível à viscosidade, com uma forte dependência do tempo de vida de fluorescência da viscosidade do ambiente imediato. Em combinação, essas técnicas nos permitem entender melhor as ligações entre o estado da membrana e o perfil metabólico das células cancerígenas e visualizar as alterações induzidas pela quimioterapia.

Introdução

A transformação maligna das células é acompanhada por múltiplas alterações em seu estado morfológico e fisiológico. O crescimento rápido e descontrolado das células cancerígenas requer uma reorganização fundamental das vias bioquímicas responsáveis pela produção de energia e biossíntese. As características do metabolismo do câncer são o aumento da taxa de glicólise, mesmo sob as concentrações normais de oxigênio (efeito Warburg), o uso de aminoácidos, ácidos graxos e lactato como combustíveis alternativos, alta produção de ROS na presença de altos níveis de antioxidantes e aumento da biossíntese de ácidos graxos

Protocolo

1. Descrição da configuração mínima para executar o FLIM

1. Para realizar este experimento, certifique-se de que a configuração necessária esteja disponível: um microscópio confocal invertido, um laser pulsado, normalmente um ps ou fs, com o sinal de sincronização, um detector de contagem rápida de fótons (resposta de tempo 150 ps) e eletrônica de contagem de fótons, portas de saída e entrada disponíveis para o detector e o laser, respectivamente, no microscópio, os pulsos do relógio de varredura do controlador de varredura do microscópio, a cabeça de varredura do microscópio com os combinadores de feixe de laser e os divisores de feixe dicróico principais a....

Resultados

Usando o protocolo descrito aqui, visualizamos os cofatores metabólicos e a viscosidade da membrana microscópica em células vivas cultivadas usando FLIM. As medições foram feitas em diferentes linhagens de células cancerígenas - carcinoma colorretal humano HCT116, carcinoma de cólon murino CT26, câncer cervical humano HeLa Kyoto e fibroblastos de pele humana huFB.

A razão redox baseada na intensidade de fluorescência FAD/NAD(P)H.......

Discussão

Este protocolo ilustra as possibilidades do FLIM para análise multiparamétrica, funcional e biofísica de células cancerígenas. A combinação da imagem metabólica óptica baseada em fluorescência endógena e as medidas de viscosidade da membrana plasmática usando marcação exógena com rotor molecular fluorescente nos permite caracterizar as interconexões entre esses dois parâmetros em células cancerígenas vivas em uma cultura de células e acompanhar as mudanças em resposta à quimioterapia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Item/Dispositivo
Incubadora de cultura de células	Sanyo		37° C, 5% CO2, atmosfera umidificada
Centrífuga 5702 R	Eppendorf	5703000010
imageJ 1.53c	Wayne Rasband ( NIH)
Módulo FLIM Simple Tau 152 TCSPC (em LSM 880)	Becker & Hickl GmbH
Capa de fluxo laminar	ThermoFisher Microscópio científico
Leica DFC290	Leica Microsystems
LSM 880 microscópio confocal	Carl Zeiss
Ti:Laser de femtossegundo de safira Mai Tai	Spectra Microscópio de física
incubadora XLmulti S DARK LS	PeCon GmbH	273-800 050
Pipetador mecânico	Sartorius mLINE		volume 0.5-10  μ L; 20-200 μ L; 100-1000 μ L
Objetiva de imersão em óleo C-Apocromático 40&vezes;/1.2 NA W Korr  (em LSM 880)	Carl Zeiss	421767-9971-790
Módulo Power-Tau 152 com detector HPM-100-40	Becker& Hickl GmbH
SPCImage software	Becker & Hickl GmbH		SPC 9.8; Software SPCImage 8.3
ZEN	Carl Zeiss		ZEN 2.1 SP3 (preto), Versão 14.0.0.201
Reagent/Material
5-fluorouracil	Medac GmbH	3728044
DMEM	Gibco, Life Technologies	31885023
DMSO	PanEco	F135
FBS	Hyclone
FluoroBright DMEM	Gibco, Life Technologies	A1896701
Hank' s solução sem Ca2+/Mg2+	Gibco, Life Technologies	14175
l-Glutamina	PanEco	F032
		de mamíferos	HCT116, CT26, HeLa Kyoto, huFB
Rotor molecular BODIPY 2			Sintetizado e fornecido pelo Grupo Marina Kuimova, Imperial College London
Penicilina/estreptomicina	PanEco	A065
Placa de cultura de tecidos com tampa com fundo de vidro FluoroDishes	World Precision Instruments, Inc
Tripsina- EDTA 0,25%	PanEco	P034
Versen buffer	PanEco	R080p

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