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Artigo de método

Sondagem do metabolismo e viscosidade de células cancerígenas usando microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida

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DOI:

10.3791/62708

⸱

31 de julho de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Experimental Oncology and Biomedical Technologies, Privolzhsky Research Medical University, 2Becker & Hickl GmbH, 3Department of Chemistry, Imperial College London

Neste artigo

Resumo

Aqui, demonstramos o uso da microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) para obter imagens sequenciais do metabolismo celular e da viscosidade da membrana plasmática em cultura de células cancerígenas vivas. As avaliações metabólicas são realizadas pela detecção de fluorescência endógena. A viscosidade é medida usando um rotor molecular fluorescente.

Resumo

A viscosidade é uma propriedade física importante de uma membrana biológica, pois é um dos parâmetros-chave para a regulação do estado morfológico e fisiológico das células vivas. Sabe-se que as membranas plasmáticas das células tumorais apresentam alterações significativas em sua composição, estrutura e características funcionais. Juntamente com o metabolismo desregulado da glicose e dos lipídios, essas propriedades específicas da membrana ajudam as células tumorais a se adaptarem ao microambiente hostil e a desenvolverem resistência às terapias medicamentosas. Aqui, demonstramos o uso da microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) para obter imagens sequenciais do metabolismo celular e da viscosidade da membrana plasmática em cultura de células cancerígenas vivas. As avaliações metabólicas são realizadas pela detecção de fluorescência de cofatores metabólicos endógenos, como redução do dinucleotídeo de nicotinamida adenina NAD(P)H e flavinas oxidadas. A viscosidade é medida usando um rotor molecular fluorescente, um corante sintético sensível à viscosidade, com uma forte dependência do tempo de vida de fluorescência da viscosidade do ambiente imediato. Em combinação, essas técnicas nos permitem entender melhor as ligações entre o estado da membrana e o perfil metabólico das células cancerígenas e visualizar as alterações induzidas pela quimioterapia.

Introdução

A transformação maligna das células é acompanhada por múltiplas alterações em seu estado morfológico e fisiológico. O crescimento rápido e descontrolado das células cancerígenas requer uma reorganização fundamental das vias bioquímicas responsáveis pela produção de energia e biossíntese. As características do metabolismo do câncer são o aumento da taxa de glicólise, mesmo sob as concentrações normais de oxigênio (efeito Warburg), o uso de aminoácidos, ácidos graxos e lactato como combustíveis alternativos, alta produção de ROS na presença de altos níveis de antioxidantes e aumento da biossíntese de ácidos graxos 1,2. Agora é reconhecido que o metabolismo das células cancerígenas é altamente flexível, o que lhes permite adaptar-se ao ambiente desfavorável e heterogêneo e fornece uma vantagem adicional de sobrevivência3.

O metabolismo alterado suporta a organização e composição específicas das membranas das células tumorais. O perfil lipídico da membrana plasmática nas células cancerígenas difere quantitativamente das células não cancerosas. As principais alterações no lipidoma são o aumento do nível de fosfolipídios, incluindo fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, a diminuição do nível de esfingemielina, aumento da quantidade de colesterol e menor grau de insaturação de ácidos graxos, para citar alguns 4,5,6. Portanto, as propriedades físicas da membrana, como a viscosidade da membrana, o inverso da fluidez, inevitavelmente mudam. Como a viscosidade determina a permeabilidade das membranas biológicas e controla a atividade das proteínas associadas à membrana (enzimas, transportadores, receptores), sua regulação homeostática é vital para o funcionamento celular. Ao mesmo tempo, a modificação da viscosidade através do ajuste do perfil lipídico da membrana é importante para a migração/invasão celular e sobrevivência após alterações condicionais.

A microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) surgiu como uma abordagem poderosa para a avaliação não invasiva de múltiplos parâmetros em células vivas, usando fluorescência endógena ou sondas exógenas7. O FLIM é comumente realizado em um microscópio de varredura a laser multifotônico, que fornece resolução (sub)celular. Sendo equipado com o módulo de contagem de fótons únicos correlacionados ao tempo (TCSPC), ele permite medições de fluorescência resolvidas no tempo com alta precisão8.

A sondagem do metabolismo celular por FLIM baseia-se na medição de fluorescência de cofatores endógenos de desidrogenase, o dinucleotídeo (fosfato) de nicotinamida adenina reduzido NAD(P)H e flavinas oxidadas - dinucleotídeo de flavina adenina FAD e mononucleotídeo de flavina FMN, que atuam como carreadores de elétrons em várias reações bioquímicas 7,9,10. A fluorescência detectada de NAD(P)H é de NADH e sua forma fosforilada, NADPH, pois são espectralmente quase idênticas. Normalmente, os decaimentos de fluorescência de NAD (P) H e flavinas se ajustam a uma função bi-exponencial. No caso do NAD (P) H, o primeiro componente (~ 0,3-0,5 ns, ~ 70% -80%) é atribuído ao seu estado livre, associado à glicólise, e o segundo componente (~ 1,2-2,5 ns, ~ 20% -30%) ao seu estado ligado à proteína, associado à respiração mitocondrial. No caso das flavinas, o componente curto (~ 0,3-0,4 ns, ~ 75% -85%) pode ser atribuído ao estado temperado de FAD e o componente longo (~ 2,5-2,8 ns, ~ 15% -25%) a FAD não extinto, FMN e riboflavina. Alterações nos níveis relativos de glicólise, glutaminólise, fosforilação oxidativa e síntese de ácidos graxos resultam em alterações nas frações de vida curta e longa dos cofatores. Além disso, a razão de intensidade de fluorescência desses fluoróforos (a razão redox) reflete o status redox celular e também é usada como um indicador metabólico. Embora a razão redox apresente uma métrica mais simples, em comparação com o tempo de vida da fluorescência, em termos de aquisição de dados, o FLIM é vantajoso para estimar NAD(P)H e FAD, pois o tempo de vida da fluorescência é uma característica intrínseca do fluoróforo e quase não é influenciado por fatores como poder de excitação, fotobranqueamento, focalização, espalhamento e absorção de luz, especialmente em tecidos, ao contrário da intensidade de emissão.

Uma das maneiras convenientes de mapear a viscosidade em células e tecidos vivos no nível microscópico é baseada no uso de rotores moleculares fluorescentes, pequenos corantes sintéticos sensíveis à viscosidade, nos quais os parâmetros de fluorescência dependem fortemente da viscosidade local11,12. Em um meio viscoso, a vida útil da fluorescência do rotor aumenta devido à desaceleração da torção ou rotação intramolecular. Entre os rotores moleculares, os derivados do dipirrometeno de boro (BODIPY) são adequados para detectar a viscosidade em sistemas biológicos, pois possuem uma boa faixa dinâmica de tempos de vida de fluorescência na faixa fisiológica de viscosidades, independência de temperatura, decaimentos de fluorescência monoexponenciais que permitem interpretação direta dos dados, solubilidade em água suficiente e baixa citotoxicidade13,14. Avaliações quantitativas de microviscosidade usando rotores baseados em BODIPY e FLIM foram demonstradas anteriormente em células cancerígenas in vitro, esferóides tumorais multicelulares e tumor de camundongo in vivo15,16.

Aqui, apresentamos uma descrição detalhada das metodologias de sondagem sequencial para estudar o metabolismo celular e a viscosidade da membrana plasmática em células cancerígenas in vitro por FLIM. Para evitar a contaminação da fluorescência endógena relativamente fraca com a fluorescência do rotor baseado em BODIPY, a imagem da mesma camada de células é realizada sequencialmente com a fluorescência de NAD (P) H e FAD fotografada primeiro. O tempo de vida de fluorescência dos cofatores é medido no citoplasma, e o tempo de vida de fluorescência do rotor é medido nas membranas plasmáticas das células pela seleção manual das zonas correspondentes como regiões de interesse. O protocolo foi aplicado para correlacionar o estado metabólico e a viscosidade para diferentes linhagens de células cancerígenas e avaliar as alterações após a quimioterapia.

O protocolo para preparação de amostras FLIM não difere daquele para microscopia de fluorescência confocal. Uma vez que os dados tenham sido adquiridos, a principal tarefa é extrair o tempo de vida da fluorescência dos dados brutos. O desempenho do protocolo é demonstrado usando células HCT116 (carcinoma colorretal humano), CT26 (carcinoma de cólon murino), HeLa (carcinoma cervical humano) e huFB (fibroblastos da pele humana).

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Protocolo

1. Descrição da configuração mínima para executar o FLIM

  1. Para realizar este experimento, certifique-se de que a configuração necessária esteja disponível: um microscópio confocal invertido, um laser pulsado, normalmente um ps ou fs, com o sinal de sincronização, um detector de contagem rápida de fótons (resposta de tempo 150 ps) e eletrônica de contagem de fótons, portas de saída e entrada disponíveis para o detector e o laser, respectivamente, no microscópio, os pulsos do relógio de varredura do controlador de varredura do microscópio, a cabeça de varredura do microscópio com os combinadores de feixe de laser e os divisores de feixe dicróico principais adequados ao comprimento de onda do laser usado para FLIM.
  2. Se a excitação de dois fótons for usada para FLIM, certifique-se de que o microscópio contenha a porta NDD.
  3. Para estudos com células de mamíferos, especialmente para experimentos de longo prazo, certifique-se de ter uma incubadora de CO2 mantida na temperatura desejada.
    NOTA: Para o sistema usado neste experimento, consulte a Tabela de Materiais.

2. Preparação de células para microscopia

  1. Cultive as células rotineiramente em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 e uma atmosfera úmida.
  2. Para microscopia, preparar a suspensão celular num meio de cultura completo na concentração de 1 x 106 células/ml.
    NOTA: As concentrações celulares e as condições do meio dependem da célula. O número de células utilizadas para a semeadura e o tempo de incubação devem ser adaptados para obter 70%-80% de confluência na placa microscópica.
  3. Semear as células em placas de cultura de células de 35 mm com fundo de vidro (1 x 105 células em 100 μL por placa) usando uma pipeta automática de 200 μL.
    NOTA: Use placas com fundo de vidro quadriculado para a semeadura de células para monitorar células nos mesmos campos microscópicos de view em dinâmica.
    1. Durante a semeadura manual, certifique-se de que a ponta da pipeta não risque o fundo ou as laterais do prato para evitar danificar o fundo.
  4. Colocar a placa na incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2, atmosfera húmida) e incubar as células durante 24 h.
  5. Após 24 h, retirar a placa da incubadora e verificar a morfologia e a confluência das células ao microscópio óptico. Se as células não atingirem cerca de 80% de confluência, incubar por mais 24 horas.
  6. Remova suavemente o meio antigo do prato usando uma pipeta automática de 1.000 μL e adicione 2 mL de meio DMEM sem vermelho de fenol (por exemplo, DMEM Life ou FluoroBrite).
    NOTA: Diferentes meios de cultura podem ser usados para geração de imagens. Evite o vermelho de fenol no meio ao usar células para microscopia.
  7. Coloque o prato na incubadora por 60-120 min para permitir a adaptação das células.

3. FLIM de cofatores metabólicos

  1. Coloque o prato com fundo de vidro com as células (da etapa 2.7) no microscópio stage.
  2. Clique na guia Localizar no software do microscópio de varredura a laser (por exemplo, ZEN - ZEISS Efficient Navigation) e, em seguida, clique em Luz de transmissão (TL) para acender a luz.
  3. Encontre o plano focal da amostra visualizando através da ocular no nível da fatia central das células, onde um quadrado é ocupado ao máximo por células (com ampliação de 40x).
  4. Clique no botão OFF para desligar a luz.
  5. Abra a guia Aquisição . Para obter imagens de intensidade de transmissão e autofluorescência de NAD(P)H endógeno, insira as seguintes configurações: Comprimento de onda de excitação: modo de dois fótons 750 nm, Faixa de registro: 450-490 nm, Potência do laser: 5% (~6 mW), Tamanho da imagem: 1024 x 1024 pixels.
    NOTA: A escolha do comprimento de onda de excitação e da faixa de registro é baseada nas características espectrais (excitação máxima e emissão máxima) do NAD(P)H17.
    1. Use uma lente objetiva de imersão em óleo С Plan-Apochromat 40x/1.3 NA para a aquisição da imagem.
  6. Pressione o botão Snap e salve a imagem no formato ZEN.
  7. Para obter as imagens de intensidade de transmissão e autofluorescência do FAD, altere o comprimento de onda de excitação para 900 nm. Defina o intervalo de registro: 500-550 nm, potência do laser: 9% (~6 mW) e tamanho da imagem: 1024 x 1024 pixels.
    NOTA: A escolha do comprimento de onda de excitação e da faixa de registro é baseada nas características espectrais (excitação máxima e emissão máxima) do FAD18.
    1. Use uma lente objetiva de imersão em óleo С Plan-Apochromat 40x/1.3 NA para aquisição de imagem.
  8. Pressione o botão Snap e salve a imagem no formato ZEN.
  9. Para NAD(P)H, defina os parâmetros conforme descrito na etapa 3.5 no software do microscópio de varredura a laser. Altere o tamanho da imagem para 256 x 256 pixels.
  10. Insira os seguintes parâmetros no menu do SPCM (Single Photon Counting Modules) Software operacional do módulo FLIM: Tempo de coleta: 60 s; Faixa TAC: 5.00E-8; Limite de CFD Baixo: -29,41; Resolução ADC: 256, Tamanho da imagem: 256 x 256 pixels.
  11. Digitalize a amostra por 60 s, pare a varredura e salve a imagem FLIM obtida de NAD(P)H.
  12. Verifique os dados FLIM obtidos. Para isso, Abra os dados brutos no software de imagem, selecione um pixel no citoplasma da célula colocando o cursor sobre ele e analise o decaimento da fluorescência neste pixel. As intensidades de pixel devem ser ≥ 3.000 fótons por curva de decaimento no compartimento 1.
    NOTA: Se o número de fótons estiver abaixo de 3.000, aumente a potência do laser ou o tempo de coleta de imagens, enquanto controla a morfologia das células e a taxa de contagem de fótons. Normalmente, se a queda na taxa de contagem exceder 10% do valor inicial, ocorre o fotobranqueamento.
  13. Para FAD, defina os parâmetros conforme descrito na etapa 3.7 no software do microscópio de varredura a laser. Altere o tamanho da imagem para 256 x 256 pixels.
  14. Insira os seguintes parâmetros no menu do SPCM (Single Photon Counting Modules) Software operacional do módulo FLIM: Tempo de coleta: 60 s; Faixa TAC: 5.00E-8; Limite de CFD Baixo: -29,41; Resolução ADC: 256, Tamanho da imagem: 256 x 256 pixels.
  15. Escaneie a amostra por 60 s. Pare a digitalização e salve a imagem FLIM obtida do FAD.
    NOTA: Os parâmetros indicados nas etapas 3.10 e 3.15 são específicos para a eletrônica e o detector usado.
  16. Verifique os dados obtidos conforme descrito na etapa 3.12.
  17. Repita as etapas 3.5 a 3.16 para gravar imagens FLIM de diferentes campos de view.

4. Coloração de células com o rotor molecular fluorescente

NOTA: As células são visualizadas na solução fluorescente do rotor molecular sem lavagem à temperatura ambiente (~ 20 ° C) para retardar a internalização do rotor. A viscosidade da membrana depende da temperatura, como demonstrado em nossos trabalhos anteriores 19,20. O estágio de temperatura controlada do microscópio deve ser desligado com antecedência, ou seja, antes que o rotor seja adicionado às células. Para nossa configuração, o resfriamento do palco leva cerca de 10 minutos.

  1. Preparar uma solução geral do rotor molecular fluorescente BODIPY 2 (Stock 1, 25,7 mM).
    1. Abra o BODIPY 2 em um ambiente estéril e pese aproximadamente 2 mg, usando uma balança precisa. Coloque-o cuidadosamente em um tubo de microcentrífuga.
    2. Use uma pipeta automática de 20 μL para adicionar 3 μL de um solvente adequado (por exemplo, DMSO).
    3. Assim que a amostra se dissolver completamente em DMSO, adicione 297 μL de PBS estéril e misture bem usando uma pipeta automática de 200 μL.
      NOTA: Armazene a solução estoque na geladeira a +4 °C em embalagem escura. Uma vez ressuspenso, pode ser armazenado na geladeira por vários meses.
  2. Prepare um estoque 2 (8,9 mM) adicionando 25 μL da solução estoque geral (estoque 1) a um tubo de microcentrífuga, seguido por 48 μL de PBS estéril. Misturar delicadamente utilizando uma pipeta automática de 200 μL.
    NOTA: Use o estoque 2 para preparar o estoque de coloração final, que é aplicado para coloração celular, pois a concentração micromolar é necessária.
  3. Substitua suavemente os meios de cultura na placa (a partir do passo 3.1) por uma solução de Hank gelada sem Ca2+/Mg2+ e incube as células a +4 °C durante 3 min.
    NOTA: O uso de solução gelada e incubação a +4 °C retarda a internalização do rotor molecular e a coloração local da membrana persiste por 20-30 min.
  4. Prepare a solução de coloração final contendo 4,5 μM de BODIPY 2 adicionando 1 μL da solução de Hank gelada Stock 2 a 999 μL gelada ou PBS.
    NOTA: A concentração de BODIPY 2 na solução de coloração final pode ser aumentada para ~ 10 μM sem nenhum efeito tóxico nas células, o que resulta em uma coloração mais eficiente e maior número de fótons coletados. Em concentrações mais altas, pode ocorrer sobrecarga do detector FLIM.
  5. Aspirar a solução de Hank da placa de cultura de células e substituí-la por uma solução gelada de 4,5 μM de BODIPY 2. As células são visualizadas em solução BODIPY 2 sem lavagem.

5. FLIM do rotor molecular fluorescente nas células

NOTA: Sempre execute FLIM do rotor molecular fluorescente após FLIM de cofatores metabólicos porque o espectro de fluorescência de BODIPY 2 é sobreposto à emissão de cofatores endógenos NAD(Р)H e FAD 12,17,18.

  1. Transfira o prato com as células coradas para o estágio de microscópio (~ 20 ° C) para obter imagens.
  2. Defina os seguintes parâmetros para o modo de um fóton no software do microscópio de varredura a laser: Excitação no comprimento de onda de 488 nm com um laser de íons de argônio, potência do laser 1% -2%, faixa de registro de comprimento de onda de 500-550 nm.
  3. Use uma lente objetiva de imersão em óleo С Plan-Apochromat 40x/1.3 NA para aquisição de imagem.
  4. Pressione o botão Ao vivo . Comece a digitalizar e usar o posicionamento XY e Z por um estágio motorizado integrado, ajuste o foco e obtenha imagens de transmissão e intensidade de fluorescência das células em uma janela de visualização. Salve as imagens obtidas, se necessário.
  5. Verifique a transmissão sobreposta e a imagem de fluorescência para ver se a fluorescência do rotor está vindo do local esperado (membrana plasmática da célula).
  6. Insira os seguintes parâmetros no menu do software SPCM do módulo FLIM: Tempo de coleta: 60 s; Faixa TAC: 5.00E-8; Limite de CFD Baixo: -29,41; Resolução ADC: 256, Tamanho da imagem: 256 x 256 pixels.
    NOTA: Dependendo da configuração do sistema e dos detectores usados para FLIM, os parâmetros de aquisição de imagem podem variar.
  7. Ajuste o laser Ti:Sapphire do microscópio para um comprimento de onda de 850 nm e a potência do laser para 1%-2% para FLIM de dois fótons.
  8. Selecione a guia Contínuo no software do microscópio de varredura a laser e pressione Iniciar no software SPCM. Digitalize a amostra por 60 s, pare a varredura e salve a imagem FLIM obtida.
  9. Verifique os dados FLIM obtidos. Para isso, carregue os dados brutos no software SPCImage de análise de dados FLIM, selecione um pixel na membrana da célula colocando o cursor sobre ele e analise o decaimento de fluorescência neste pixel. As intensidades de pixel devem ser de ≥5.000 por decaimento (possivelmente incluindo binning) em um tempo de coleta razoável (60-120 s).
  10. Repita as etapas 5.4 a 5.8 para gravar imagens FLIM de células de diferentes campos de visão.
    NOTA: As medições FLIM de células vivas coradas com BODIPY 2 devem ser limitadas a ~ 30 min após a adição de BODIPY 2.

6. Análise dos dados

  1. Análise da intensidade de fluorescência: razão redox
    1. Imagens abertas da intensidade de fluorescência de NAD(P)H e FAD usando ImageJ.
    2. Realce uma área livre de células na imagem NAD(P)H usando uma opção de círculo ou quadrado. Clique em Medir e, em seguida, clique em Subtrair (selecione Processar no painel principal e, em seguida, Matemática e Subtrair) para subtrair o valor obtido do sinal de fundo.
    3. Repita a etapa 6.1.2 para a imagem FAD.
    4. Obter a imagem do rácio redox dividindo a intensidade de fluorescência do DCP pela intensidade de fluorescência do NAD(P)H. Faça isso selecionando Processar no painel principal e, em seguida, selecione Calculadora de imagens e dividir; marque a caixa Criar nova janela e pressione OK.
    5. Salve a imagem no formato TIFF.
    6. Para calcular a razão redox, selecione a região do citoplasma na célula específica na imagem TIFF e pressione a tecla M . Repita para todas as células de interesse.
    7. Importe a medida para um documento de planilha.
      NOTA: Alternativamente, as intensidades de fluorescência de NAD(P)H e FAD nas células podem ser medidas usando o software padrão do microscópio e a razão redox pode ser obtida dividindo esses valores no software da planilha.
  2. Análise de dados FLIM: metabolismo
    1. Importe a imagem FLIM do NAD(P)H para o software SPCImage.
    2. Aplique um ajuste de decaimento bi-exponencial à imagem colocando 2 na seção Componentes .
    3. Corrija o parâmetro Offset marcando a caixa correspondente no software SPCImage.
    4. Vá para Opções e selecione Modelo. Use o modelo de ajuste multiexponencial incompleto e o método de ajuste MLE.
    5. Ajuste o binning para atingir intensidades de pixel de ≥5000 fótons por curva de decaimento.
    6. Verifique o valor χ2. O χ2≤ 1,20 indica que o modelo usado fornece um ajuste razoável.
    7. Calcule o histograma da vida útil da fluorescência em cada imagem clicando no menu superior Calcular e, em seguida, em Matriz de decaimento.
    8. Selecione a área no citoplasma da célula específica como uma região de interesse.
    9. Analise os componentes de vida curta e longa (τ1 e τ2, respectivamente) e as amplitudes relativas dos componentes de vida útil (a1 e a2, onde a1 + a2 = 100%) usando a opção Cor .
    10. Exporte as medições para um software de planilha.
    11. Repita as etapas 6.2.8 a 6.2.10 para cada célula de interesse.
    12. Repita as etapas 6.2.1-6.2.11 para a imagem FAD.
  3. Análise de dados FLIM: viscosidade
    1. Importe a imagem FLIM para o software SPCImage de análise de dados FLIM.
    2. Remova a marca na caixa Dispersão .
    3. Coloque 1 na seção Componentes , pois o decaimento da fluorescência do rotor deve se ajustar a um modelo monoexponencial.
    4. Ajuste o binning para atingir uma intensidade de pixel de ≥5000 fótons por curva de decaimento.
    5. Verifique o valor χ2 na membrana plasmática. Um valor de χ2≤ 1,20 indica que o modelo usado fornece um ajuste razoável. No caso de χ2≥ 1,20, a aproximação monoexponencial não é aplicável, tais dados podem indicar a agregação do corante e devem ser descartados. A agregação impossibilita o uso das curvas de calibração e leva a estimativas incorretas de viscosidade.
      NOTA: Decaimentos bi-exponenciais podem ser indicativos de agregação. Em um microscópio com módulo FLIM com filtros variáveis, isso pode ser detectado testando as faixas de comprimento de onda de emissão específicas de monômeros e agregados, 500-550 nm e 580-650 nm, conforme descrito na referência21.
    6. Gere o histograma do tempo de vida da fluorescência τ para cada imagem clicando no menu superior Calcular e, em seguida, em Matriz de decaimento.
    7. Selecione a região da membrana plasmática da célula individual com decaimento monoexponencial, χ2≤ 1,20, usando a opção ROI.
    8. Exporte o valor da vida útil da fluorescência para um software de planilha.
    9. Repita as etapas 6.3.7-6.3.8 para cada célula de interesse.
    10. Converter o tempo de vida de BODIPY 2 medido experimentalmente (em ns) em valores de viscosidade (em cP) utilizando a seguinte equação (previamente obtida com base no gráfico de calibração de BODIPY em misturas de metanol/glicerol):
      figure-protocol-1
      onde x - viscosidade (em cP), y - tempo de vida de fluorescência τ (em ns).
      NOTA: IRF (Instrument Response Function) é uma parte importante do ajuste FLIM. No SPCImage, o IRF é calculado automaticamente a partir da borda ascendente das curvas de decaimento de fluorescência. Enquanto isso, o IRF pode ser registrado usando amostras não fluorescentes, por exemplo, cerâmicas ou uma amostra que produz sinal SHG (Second Harmonic Generation), por exemplo, colágeno, cristais de uréia ou açúcar. O uso dos IRFs gravados não é recomendado se houver uma opção para calculá-lo no software.

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Resultados

Usando o protocolo descrito aqui, visualizamos os cofatores metabólicos e a viscosidade da membrana microscópica em células vivas cultivadas usando FLIM. As medições foram feitas em diferentes linhagens de células cancerígenas - carcinoma colorretal humano HCT116, carcinoma de cólon murino CT26, câncer cervical humano HeLa Kyoto e fibroblastos de pele humana huFB.

A razão redox baseada na intensidade de fluorescência FAD/NAD(P)H...

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Discussão

Este protocolo ilustra as possibilidades do FLIM para análise multiparamétrica, funcional e biofísica de células cancerígenas. A combinação da imagem metabólica óptica baseada em fluorescência endógena e as medidas de viscosidade da membrana plasmática usando marcação exógena com rotor molecular fluorescente nos permite caracterizar as interconexões entre esses dois parâmetros em células cancerígenas vivas em uma cultura de células e acompanhar as mudanças em resposta à quimioterapia.

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O desenvolvimento do protocolo de imagem metabólica foi apoiado pelo Ministério da Saúde da Federação Russa (Atribuição do Governo, registro nº АААА-А20-120022590098-0). O estudo da viscosidade foi apoiado pela Fundação Russa de Ciência (Projeto nº 20-14-00111). Os autores agradecem a Anton Plekhanov (PRMU) por sua ajuda na produção do vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Item/Dispositivo
Incubadora de cultura de célulasSanyo37° C, 5% CO2, atmosfera umidificada
Centrífuga 5702 REppendorf5703000010
imageJ 1.53cWayne Rasband ( NIH)
Módulo FLIM Simple Tau 152 TCSPC (em LSM 880)Becker & Hickl GmbH
Capa de fluxo laminarThermoFisher Microscópio científico
Leica DFC290Leica Microsystems
LSM 880 microscópio confocalCarl Zeiss
Ti:Laser de femtossegundo de safira Mai TaiSpectra Microscópio de física
incubadora XLmulti S DARK LSPeCon GmbH273-800 050
Pipetador mecânicoSartorius mLINEvolume 0.5-10  μ L; 20-200 μ L; 100-1000 μ L
Objetiva de imersão em óleo C-Apocromático 40&vezes;/1.2 NA W Korr  (em LSM 880)Carl Zeiss421767-9971-790
Módulo Power-Tau 152 com detector HPM-100-40Becker& Hickl GmbH
SPCImage softwareBecker & Hickl GmbHSPC 9.8; Software SPCImage 8.3
ZENCarl ZeissZEN 2.1 SP3 (preto), Versão 14.0.0.201
Reagent/Material
5-fluorouracilMedac GmbH3728044
DMEMGibco, Life Technologies31885023
DMSOPanEcoF135
FBSHyclone
FluoroBright DMEMGibco, Life TechnologiesA1896701
Hank' s solução sem Ca2+/Mg2+Gibco, Life Technologies14175
l-GlutaminaPanEcoF032
de mamíferosHCT116, CT26, HeLa Kyoto, huFB
Rotor molecular BODIPY 2Sintetizado e fornecido pelo Grupo Marina Kuimova, Imperial College London
Penicilina/estreptomicinaPanEcoA065
Placa de cultura de tecidos com tampa com fundo de vidro FluoroDishesWorld Precision Instruments, Inc
Tripsina- EDTA 0,25%PanEcoP034
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