Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.
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Artigo de método
Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6
Neste artigo
Resumo
Resumo
Exo-/endocitose é um processo comum que medeia a troca de biomoléculas entre as células e seu ambiente e entre diferentes células. Células especializadas usam esse processo para executar funções vitais do corpo, como a secreção de insulina das células β e liberação de neurotransmissores das sinapses químicas. Devido ao seu significado fisiológico, a exo-/endocitose tem sido um dos tópicos mais estudados em biologia celular. Muitas ferramentas têm sido desenvolvidas para estudar este processo a nível de genes e proteínas, por causa das quais muito se sabe sobre a maquinaria proteica que participa neste processo. No entanto, poucos métodos foram desenvolvidos para medir o turnover lipídico da membrana, que é a base física da exo-/endocitose.
Este artigo apresenta uma classe de novos análogos lipídicos fluorescentes exibindo fluorescência dependente de pH e demonstra seu uso para rastrear a reciclagem lipídica entre a membrana plasmática e as vesículas secretoras. Auxiliados por simples manipulações de pH, esses análogos também permitem a quantificação da distribuição lipídica através da superfície e dos compartimentos da membrana intracelular, bem como a medida da taxa de turnover lipídico durante a exo-/endocitose. Esses novos repórteres lipídicos serão de grande interesse para vários campos de pesquisa biológica, como biologia celular e neurociência.
Introdução
A bicamada lipídica é um dos conjuntos de biomoléculas mais comuns e é indispensável para todas as células. Fora das células, forma a membrana plasmática que faz interface com as células e seu ambiente; Dentro das células, compartimentaliza várias organelas especializadas para designar funcionalidades. Mais dinâmicas do que paradas, as membranas lipídicas experimentam constantemente fusão e fissão, o que medeia o transporte de biomateriais, a reforma da organela, a mudança morfológica e a comunicação celular. Sem dúvida, a membrana lipídica é a base física para quase todos os processos celulares, e sua disfunção desempenha um papel crucial em várias desordens que vão ....
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Protocolo
O protocolo a seguir inclui (1) um procedimento simplificado para estabelecer culturas hipocampais e corticais de camundongos com base em um protocolo bemestabelecido22, (2) uma breve introdução a uma instalação de microscópio de epifluorescência para neurônios vivos, (3) uma descrição detalhada da carga e imagem de ND6 em neurônios de camundongo, (4) uma discussão sobre a quantificação do tráfego de membrana pelo sinal ND6. Todos os procedimentos seguem as diretrizes de biossegurança e IACUC da Florida Atlantic University. A síntese de ND6 já foi descritaanteriormente20.
1. Preparação das cultu....
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Resultados
As VS são especializadas na liberação de neurotransmissores via exo-/endocitose evocada27. As SVs têm lúmen altamente ácido (i.e., pH 5,5), o que é ideal para ND6. Utilizamos alta estimulação com K+ para evocar a VS exo-/endocitose a fim de permitir que o ND6 acessasse o VS. Esperava-se que pontos fluorescentes verde-vivos ao longo dos processos neuronais aparecessem após a carga (Figura 9A). O perfil de retas mostrado na Figura 4B demonstr.......
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Discussão
Corantes à base de lipídios, como 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) e perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), têm sido usados há muito tempo para ilustrar a morfologia celular e rastrear processos celulares, como as projeções axonais dos neurônios. Corantes de estirila, como o FM1-43, têm sido inventados e utilizados com sucesso para o estudo da exocitose34. Devido à sua baixa afinidade com a membrana, eles marcam seletivamente as vesículas endocitadas onde f.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) e NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dispositivos moleculares | sistema de aquisição de dados Digidata 1440A | Digidata 1440A | Para estimulação sincronizada e troca de soluções |
| Controlador de temperatura de canal duplo | Warner Instruments | TC-344B | Para imagens de células |
| vivas Soro bovino fetal | OMEGA Scientific | FB-01 | Para fazer solução H+20 usada em dissecação e cultura de tecidos |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS câmera | Hamamatsu Inc. | Câmera de alta sensibilidade | C13440-20CU |
| Solução salina balanceada Hank's Sigma | H6648 | Para fazer solução H+20 usada em dissecação e cultura de tecidos | |
| Plataforma aquecida | Warner Instruments | PH-1 | Para imagens de células vivas |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Para cultura de tecidos |
| Tabela de isolamento de vibração Micro-G | TMC | 63-564 | Para imagens de células vivas |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | Para controle de aquisição |
| de imagens Aquecedor de solução em linha multilinha | Warner Instruments | SHM-6 | Para imagens de células vivas |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | Para cultura de tecidos |
| Nikon Ti-E Microscópio invertido | Nikon | Ti-E/B | Para imagens de células vivas |
| ORCA-Flash4.0 Câmera digital CMOS | Hamamatsu | C1340-20CU | para imagens de células vivas |
| Câmara de perfusão | Warner Instruments | RC-26G | Para imagens de células vivas |
| Sistema de perfusão de controle de válvula de seis canais | Warner Instruments | VC-6 | Para troca de soluções |
| Estimulador de pulso quadrado | Instrumento de grama | SD9 | Para estimulação de campo elétrico |
Referências
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010....
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Reimpressões e permissões
