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Artigo de método

Ressonância magnética nuclear de deslocamento puro: uma nova ferramenta para metabolômica de plantas

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DOI:

10.3791/62719

⸱

31 de julho de 2021

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta o uso de PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE no perfil metabólico de plantas e inclui procedimentos detalhados para preparação de amostras e registro ideal de espectros de RMN Pure Shift. Exemplos através dos quais o ganho de resolução alcançado pelo desacoplamento homonuclear permite uma compreensão mais abrangente do sistema são discutidos.

Resumo

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma das ferramentas mais poderosas utilizadas em metabolômica. Apresenta-se como um método altamente preciso e reprodutível que não apenas fornece dados quantitativos, mas também permite a identificação estrutural dos metabólitos presentes em misturas complexas.

O perfil metabólico por RMN de 1H tem se mostrado útil no estudo de vários tipos de cenários vegetais, que incluem a avaliação das condições de cultivo, tratamentos de colheita e pós-colheita, fenotipagem metabólica, vias metabólicas, regulação gênica, identificação de biomarcadores, quimiotaxonomia, controle de qualidade, denominação de origem, entre outros. No entanto, a sobreposição de sinal do grande número de ressonâncias com multiplicidades de acoplamento J expandidas complica a análise de espectros e sua interpretação e representa uma limitação para o perfil clássico de RMN de 1H.

Na última década, novas técnicas de desacoplamento homonuclear de banda larga de RMN através das quais os sinais de múltiplos colapsos em linhas de ressonância simples - comumente chamados de métodos Pure Shift - foram desenvolvidas para superar o problema de resolução de espectros inerente aos espectros clássicos de RMN de 1H.

Aqui, é apresentado um protocolo passo a passo da preparação do extrato vegetal e o procedimento para registrar os espectros ideais de Pure Shift PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE em três matrizes vegetais diferentes - folhas de plantas de baunilha , tubérculos de batata (S. tuberosum) e groselhas do Cabo (P. peruviana). O efeito do ganho de resolução na identificação metabólica, análise de correlação e análises multivariadas, em comparação com os espectros clássicos, é discutido.

Introdução

O conjunto completo de metabólitos que compõem um organismo - substratos, intermediários e produtos finais de processos biológicos - foi cunhado em 1998 com o termo metaboloma. Sabe-se que o metaboloma está intimamente relacionado ao fenótipo, e é de particular interesse nas plantas, pois reflete a interação direta entre o genótipo e o ambiente 1,2. Assim, a caracterização do perfil metabolômico tornou-se de suma importância nas plantas. Por meio da identificação e quantificação de biomarcadores (metabólitos-chave) e padrões metabólicos, temsido possível a discriminação entre espécies, cultivares, estágios de desenvolvimento, doenças patogênicas ou condições ambientais (mudanças diárias e sazonais, solos, estresse hídrico, estresse mecânico, tratamentos de colheita e pós-colheita), entre outros3,4,5.

A espectrometria de massas (MS) e a espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) são as plataformas analíticas mais utilizadas para esse fim. Ao contrário das metodologias de EM, a RMN é uma técnica altamente reprodutível, não tendenciosa, quantitativa, precisa e não destrutiva que requer preparação mínima de amostras, tornando-a adequada para estudos metabolômicos. No entanto, quando comparado aos métodos de EM, a baixa sensibilidade inerente é uma limitação. Nos últimos anos e através do uso de ímãs de alto campo, sondas criogênicas, dispositivos de microbobina e métodos de Polarização Nuclear Dinâmica (DNP), a sensibilidade da RMN foi bastante melhorada. No caso desta última abordagem, por exemplo, o ganho de sensibilidade foi no nível de duas a três ordens de magnitude 6,7. Até o momento, quase 20% dos estudos metabolômicos publicados são baseados em RMN e o número está aumentando7.

Embora a RMN de prótons seja o experimento mais popular e sensível para a impressão digital metabolômica de RMN, ela tem algumas desvantagens. Primeiro, todos os sinais de RMN de 1H detectados na amostra são distribuídos em uma pequena janela correspondente à janela de deslocamento químico do próton, o que resulta em espectros lotados. Em segundo lugar, o acoplamento escalar homonuclear divide os sinais em vários componentes (multiplicidade de sinais), espalhando o sinal de prótons por uma faixa de frequência mais ampla, complicando ainda mais a leitura dos espectros ao aumentar o aglomeramento e a sobreposição de sinais. Além disso, a metabolômica de RMN é empregada na análise de misturas geralmente contendo de 50 a 300 moléculas em uma concentração observável de RMN, gerando espectros complexos compostos de 200 a 2000 picos.

A RMN de prótons de desacoplamento homonuclear, também conhecida como Pure Shift, é um método que induz o colapso de um sinal multipleto em um único pico. Ele se destaca como uma excelente ferramenta para aumentar a resolução do sinal em espectros lotados 8,9,10 e, portanto, representa uma ferramenta conveniente para a metabolômica de plantas11.

Na última década, surgiram novas sequências de pulso Pure Shift, aumentando a sensibilidade e o desempenho de desacoplamento. Sua gama de aplicações também se expandiu, desde a elucidação da estrutura molecular12,13, até a fluxômica14, atribuição de mistura 15,16,17, medições de difusão translacional 18, discriminação enantiomérica19, distribuição de unidades em copolímeros20, entre outras.

Historicamente, os experimentos de Banda Larga Pure Shift sofrem de baixa sensibilidade e métodos de processamento complicados, limitando seu escopo na avaliação de extratos biológicos8. Em 2014, Foroozandeh et al. publicaram um novo experimento Pure Shift, PSYCHE (Pure Shift Yielded by Chirp Excitation), baseado na sequência de pulso anti-z-COSY que produziu excelente desacoplamento homonuclear e melhores valores de sensibilidade21. No entanto, como o PSYCHE é um experimento de interferograma 2D em que pedaços de dados no domínio do tempo são adquiridos, ele sofre de artefatos periódicos de banda lateral que resultam de distorções de modulação de acoplamento J nas bordas do pedaço. Em misturas complexas, esses artefatos produzem sinais maiores do que aqueles associados a metabólitos presentes em concentrações muito baixas, dificultando a análise11. Existem dois métodos para remover esses artefatos - TSE-PHYCHE22 e uma modificação mais recente do experimento PSYCHE chamada SAPPHIRE-PSYCHE (Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution) 23 .

Em 2019, demonstramos pela primeira vez11 que o método SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift, que remove artefatos com quase nenhuma penalidade de sensibilidade23, poderia ser empregado para a análise de misturas biológicas complexas, como extratos dos frutos de Physalis peruviana, comumente conhecidos como groselhas-do-cabo11. Mostramos que esses métodos aumentam o desempenho de análises de dados metabolômicos, como atribuição metabólica, análise de correlação e análise de coeficientes multivariados11. Desde então, vários estudos metabolômicos da Pure Shift em diferentes matrizes biológicas, como corais moles24, plantas hypericum25, mel26,27, chá27, óleo de hortelã-pimenta26 e nozes28 foram abordados, demonstrando sua importância como uma nova ferramenta para análise metabolômica. Paradoxalmente, a grande maioria desses estudos empregou a sequência de pulso PSYCHE padrão e fácil de implementar, disponível em qualquer biblioteca de espectrômetros, em vez da sequência de pulso SAPPHIRE-PSYCHE, que demonstrou ter um desempenho melhor. No entanto, requer uma melhor compreensão da sequência de pulso para uma configuração adequada.

Este artigo destina-se a ajudar novos usuários a aplicar os métodos Pure Shift no estudo de plantas, em particular, folhas de Vanilla sp (V. planifolia e V. pompona)29, tubérculos de batata (S. tuberosum)30 e groselhas-do-cabo (P. peruviana)31. A preparação da amostra, a configuração experimental da RMN, a aquisição de dados e a análise dos dados são descritas em detalhes. Além disso, o protocolo inclui notas-chave para ajudar os pesquisadores, novos no campo, a configurar adequadamente os experimentos PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE no perfil metabolômico de plantas.

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Protocolo

1. Preparação da amostra

  1. Groselhas do cabo
    1. Coloque 100-200 g de frutas frescas em um recipiente liquidificador. Conservar a 4 °C durante 30 min e homogeneizar em seguida num misturador de laboratório.
    2. Imediatamente, transfira o suco para tubos de plástico de 50 mL, congele-os em nitrogênio líquido e liofilize até a secura por 4 a 5 dias.
    3. Moa o material liofilizado até formar um pó fino usando um moedor elétrico.
      NOTA: O manuseio do material seco precisa ser feito rapidamente porque o pó é altamente higroscópico.
    4. Pesar 1 g do material moído e adicionar 10 mL de água ultrapura. Vórtice por 1 min.
    5. Sonicar durante 20 min a 10 °C e, em seguida, centrifugar a 23.000 × g durante 20 min a 10 °C.
    6. Recuperar o sobrenadante e filtrá-lo através de um filtro de seringa de politetrafluoretileno (PTFE) 0,45 μm de 13 mm.
    7. Liofilize 1 mL do extrato filtrado até a secura e, em seguida, ressuspenda o sólido obtido em 0,9 mL de tampão oxalato de sódio 200 mM pH 4. Vórtice.
    8. Liofilize a amostra resultante até a secura e dissolva-a em 0,9 mL de óxido de deutério contendo 5 mM de sal de sódio ácido 3-(trimetilsilil)propiônico-2,2,3,3-d4 (TMSP-d4).
    9. Encha o tubo de RMN com 0,6 mL da amostra usando uma micropipeta.
  2. Folhas de baunilha
    1. Recolha as folhas, limpe-as com papel de seda úmido e congele-as inteiras em nitrogênio líquido.
    2. Quebre as folhas em pedaços pequenos e liofilize por 4 dias até secar.
    3. Moa a matéria seca até formar um pó fino usando um moedor elétrico.
    4. Pese 50 mg de material moído e adicione 0,75 mL de tampão fosfato pH 6,0 em óxido de deutério contendo 0,1% de TMSP (p / p) e 0,75 mL de metanol-d4. Vórtice por 1 min.
    5. Sonicar durante 20 min a 25 °C.
    6. Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 25 °C.
    7. Recupere o sobrenadante (~1,3-1,4 mL) e filtre-o através de um filtro de seringa de PTFE de 13 mm de 0,45 μm.
    8. Encha o tubo de RMN com 0,6 mL da amostra filtrada usando uma micropipeta.
  3. Tubérculos de batata
    1. Descasque e corte de 4 a 8 tubérculos. Imediatamente, coloque aproximadamente 125 g de material em sacos stand-up e congele-os em nitrogênio líquido.
      NOTA: Para evitar oxidação durante o manuseio, mantenha a batata úmida.
    2. Liofilizar por 4 a 6 dias até a secura completa.
    3. Moa a matéria seca até formar um pó fino usando um moedor elétrico.
    4. Pese 160 mg de tubérculo moído e adicione 1,6 mL de água deionizada. Vórtice por 1 min.
    5. Sonicar durante 45 min a 10 °C.
    6. Centrifugue a 23.000 x g por 20 min a 10 °C.
    7. Recuperar o sobrenadante (~1,5 -1,6 ml) e evaporar-se até à secura num concentrador centrífugo a vácuo refrigerado durante 16 h, a 10 °C.
    8. Adicione ao sólido obtido (20-25 mg) 0,9 mL de tampão oxalato de sódio 100 mM pH 4, vórtice e evapore por 16 horas a 10 ° C.
    9. Dissolver o sólido obtido em 0,9 ml de óxido de deutério contendo 3 mM de TMSP.
    10. Centrifugue a 23.000 x g por 5 min a 10 °C e filtre o sobrenadante diretamente no tubo de RMN através de um filtro de seringa de PTFE 0,45 μm de 13 mm.
      NOTA: Neste caso, a filtração direta no tubo de RMN foi realizada para diminuir as etapas na preparação de mais de 1000 amostras.

2. Aquisição e processamento de dados de RMN

  1. Configuração inicial de RMN
    1. Transferir as amostras para o espectrómetro de RMN.
    2. Ajuste e combine a cabeça de sonda.
    3. Trave e calce a amostra.
    4. Calibre o pulso forte de 90°. Calibre o pulso de 90° usando qualquer um dos procedimentos padrão.
    5. Execute um espectro de RMN de prótons 1D padrão.
  2. Experiência PSYCHE
    1. Selecione a sequência de pulso reset_psyche_1d na biblioteca Bruker Topspin (Figura S1). Use os seguintes parâmetros padrão: largura espectral de 5 kHz (SW2), pelo menos 1 ou 2 segundos de atraso de recuperação de relaxamento (D1), 16 varreduras fictícias (DS), 64 ou 128 pontos de dados complexos por bloco (L31) e 64 ou 128 varreduras (NS) (Figura S1).
      NOTA: L31 é o número de pontos digitais complexos adquiridos em cada bloco Pure Shift, melhor para ser definido como uma potência de 2. 21
    2. Defina a excitação desejada do ângulo de inversão do pulso CHIRP (CNST61) e 10 kHz para a largura de banda do pulso CHIRP (CNST60) (Figura S2).
      NOTA: O experimento PSYCHE é baseado em um esquema anti-z-COSY; consequentemente, o ângulo de inversão do pulso CHIRP precisa ser pequeno para evitar artefatos de reacoplamento (Figura 1). A intensidade absoluta aumenta com o ângulo de inversão de excitação. Os artefatos periódicos também são aprimorados, espalhando-se pelo espectro e aumentando o "ruído" (Figura 1). O "ruído" torna-se uma combinação de ruído padrão e artefatos chuncking. Um bom compromisso entre sensibilidade e artefatos de baixo reacoplamento é definir CNST61 = 20°. 19,22
    3. Defina o comprimento do pulso forte (P1) para o valor previamente calibrado e o comprimento do pulso da forma PSYCHE para 30 ms (P49) (Figura S2).
      NOTA: É muito importante calibrar o valor do pulso forte, pois as potências do pulso da forma serão calculadas automaticamente a partir desse valor.
    4. Escolha o pulso de forma Crp_psyche.20 (SPNAM 37) para o elemento PSYCHE (Figura S2).
    5. Defina a intensidade do gradiente do campo de pulso aplicado durante o elemento PSYCHE (GPZ0). Escolha RECT.1 para o pulso de forma de gradiente (GPNAM 0) (Figura S2).
      NOTA: Um gradiente de campo magnético fraco é aplicado durante o elemento PSYCHE, normalmente, entre 1% a 4% da força máxima do gradiente, dependendo da sonda.
    6. Defina o número de blocos a serem adquiridos para reconstruir o Pure Shift FID (TD1) (Figura S3).
      NOTA: O PSICHE é adquirido como um experimento pseudo-2D onde TD1 é o número de blocos de interferograma Pure Shift. A resolução do espectro depende do tamanho da janela espectral (SW1) e do número total de pontos adquiridos, que é TD1*2*L31. Normalmente, 16 ou 32 blocos com 64 ou 128 pontos complexos por bloco fornecerão resolução digital suficiente. Como o PSYCHE é registrado de forma interferograma, um número maior de blocos aumenta a resolução digital, mas também o tempo total de aquisição19. Os acoplamentos J homonucleares evoluem durante cada bloco, resultando em um padrão de modulação J oscilante21,23. Após a transformada de Fourier, isso gera artefatos periódicos de banda lateral que dependem do comprimento do bloco (Figura 2). Para reduzir os artefatos, a duração do bloco deve ser curta, normalmente inferior a 16 ms (duração do bloco = 2*in0: Figura S1). Se a duração do bloqueio for alta, reduza L31.
    7. Processe os dados com o programa Proc_reset AU da Bruker e a transformada de Fourier.
      NOTA: Recomendamos transformar o espectro usando preenchimento zero e uma apodização de sino senoidal (Figura S4).
  3. Experiência SAPPHIRE-PSYCHE
    1. Selecione a sequência de pulsos SAPPHIRE-PSYCHE e defina os parâmetros da sequência de pulsos. Os parâmetros padrão seriam os seguintes: largura espectral de 5 kHz (SW3), pelo menos 1 ou 2 segundos de atraso de relaxamento (D1), 16 varreduras fictícias (DS), 8 ou 16 varreduras por incremento (NS) e D2 a 14 ms (Figura S5).
      NOTA: Esta sequência não está no repertório de Bruker, no entanto, a sequência e os programas de processamento podem ser obtidos no site do Manchester NMR Methodology Group, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23. O atraso D2 garante que o relaxamento T2 permaneça constante a cada incremento de modulação J. D2 precisa ser maior que 1/4*SW1+p16+2*d16. 23
    2. Defina a excitação desejada do ângulo de inversão do pulso CHIRP (CNST20) e 10 kHz para a largura de banda do pulso CHIRP (CNST21) (Figura S6).
      NOTA: Como no experimento PSYCHE regular, o ângulo de inversão do pulso CHIRP precisa ser curto para evitar artefatos de reacoplamento. CNST20 = 20° é um bom compromisso entre sensibilidade e artefatos de baixo reacoplamento 21,23,25.
    3. Defina o comprimento do pulso forte (P1) para o valor previamente calibrado e o comprimento do pulso da forma PSYCHE para 30 ms (P40) (Figura S6).
      NOTA: É importante calibrar o valor do pulso forte, pois as potências do pulso da forma serão calculadas automaticamente a partir dele.
    4. Escolha o pulso de forma PSYCHE_Saltire_10kHz_30m para o elemento PSYCHE (Figura S6).
    5. Defina a intensidade do gradiente do campo de pulso aplicado durante o elemento PSYCHE (GPZ10). Escolha RECT.1 para o pulso de forma de gradiente (GPNAM 10) (Figura S7).
      NOTA: Um gradiente de campo magnético fraco é aplicado durante o elemento PSYCHE, normalmente, entre 1% e 4% da força máxima do gradiente, valor que depende da sonda.
    6. Defina o número de incrementos de modulação SAPPHIRE J em F2 (TD2) (Figura S7).
      NOTA: normalmente 8 incrementos garantem uma excelente supressão de artefatos de banda lateral (Figura 2 e 3). O número total de varreduras do Pure Shift FID final é NS*TD2. 23
    7. Defina as janelas espectrais F1 e F2 (SW1 e SW2) (Figura S5).
      NOTA: SW2 = SW3 / (2 * TD2) e SW3 / SW1 = TD2 * N, onde TD2 e N são números inteiros pares23. O experimento SAPPHIRE-PSYCHE é adquirido como um pseudo 3D onde F2 codifica a modulação de fase do artefato de acoplamento J e F1 a aquisição de interferograma Pure Shift20. Como o SAPPHIRE-PSYCHE remove as bandas laterais de modulação J , a duração do bloqueio Pure Shift do interferograma pode ser maior do que o PSYCHE regular (duração do bloco Pure Shift = 1 / SW1), normalmente entre 20 a 40 ms (Figura 2). No entanto, a aquisição de dados de chunk mais longo leva a evoluções de acoplamento J mais altas, o que exigiria mais incrementos de modulação de fase de acoplamento J para remover as bandas laterais mais fortes alcançadas23.
    8. Defina o número de blocos Pure Shift (TD1) (Figura S7).
      NOTA: Como o SAPPHIRE-PSYCHE precisa compensar a modulação de fase do acoplamento J do primeiro bloco, um bloco extra precisa ser adquirido. Normalmente, 17 (16+1) ou 33 (32+1) blocos fornecem resolução digital suficiente23.
    9. Processe os dados executando os programas pm_pshift e pm_fidadd AU seguidos pela transformada de Fourier23.
      NOTA: Recomendamos transformar o espectro usando preenchimento zero e uma apodização de sino senoidal (Figura S4).

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Resultados

Análise de espectro de RMN
Os experimentos PSYCHE aumentam a resolução dos espectros colapsando ressonâncias acopladas em singlets21, o que, por sua vez, reduz a sobreposição e facilita a atribuição e a análise de dados. A RMN Pure Shift pode ser aplicada a extratos vegetais. Aqui demonstramos seu uso em três matrizes diferentes: folhas de baunilha, tubérculos de batata e frutos de Physalis peruviana . O aumento da resolução alcançado nos espectros desses extratos vege...

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Discussão

A identificação e quantificação estrutural de metabólitos são questões fundamentais na caracterização do metaboloma, dados que, quando submetidos a análises multivariadas, permitem compreender melhor o sistema biológico em estudo. A preparação da amostra e a aquisição de dados são aspectos críticos que precisam de otimização para fornecer resultados confiáveis.

Neste artigo, descrevemos e ilustramos a preparação da amostra para análise de RMN de três matrizes ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - Contrato # 008-2017-FONDECYT.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
77500 Series Freezone 4,5 litros bancadaLabconco77500
Bruker Avance III 500 MHz equipado com uma sonda criogênica TCI Z-gradient de 5 mmBruker Corporation
Concentradores centrífugos refrigerados Centrivap Labconco 7310000 SeriesLabconco7310000
Óxido de deutérioSigma-Aldrich151882
Máquina de moer MKM6003BoschMKM6003
Licuadora Blender 8011S modelo Hgb2wts3WaringHgb2wts3
Metanol-d4Sigma-Aldrich151947

Referências

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