Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Summary

Aqui, são descritos métodos detalhados para gerar, manter e caracterizar organoides do intestino delgado e do cólon derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Esses métodos são projetados para melhorar a reprodutibilidade, expandir a escalabilidade e diminuir o tempo de trabalho necessário para o revestimento e passagem de organoides.

Abstract

A especificação regional intestinal descreve um processo pelo qual morfologia e função únicas são transmitidas a áreas definidas do trato gastrointestinal (GI) em desenvolvimento. A especificação regional no intestino é impulsionada por várias vias de desenvolvimento, incluindo a via da proteína morfogenética óssea (BMP). Com base na especificação regional normal, foi desenvolvido um método para gerar organoides colônicos humanos (HCOs) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), que incluem células-tronco embrionárias humanas (hES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Uma indução de três dias de sinalização de BMP padroniza suficientemente as culturas de tubos do intestino médio / posterior em HCOs especiais que expressam a proteína de ligação à sequência rica em AT 2 (SATB2) contendo todos os principais tipos de células epiteliais presentes no cólon humano, bem como células mesenquimais em co-desenvolvimento. A omissão de BMP (ou adição do inibidor de BMP NOGGIN) durante este período crítico de padronização resultou na formação de organoides intestinais humanos (HIOs). HIOs e HCOs se assemelham morfologicamente e molecularmente ao intestino delgado e cólon em desenvolvimento humano, respectivamente. Apesar da utilidade de HIOs e HCOs para estudar o desenvolvimento intestinal humano, a geração de HIOs e HCOs é desafiadora. Este artigo apresenta métodos para gerar, manter e caracterizar HIOs e HCOs. Além disso, as etapas críticas no protocolo e as recomendações de solução de problemas são fornecidas.

Introduction

Estudar o desenvolvimento do cólon humano é difícil devido às restrições ao uso de tecido fetal humano. Os modelos animais têm sido inestimáveis e historicamente usados para abordagens genéticas em camundongos para estudar o desenvolvimento intestinal. No entanto, as diferenças entre o desenvolvimento intestinal de camundongos e humanos limitam a aplicabilidade de camundongos como sistema modelo. Por exemplo, embora a formação de criptas no intestino delgado e no cólon de camundongos ocorra no pós-natal^{, os humanos} nascem com criptas totalmente formadas. Além disso, o intestino delgado e o cólon humanos contêm ....

Protocol

1. Geração de organoides intestinais e colônicos humanos

1. Preparação de placas revestidas com ECM
   1. Adicione 50 mL de meio DMEM frio em um tubo cônico de 50 mL.
   2. Remova uma alíquota de 4x ECM qualificado para hESC (consulte a Tabela de Materiais) do freezer a -80 ° C e descongele no gelo.
      NOTA: Consulte o certificado de análise do produto para determinar o volume de ECM qualificado pela ESC necessário para preparar um estoque 4x.
   3. Se o ECM qualificado para hESC não estiver totalmente descongelado, pegue 750 μL de DMEM do tubo cônico de 50 mL e misture-o com o ECM.
   4. T....

Results

A geração bem-sucedida de esferoides durante o estágio de indução do intestino médio / posterior é indicativa de padronização bem-sucedida. Execute a coloração IF para CDX2 em esferoides flutuantes e na monocamada para confirmar se o padrão está correto. Embora a coloração no estágio de endoderme definitiva (DE) possa indicar a eficácia da indução de ED, a geração de esferoides não é possível sem uma indução eficiente de ED. Para testar a eficiência da indução de DE, realize coloração IF e/ou RT-qPCR para FOXA2 e SOX17.<.......

Discussion

A diferenciação de hPSCs em HIOs e HCOs é um processo complexo que requer controles de qualidade em cada etapa. As hPSCs iniciais precisam ter diferenciação mínima antes de iniciar a diferenciação em DE. Otimizar a densidade de hPSCs plaqueadas para diferenciação DE é fundamental para o sucesso do protocolo. Para garantir a qualidade da diferenciação DE, execute IF para FOXA2 e SOX17 para determinar a eficiência da diferenciação DE. A diferenciação de DE deve resultar em mais de 80% das .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1%	N/A	N/A	N/A
Tubo Corning de 15 mL	Falcão	21008-918	N/A
30% de sacarose	N/A	N/A	Feito em PBS.
5% de soro de burro normal	Laboratório de ImunoPesquisa Jackson	017-000-121	N/A
Tubo Corning de 50 mL	Falcão	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Científico	A1110501	Solução de descolamento celular; alíquota de 5 mL de Accutase em tubos de 10 mL totalizando 20 tubos e armazenar a -20 ° C por até 6 meses. Coloque em 4 &graus; C durante a noite antes de usar.
Ativina A	Sistemas de orientação celular	GFH6-100x10	Reconstitua o pó liofilizado a 100 µ g/mL em PBS estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA). Alíquota 38 µ L de Activina A em tubos de microcentrífuga pré-resfriados e armazenar a -80 ° C (Os tubos expiram 12 meses a partir da data de recebimento).
Activin Dia 1 médio (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use aminoácidos não essenciais (NEAA, Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 1: 500 mL de RPMI 1640 e 500 mL de NEAA. Ao preparar o meio Activin Day 1, adicione 13 mL de meio básico dia 1, 13 µ l de Activina A (100 µ g/mL) e 2 µ l de BMP4 (100 µ g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Activin Dia 2 médio (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use aminoácidos não essenciais (Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 2: 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA e 1 mL de soro a 0,2%. Ao preparar o meio Activin Day 2, adicione 12,5 mL de meio básico dia 2 e 12,5 µ L de Activin A (100 µ g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Activin Dia 3 médio (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use aminoácidos não essenciais (Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 3: 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA e 10 mL de soro a 2%. Ao preparar o meio Activin Day 3, adicione 12,5 mL de dia básico 3 e 12,5 µ L de Activin A (100 µ g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Alexa Fluor 488 Burro anti-cabra	Thermo Científico	Rolamento A11055	Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Alexa Fluor 488 Burro anti-Coelho	Thermo Científico	A21206	Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Alexa Fluor 546 Burro anti-rato	Thermo Científico	Resposta A10036	Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Alexa Fluor 647 Burro anti-rato	Thermo Científico	Resposta 31571	Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Molde de base	Pescador	22-363-552	N/A
Meio intestinal básico (DMEM avançado)	Gibco	12491015	Ao preparar o meio intestinal básico, adicione 500 mL de DMEM, 500 mL de N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL de B27 (Gibco), 500 mL de L-Glutamina para obter 2 mM de L-Glutamina (Corning A2916801), 5 mL de 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina (Gibco 15-140-122) e 7,5 mL de  HEPES de 1 M para obter HEPES de 15 mM.  O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Sistema de detecção de PCR em tempo real Biorad CFX96 Touch	Biorad	N/A	Outros sistemas qRT-PCR podem ser usados.
Solução de recuperação celular	Corning	354253	Solução degradante de ECM
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitua adicionando 2,15 mL de DMSO a 10 mM. Prepare 50 µ L alíquotas e armazenar a -20 °C.  Armazene o pó a 4 & graus; C, protegido da luz.
Meio de padronização CTRL HIO	N/A	N/A	Meio intestinal básico e 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Diluição 1:100 (anticorpo secundário)
Monocamada DE	N/A	N/A	A monocamada foi gerada em etapas anteriores (Seção 4.4).
Exibir	Gibco	17105041	Ressuspenda o pó liofilizado em Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) até uma concentração final de 1 mg / mL. Filtre a solução para esterilização aspirando usando um tubo de esterilização com filtro Millipore. Faça alíquotas de 10 mL (1 mg / mL) e armazene a -20 graus; C por até 6 meses. Coloque em 4 &graus; C durante a noite antes de usar.
FEG	Thermo Científico	236-EG-01M	Ao preparar 100 ng/mL EGF reconstituir 500 µ g/mL em PBS estéril. Em seguida, adicione 2 mL de PBS estéril a 1 mg de EGF e faça 500 µ g/mL de solução EGF. Alíquota 100 µ L de EGF em 20 tubos.
Placas de Petri Fisherbrand 6 cm com tampa transparente	Pescador	FB0875713A	N/A
Levantador de células Fisherbrand	Pescador	08-100-240	N/A
Frascos de vidro transparente Fisherbrand Classe B com fechos anexados	Pescador	03-338B	N/A
Pipeta de Pasteur de Vidro Borossilicato Descartável Fisherbrand	Pescador	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Meio de Montagem Deslizante	VWR	100241-874	N/A
Gibco avançado DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Cabra anti-E-Caderina	R& D	AF648	Diluição 1:400 (anticorpo primário)
Cabra anti-SOX17	R& D	AF1924	Diluição de 1:500 (anticorpo primário)
HCOs padronizando o meio	N/A	N/A	Meio intestinal básico, 100 ng/mL EGF e 100 ng/mL BMP2. Ao preparar o BMP2, adicione 1 mL de HCl 4 mM estéril 0,1% BSA aos frascos para injetáveis de BMP2 (100 µ g). Alíquota 25 µ L de solução BMP4 em 4 tubos. O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Hemocitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)	Instalação de células-tronco pluripotentes	N/A	Células semeadas em uma placa de 24 poços revestida com Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Solução gelada de paraformaldeído a 4% (PFA)	N/A	N/A	N/A
Solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS)	N/A	N/A	O pH deve ser 7,4.
Caneta de barreira hidrofóbica ImmEdge	Laboratórios de vetores	101098-065	N/A
Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)	Instalação de células-tronco pluripotentes (Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati)	N/A	Outras linhas hESC ou iPSC podem ser usadas, mas o protocolo precisa ser otimizado para cada linha celular.
Micrótomo Leica	N/A	N/A	N/A
LSM 880			microscópio confocal
Matriz de Membrana Embasal Matrigel	Corning	354234	N/A
Matriz qualificada por Matrigel hESC	Corning	354277	Prepare 4 alíquotas de Matrigel que correspondem a volumes suficientes para fazer Matrigel diluído suficiente para pratos de 4 x 6 poços.
Meio de indução do intestino médio (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Aminoácidos não essenciais (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µ M CHIR99021 e 500 ng/mL FGF4. O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Esferoides do intestino grosso	N/A	N/A	N/A
Unidades de filtro a vácuo descartáveis estéreis MilliporeSigma Steriflip	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	Diluição de 1:300 (anticorpo primário)
Rato anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	Diluição 1:500
mTeSR1 meio de crescimento completo	Tecnologias de células-tronco	85870	Adicione 100 mL de suplemento de mTeSR (85870) em um meio de 400 mL de mTeSR (85870) e alíquota em tubos de 50 mL, evitando contaminação. Armazene a 4° C até o uso.
Solução clara de Murray (também conhecida como BABB)	Murray	N/A	benzoato de benzilo 1:2 e álcool benzílico.
Meio de padronização NOG HIO	N/A	N/A	Meio intestinal básico, 100 ng/mL EGF e 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µ g de NOGGIN em 250 µ l PBS estéril com 0,1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Outros kits de isolamento de RNA podem ser usados.
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 24 poços (Nunc)	Thermo Científico	73521-004	N/A
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 24 poços revestida com Matrigel	Thermo Científico	73521-004	N/A
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 6 poços (Nunc)	Thermo Científico	73520-906	N/A
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 6-poços revestidos com  Matrigel.	Thermo Científico	73520-906	N/A
Meio de crescimento para HIOs, CTRL HIOs e HCOs	N/A	N/A	Meio intestinal básico e 100 ng/mL EGF (concentração final)
Tampão fosfato salino, 0,5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Tecnologias de DNA integradas, Inc. (IDT)	N/A	Os primers estão listados na Tabela 2 do protocolo.
Coelho anti-CDX2	Marca de célula	EPR22764Y	Diluição 1:100 (anticorpo primário)
Coelho anti-SATB2	Marca de célula	EP281	Diluição 1:100 (anticorpo primário)
Proteína BMP-4 humana recombinante	R& D	314-BP-010	Reconstitua o pó liofilizado a 100 µ g/mL em HCl 4 mM estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA). Adicione 4,17 mL de solução de HCl a 45,83 mL de água molecular, totalizando 50 mL de 1 M de HCl. Em seguida, adicione 200 µ L de 1 M HCl a 49,8 mL de água de grau molecular, totalizando 50 mL de 4 mM HCl. Em seguida, adicione 0,05 g de BSA a 50 mL de HCl 4 mM e filtre para tornar estéril. Alíquota estéril 4 mM HCl 0,1% BSA para 33 tubos de microcentrífuga totalizando e armazenando a -20 ° C. Adicionar 100 ° C; l de HCl 4 mM estéril 0,1% BSA para os frascos BMP4 (10 µ g) fazer solução BMP4 a 100 µ g/mL.
Proteína FGF-4 humana recombinante	R& D	235-F4-01M	Reconstituir a 100 µ g/mL em PBS estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina. Adicione 0,05 g de BSA em 50 mL de PBS para obter 0,1% de BSA. Filtro 0.22 µ M BSA para esterilizar o BSA. Alíquota 10 mL de BSA 0,1% em 5 tubos. Adicione 1 mg de FGF-4 em 10 mL de BSA estéril a 0,1%. Alíquota 250 µ L em tubos de microcentrífuga pré-resfriados 40 e armazene a -80 ° C.
Inibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254	A concentração final é de 10 mM (10 mmol/L). Ressuspender em DMSO a 10 mM e esterilizar com filtro. Adicione 3 mL de PBS estéril a cada frasco. Aliqout 100 µ L de inibidor de ROCK em 30 tubos e armazenar a -20 °C.
Kit de síntese de cDNA SuperScript VILO	Thermo Científico	11-754-250	N/A
Lâminas de microscópio SuperFrost Plus
Composto Tissue Tek OCT	VWR	25608-930	N/A