Method Article

Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, são descritos métodos detalhados para gerar, manter e caracterizar organoides do intestino delgado e do cólon derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Esses métodos são projetados para melhorar a reprodutibilidade, expandir a escalabilidade e diminuir o tempo de trabalho necessário para o revestimento e passagem de organoides.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A especificação regional intestinal descreve um processo pelo qual morfologia e função únicas são transmitidas a áreas definidas do trato gastrointestinal (GI) em desenvolvimento. A especificação regional no intestino é impulsionada por várias vias de desenvolvimento, incluindo a via da proteína morfogenética óssea (BMP). Com base na especificação regional normal, foi desenvolvido um método para gerar organoides colônicos humanos (HCOs) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), que incluem células-tronco embrionárias humanas (hES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Uma indução de três dias de sinalização de BMP padroniza suficientemente as culturas de tubos do intestino médio / posterior em HCOs especiais que expressam a proteína de ligação à sequência rica em AT 2 (SATB2) contendo todos os principais tipos de células epiteliais presentes no cólon humano, bem como células mesenquimais em co-desenvolvimento. A omissão de BMP (ou adição do inibidor de BMP NOGGIN) durante este período crítico de padronização resultou na formação de organoides intestinais humanos (HIOs). HIOs e HCOs se assemelham morfologicamente e molecularmente ao intestino delgado e cólon em desenvolvimento humano, respectivamente. Apesar da utilidade de HIOs e HCOs para estudar o desenvolvimento intestinal humano, a geração de HIOs e HCOs é desafiadora. Este artigo apresenta métodos para gerar, manter e caracterizar HIOs e HCOs. Além disso, as etapas críticas no protocolo e as recomendações de solução de problemas são fornecidas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudar o desenvolvimento do cólon humano é difícil devido às restrições ao uso de tecido fetal humano. Os modelos animais têm sido inestimáveis e historicamente usados para abordagens genéticas em camundongos para estudar o desenvolvimento intestinal. No entanto, as diferenças entre o desenvolvimento intestinal de camundongos e humanos limitam a aplicabilidade de camundongos como sistema modelo. Por exemplo, embora a formação de criptas no intestino delgado e no cólon de camundongos ocorra no pós-natal, os humanos nascem com criptas totalmente formadas. Além disso, o intestino delgado e o cólon humanos contêm tipos de células que não são encontrados em camundongos, incluindo células enteroendócrinas que expressam motilina (MLN) no intestino delgado2 e células caliciformes que expressam mucina 5B (MUC5B) no cólon 3,4. Por esse motivo, é importante ter um sistema de cultura de células que modele com precisão os eventos moleculares dinâmicos que definem os estágios iniciais do desenvolvimento do cólon. Portanto, direcionar as hPSCs para gerar células com características do cólon fornece um modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento do cólon humano.

Protocolos foram desenvolvidos para facilitar a formação reprodutível5, síncrona e eficiente de organoides semelhantes ao intestino6 e semelhantes ao cólon7 a partir de hPSCs. Esses protocolos usam um procedimento de diferenciação gradual que imita o desenvolvimento do intestino e cólon fetal (Figura 1). Primeiro, o endoderma definitivo é gerado a partir de células-tronco pluripotentes humanas por tratamento com Activin A, um mimético nodal. A exposição do endoderma definitivo a altos níveis de WNT e fator de crescimento de fibroblastos (FGF) induz morfogênese em esferoides do tubo médio/ posterior CDX2+. Os esferoides do intestino médio / posterior são então incorporados na matriz extracelular (ECM) e padronizados em HIOs ou HCOs por meio de uma manipulação transitória da sinalização BMP. Inibir a sinalização de BMP usando NOGGIN ou adicionando apenas meio de crescimento resulta na formação de HIOs, que se assemelham ao intestino delgado proximal humano.

Ao ativar a sinalização BMP usando BMP2, os esferóides do intestino médio / posterior são padronizados em HCOs, que retêm padrões no epitélio e no mesênquima7. Os HCOs contêm células caliciformes enriquecidas com MUC5B e são competentes para gerar células enteroendócrinas que expressam insulina 5 (INSL5) específicas do cólon. O mesênquima isolado de HCOs expressa homeobox A13 (HOXA13) e HOXD13, que também são expressos no mesênquima primário do cólon humano8. É importante lembrar que a etapa de padronização ocorre durante os dias 7 a 10 do protocolo de diferenciação. Este período de três dias é suficiente para induzir o padrão colônico que é mantido após a cultura in vitro estendida.

Os protocolos descritos abaixo são para pesquisadores familiarizados com a cultura de hPSC livre de alimentadores. Para pesquisadores que não estão familiarizados com esse tipo de cultura de hPSC, recomenda-se um curso de treinamento em hPSCs, como os oferecidos pela Stem Cell Technologies ou pela Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) do Cincinnati Children's Hospital. A qualidade dos hPSCs iniciais é crítica e pode afetar todas as etapas a jusante. O protocolo a seguir começaria com hPSCs que foram cultivados por 4 dias e estão prontos para se dividir.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Geração de organoides intestinais e colônicos humanos

  1. Preparação de placas revestidas com ECM
    1. Adicione 50 mL de meio DMEM frio em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Remova uma alíquota de 4x ECM qualificado para hESC (consulte a Tabela de Materiais) do freezer a -80 ° C e descongele no gelo.
      NOTA: Consulte o certificado de análise do produto para determinar o volume de ECM qualificado pela ESC necessário para preparar um estoque 4x.
    3. Se o ECM qualificado para hESC não estiver totalmente descongelado, pegue 750 μL de DMEM do tubo cônico de 50 mL e misture-o com o ECM.
    4. Transfira a mistura ECM qualificada para DMEM/hESC para o tubo cônico de 50 mL com DMEM e misture bem. Adicione 0,5 mL por poço em cada uma das placas de cultura de células de 4 x 24 poços.
    5. Agite as placas para espalhar o ECM uniformemente por todo o poço para garantir que toda a superfície seja coberta. Usando parafilme, sele as placas revestidas com ECM e deixe-as em temperatura ambiente em um gabinete de biossegurança por pelo menos 1 h. Armazene as placas revestidas com ECM a 4 °C por até 2 semanas ou até que seja necessário.
  2. hPSCs de revestimento de célula única
    1. Coloque uma placa de 24 poços revestida com ECM dentro de um gabinete de biossegurança por 30 minutos para permitir que ela atinja a temperatura ambiente.
    2. Coloque o meio completo mTeSR1, a solução de descolamento celular e o DMEM avançado dentro de um banho-maria a 37 °C e deixe-os aquecer por 30 min.
    3. Verifique se as hPSCs são pelo menos 85% confluentes com diferenciação mínima. Remova todas as células diferenciadas, se necessário.
    4. Prepare o meio de plaqueamento em um tubo cônico de 50 mL da seguinte forma: 13 mL de mTeSR1 e 13 μL de inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK) 10 mM.
      NOTA: Y-27632 inibe o anoikis e aumenta a sobrevivência de células individuais.
    5. Para coletar células de uma placa de 6 poços, aspire o meio de 3 a 4 poços e lave uma vez com 2 mL de DMEM avançado por poço.
    6. Aspire o DMEM avançado e dispense 1 mL da solução de dissociação celular em cada poço. Incubar a placa durante 5-7 min dentro de uma incubadora a 5% de CO2, 37 °C. Verifique ao microscópio se as células estão em suspensão.
    7. Dissocie quaisquer aglomerados de células restantes pipetando para cima e para baixo 4-5 vezes usando uma pipeta de 5 mL.
    8. Adicione 2 mL de DMEM avançado em cada poço, pipete suavemente para cima e para baixo 4-5 vezes e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Gire as células a 300 × g por 3 min em temperatura ambiente.
    9. Aspirar o meio do tubo sem aspirar o sedimento celular e adicionar 6 ml do meio preparado de mTeSR1 mais inibidor de ROCK. Ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes e, em seguida, transfira a suspensão para o resto do meio inibidor de mTeSR1 / ROCK dentro do tubo de 50 mL. Ressuspenda vigorosamente 4-5 vezes e conte as células usando um hemacitómetro.
    10. Aspire o ECM da placa de 24 poços antes de plaquear as células. Ressuspenda as células novamente pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes e dispense 0,5 mL da suspensão celular em cada poço.
      NOTA: A densidade ideal de revestimento precisa ser determinada pelo experimentador. Aqui, o número ideal de células é de 80.000 a 200.000 células por poço.
    11. Balance suavemente a placa 3 vezes no sentido horário, 3 vezes no sentido anti-horário, 3 vezes para frente e para trás e 3 vezes de um lado para o outro para dispersar uniformemente as células.
    12. Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C e CO2 a 5% e incubar durante 24 h.
      NOTA: Não perturbe a placa nas primeiras horas para garantir a dispersão adequada das células dentro dos poços.
    13. Após 24 h ( Figura 2A ), aspire o meio gasto, adicione 0,5 mL por poço de mTeSR1, incube novamente a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h ( Figura 2B ) e, em seguida, prossiga para a próxima etapa.
  3. Diferenciação do endoderma definitivo (DE) das hPSCs
    1. Em um tubo cônico de 15 mL, adicione 13 mL de meio Activin Day 1 (consulte a Tabela de Materiais), 13 μL de 100 μg / mL de Activin A e 1,95 μL de 100 μg / mL BMP4. Aquecer o meio num banho-maria a 37 °C.
    2. Aspire o meio mTeSR1 da placa de 24 poços e adicione 0,5 mL de meio Activin Day 1 por poço. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C, CO5% 2 e incubar durante 24 h. Verifique as células após 24 h.
      NOTA: A morte celular extensa deve ser aparente, conforme ilustrado na Figura 2C. Embora a monocamada pareça esparsa, as colônias de células terão se expandido.
    3. Prepare o meio completo de Activin Day 2 adicionando 12,5 μL de 100 μg / mL de Activin A em 12,5 mL de meio Activin Day 2 em um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C.
    4. Retire a placa de diferenciação de 24 poços da incubadora de CO2 e remova o meio gasto. Dispense 0,5 mL de meio Activin Day 2 pré-aquecido por poço e coloque a placa de volta dentro da incubadora de CO2 por 24 h.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao dispensar o meio. Não dispense o meio diretamente no centro do poço, pois isso desprenderá as células da monocamada. Dispense cuidadosamente o meio na lateral do poço. No dia seguinte, uma monocamada de células é formada com morte celular insignificante. As células agora devem ser ~ 90 a 95% confluentes (Figura 2D).
    5. Prepare o meio completo Activin Day 3 adicionando 12,5 μL de 100 μg / mL de Activin A em 12,5 mL de meio Activin Day 3 em um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C.
    6. Remova o meio gasto e dispense 0,5 mL de meio Activin Day 3 por poço.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao dispensar o meio. Não dispense o meio diretamente no centro do poço, pois isso desprenderá as células da monocamada. Dispense cuidadosamente o meio na lateral do poço. No dia seguinte, a monocamada deve atingir a confluência total com pouca ou nenhuma morte celular neste estágio. Não tente gerar esferóides do intestino médio se a monocamada não for confluente 24 h após a adição do meio Activin Day 3. Consulte a Figura 2E para obter a morfologia ideal da monocamada DE antes de prosseguir para a geração de esferóides do intestino médio.
    7. Realize a coloração por imunofluorescência (IF) da monocamada para a expressão da proteína A2 da caixa de garfo (FOXA2) e do fator de transcrição 17 da caixa da região determinante do sexo (SRY) (SOX17) ao otimizar a diferenciação DE.
  4. Diferenciação de DE em esferoides do intestino grosso
    1. Em um tubo cônico de 50 mL, adicione 25 mL de meio de indução do intestino médio com FGF4 (sem CHIR99021) e coloque-o em banho-maria a 37 ° C por 30 min.
    2. Para preparar o meio de indução completo do intestino médio, adicione 7,5 μL de CHIR99021 depois que o meio estiver quente.
    3. Remova o meio gasto, dispense 0,5 mL de meio de indução do intestino médio por poço e incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.
    4. Após a condensação das células dentro da monocamada ter ocorrido no dia seguinte (Figura 3A), substitua o meio gasto por meio de indução fresco do intestino médio e coloque a placa de volta em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% por 24 h.
      NOTA: As estruturas tubulares serão perceptíveis após 48 h de indução do intestino médio, conforme mostrado na Figura 3B. Os esferoides do intestino grosso começarão a brotar da monocamada no dia 3, conforme ilustrado na Figura 3C.
    5. Para evitar descartar os esferóides flutuantes durante a troca do meio, transfira o meio antigo para um tubo de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 1 min. Ressuspenda os esferóides em 12,5 mL de meio de indução do intestino médio fresco, adicione 0,5 mL por alvéolo na mesma placa de 24 poços e incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.
    6. No dia 4 da indução do intestino grosso (Figura 3D), colha esferóides flutuantes dos poços da placa coletando o meio em um tubo de 15 mL seguido de centrifugação a 300 × g por 1 min. Prossiga para a próxima etapa para incorporar esferoides do intestino médio na ECM.
  5. Plaqueamento e padronização de esferoides do intestino médio/posterior em ECM
    1. Descongele a matriz da membrana basal ECM a 4 °C durante a noite antes da incorporação.
      NOTA: Este ECM é diferente do ECM qualificado para hESC. O ECM deve ser colocado em gelo e o volume apropriado de ECM pode ser aliquotado em tubos de microcentrífuga pré-resfriados de 1,5 mL no gelo. A Tabela 1 contém informações sobre o volume do ECM. Certifique-se de que o volume de ECM seja de pelo menos 75% na gotícula na qual os esferoides serão incorporados.
    2. Aquecer uma placa de 24 poços numa incubadora a 37 °C.
    3. Colete os esferóides flutuantes de todos os 24 poços usando uma pipeta de 1000 μL e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL. Gire os esferóides a 300 × g por 1 min em temperatura ambiente. Aspirar a maior parte do meio, mas deixar o volume necessário para o plaqueamento (Tabela 1).
    4. Prepare ponteiras de pipeta de 1000 μL e 200 μL cortando suas extremidades. Retire a placa pré-aquecida de 24 poços.
    5. Misture os esferóides flutuantes, transfira o volume apropriado para o tubo ECM colocado no gelo e, em seguida, ressuspenda os esferóides e o ECM pipetando para misturá-los bem.
    6. Pegue 65 μL da mistura de esferoides e ECM com as pontas de pipeta cortadas de 200 μL e carregue no centro de cada poço na placa de 24 poços. Para garantir que uma boa gota de ECM seja formada, levante a pipeta suave e lentamente enquanto a mistura é dispensada.
      NOTA: Placa 30-100 esferóides por poço.
    7. Transfira suavemente a placa para uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e incube por 5 min.
    8. Vire a placa de cabeça para baixo e incube por 15-25 min, o que ajudará as gotículas de ECM a manter uma estrutura semelhante a uma cúpula.
    9. Durante a incubação, prepare o meio necessário e aqueça-o. Assim que o ECM estiver solidificado, adicione 0,5 mL de meio de padronização HIO ou HCO em cada poço e incube a 37 °C, 5% de CO2. Consulte a Figura 3E para obter uma imagem de esferoides no ECM.
    10. Cultive os esferóides no meio de padronização por 3 dias.
    11. Após 3 dias, troque o meio de padronização HIO ou HCO para o meio de crescimento normal e incube a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Os organoides neste momento (Dia 10) são organoides em estágio inicial. Com base no objetivo do projeto, alguns organoides em estágio inicial podem ser usados para análise de padronização inicial, conforme detalhado na seção 2.
  6. Crescimento e passagem de organoides intestinais e colônicos humanos
    1. Após o dia 10, troque o meio de crescimento a cada 3 dias.
      NOTA: Dependendo da densidade de revestimento e do crescimento dos organoides, podem ser necessárias mudanças de mídia mais frequentes. As mudanças do meio devem ser feitas antes que o vermelho de fenol (indicador de pH) no meio fique amarelo.
    2. Incube os organoides até o dia 21 (Figura 3F).
      NOTA: O tratamento com BMP2 resultará em um número reduzido de organoides (~ 3 vezes menos que os HIOs) que crescem a partir de esferóides. Portanto, um número maior de esferoides precisa ser plaqueado para a geração de HCOs.
  7. Divisão de organoides no dia 21
    1. Inspecione os organoides.
      NOTA: Os organoides precisam ser divididos no dia 21, pois o ECM está quase degradado no dia 21 devido ao crescimento e expansão dos organoides.
    2. Prepare as pontas da pipeta de 1000 μL e 200 μL cortando suas extremidades.
    3. Aquecer uma placa Nunc de 24 poços numa incubadora a 37 °C.
    4. Alíquota do volume apropriado de ECM nos tubos pré-resfriados de 1,5 mL (Tabela 1).
    5. Raspe suavemente a gota de ECM com os organoides com uma ponta de pipeta de 1000 μL e pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes para quebrar o ECM.
    6. Transferir a mistura para uma placa de Petri de 60 mm e verificar os organoides ao microscópio. Se necessário, separe os organoides uns dos outros usando uma pinça estéril. Certifique-se de que a separação não danifique o epitélio dos organoides.
    7. Transferir os organoides para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 × g durante 30 s. Aspire o sobrenadante e deixe ~ 1 mL de meio no tubo.
      NOTA: O volume do meio pode ser alterado com base no objetivo do experimento. Se forem necessários mais organoides por gotícula de ECM, o volume do meio pode ser diminuído. No entanto, se menos organoides forem necessários, o volume do meio pode ser aumentado.
    8. Misture bem os organoides, transfira o volume apropriado para o tubo ECM colocado no gelo e, em seguida, ressuspenda os organoides e o ECM pipetando para misturá-los bem.
    9. Adicione 65 μL da mistura de esferoides e ECM ao centro de cada poço da placa de 24 poços usando as pontas de pipeta cortadas de 200 μL.
      NOTA: É fundamental pegar os organoides primeiro e depois o ECM durante a pipetagem. Assim, ao dispensar a mistura, os organoides estão no topo da gota da MEC.
    10. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C, 5% CO2 por 5 min.
    11. Vire a placa de cabeça para baixo por mais 15-25 min para ajudar as gotículas de ECM a manter uma estrutura semelhante a uma cúpula.
    12. Adicione 0,5 mL de meio de crescimento HIO/HCO em cada poço e incube a 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: O meio de crescimento é o mesmo para HIOs e HCOs após a padronização.
    13. Troque o meio a cada 2-3 dias até o dia 35 (Figura 3G).

2. Verificação da padronização de organoides por reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR)

  1. Antes de coletar o RNA, prepare 1x tampão de lise de RNA seguindo as instruções do fabricante.
  2. Descarte o meio gasto e adicione 350 μL de tampão de lise a cada poço da placa de 24 poços. Lise os organoides pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de 1 mL. Para uma melhor lise, vórtice brevemente na velocidade máxima por 5 s.
  3. Manter todas as amostras a -80 °C até estarem prontas para a extração de ARN. Quando estiver pronto, remova as amostras de RNA do freezer a -80 ° C e descongele-as no gelo por 10 min. Vortex os tubos vigorosamente à temperatura ambiente por 10-15 min para garantir a lise completa das amostras.
  4. Coloque as amostras no gelo novamente e prossiga para a extração de RNA conforme as instruções do fabricante. Transferir as amostras de ARN para um congelador a -80 °C se não estiverem prontas para avançar para o passo seguinte.
  5. Realize extração de RNA, tratamento de DNAse, síntese de cDNA e RT-qPCR usando metodologia padrão. Consulte a Tabela 2 para obter uma lista de nomes e sequências de primers.

3. Verificação da padronização de organoides por imunofluorescência

  1. Coleta e fixação de organoides
    1. Aspire o meio HIO ou HCO dos poços apropriados e adicione 1 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) a cada poço. Dissocie os organoides do ECM usando uma ponta de pipeta cortada de 200 μL. Pipete para cima e para baixo para dissociar grandes pedaços de ECM dos organoides.
    2. Transfira os organoides para um tubo cônico de 15 mL e encha o resto do tubo com PBS gelado e misture delicadamente invertendo o tubo. Permita que os organoides se assentem por gravidade e aspire o PBS.
      NOTA: Se os organoides não assentarem por gravidade, centrifugue a 300 × g por 1 min.
    3. Aspire o PBS e adicione 1 mL de solução gelada de degradação de ECM. Mantenha o tubo no gelo por 10-15 min em uma plataforma giratória com agitação suave.
      NOTA: Incline o tubo em um ângulo de 45° para permitir a mistura adequada dos organoides e da solução de recuperação celular. Após 10-15 min, os organoides devem assentar no fundo do tubo, indicando a digestão completa da MEC.
    4. Adicione PBS frio no tubo até 15 mL; Misture bem invertendo o tubo várias vezes. Quando os organoides se depositarem no fundo do tubo, aspire o PBS e adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% pré-resfriado para fixar os organoides. Incube os organoides com paraformaldeído a 4% em gelo por 1 h.
    5. Encher o resto do tubo com PBS gelado e colocá-lo horizontalmente sobre uma plataforma de baloiço a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, descarte o paraformaldeído / PBS no recipiente de lixo especificado e lave uma vez com 15 mL de PBS gelado, conforme descrito na etapa 3.1.2.
    6. Aspire o PBS e encha o tubo com sacarose a 30% em PBS. Colocar o tubo horizontalmente numa plataforma de baloiço a 4 °C durante a noite.
    7. No dia seguinte, incorpore os organoides em um modelo básico de 7 mm x 7 mm x 5 mm com meio OCT e congele rapidamente usando um banho de gelo seco/etanol.
    8. Seque os blocos com lenços umedecidos, embrulhe-os em uma toalha de papel e mantenha-os em um freezer a -80 °C durante a noite. No dia seguinte, corte cortes de 5 μm nas lâminas do microscópio utilizando um criostato. Armazene as lâminas a -80 °C.
  2. Coloração por imunofluorescência dos organoides
    1. Processe as lâminas do freezer a -80 °C e execute a coloração IF usando protocolos padrão.
    2. Aplique lamínulas nas lâminas e seque-as à temperatura ambiente, protegidas da luz durante pelo menos 2 h ou durante a noite antes da obtenção de imagens.
    3. Visualize as lâminas usando uma objetiva de 25x de um microscópio confocal.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A geração bem-sucedida de esferoides durante o estágio de indução do intestino médio / posterior é indicativa de padronização bem-sucedida. Execute a coloração IF para CDX2 em esferoides flutuantes e na monocamada para confirmar se o padrão está correto. Embora a coloração no estágio de endoderme definitiva (DE) possa indicar a eficácia da indução de ED, a geração de esferoides não é possível sem uma indução eficiente de ED. Para testar a eficiência da indução de DE, realize coloração IF e/ou RT-qPCR para FOXA2 e SOX17.<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A diferenciação de hPSCs em HIOs e HCOs é um processo complexo que requer controles de qualidade em cada etapa. As hPSCs iniciais precisam ter diferenciação mínima antes de iniciar a diferenciação em DE. Otimizar a densidade de hPSCs plaqueadas para diferenciação DE é fundamental para o sucesso do protocolo. Para garantir a qualidade da diferenciação DE, execute IF para FOXA2 e SOX17 para determinar a eficiência da diferenciação DE. A diferenciação de DE deve resultar em mais de 80% das ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O laboratório de Múnera é financiado pelo NIH / NCI 5U54CA210962-02 Centro de Pesquisa de Disparidades de Câncer da Carolina do Sul (SC CADRE), NIH / NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE em Doenças Digestivas e Hepáticas e NIH / NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Centro Central de Pesquisa de Doenças Digestivas.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1%N/AN/AN/A
Tubo Corning de 15 mLFalcão21008-918N/A
30% de sacaroseN/AN/AFeito em PBS.
5% de soro de burro normalLaboratório de ImunoPesquisa Jackson017-000-121N/A
Tubo Corning de 50 mLFalcão21008-951N/A
AccutaseThermo CientíficoA1110501Solução de descolamento celular; alíquota de 5 mL de Accutase em tubos de 10 mL totalizando 20 tubos e armazenar a -20 ° C por até 6 meses. Coloque em 4 &graus; C durante a noite antes de usar.
Ativina ASistemas de orientação celularGFH6-100x10Reconstitua o pó liofilizado a 100 µ g/mL em PBS estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA). Alíquota 38 µ L de Activina A em tubos de microcentrífuga pré-resfriados e armazenar a -80 ° C (Os tubos expiram 12 meses a partir da data de recebimento).
Activin Dia 1 médio (RPMI 1640)CorningMT10041CVUse aminoácidos não essenciais (NEAA, Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 1: 500 mL de RPMI 1640 e 500 mL de NEAA. Ao preparar o meio Activin Day 1, adicione 13 mL de meio básico dia 1, 13 µ l de Activina A (100 µ g/mL) e 2 µ l de BMP4 (100 µ g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Activin Dia 2 médio (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)HycloneSH30070.03TUse aminoácidos não essenciais (Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 2: 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA e 1 mL de soro a 0,2%. Ao preparar o meio Activin Day 2, adicione 12,5 mL de meio básico dia 2 e 12,5 µ L de Activin A (100 µ g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Activin Dia 3 médio (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)HycloneSH30070.03TUse aminoácidos não essenciais (Corning 11140050) e armazene a 4 ° C. Meio básico do dia 3: 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA e 10 mL de soro a 2%. Ao preparar o meio Activin Day 3, adicione 12,5 mL de dia básico 3 e 12,5 µ L de Activin A (100 µ g/mL). O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Alexa Fluor 488 Burro anti-cabraThermo CientíficoRolamento A11055Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Alexa Fluor 488 Burro anti-CoelhoThermo CientíficoA21206Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Alexa Fluor 546 Burro anti-ratoThermo CientíficoResposta A10036Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Alexa Fluor 647 Burro anti-ratoThermo CientíficoResposta 31571Diluição de 1:500 (anticorpo secundário)
Molde de basePescador22-363-552N/A
Meio intestinal básico (DMEM avançado)Gibco12491015  Ao preparar o meio intestinal básico, adicione 500 mL de DMEM, 500 mL de N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL de B27 (Gibco), 500 mL de L-Glutamina para obter 2 mM de L-Glutamina (Corning A2916801), 5 mL de 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina (Gibco 15-140-122) e 7,5 mL de  HEPES de 1 M para obter HEPES de 15 mM.  O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Sistema de detecção de PCR em tempo real Biorad CFX96 TouchBioradN/AOutros sistemas qRT-PCR podem ser usados.
Solução de recuperação celularCorning354253Solução degradante de ECM
CHIR99021Reprocell4000410Reconstitua adicionando 2,15 mL de DMSO a 10 mM. Prepare 50 µ L alíquotas e armazenar a -20 °C.  Armazene o pó a 4 & graus; C, protegido da luz.
Meio de padronização CTRL HION/AN/AMeio intestinal básico e 100 ng/mL EGF.
DAPISigma-AldrichD9542Diluição 1:100 (anticorpo secundário)
Monocamada DEN/AN/AA monocamada foi gerada em etapas anteriores (Seção 4.4).
ExibirGibco17105041Ressuspenda o pó liofilizado em Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) até uma concentração final de 1 mg / mL. Filtre a solução para esterilização aspirando usando um tubo de esterilização com filtro Millipore. Faça alíquotas de 10 mL (1 mg / mL) e armazene a -20 graus; C por até 6 meses. Coloque em 4 &graus; C durante a noite antes de usar.
FEGThermo Científico236-EG-01MAo preparar 100 ng/mL EGF reconstituir 500 µ g/mL em PBS estéril. Em seguida, adicione 2 mL de PBS estéril a 1 mg de EGF e faça 500 µ g/mL de solução EGF. Alíquota 100 µ L de EGF em 20 tubos.
Placas de Petri Fisherbrand 6 cm com tampa transparentePescadorFB0875713AN/A
Levantador de células FisherbrandPescador08-100-240N/A
Frascos de vidro transparente Fisherbrand Classe B com fechos anexadosPescador03-338BN/A
Pipeta de Pasteur de Vidro Borossilicato Descartável FisherbrandPescador13-678-2D0N/A
Fluoromount G Meio de Montagem DeslizanteVWR100241-874N/A
Gibco avançado DMEMGibco12-491-023N/A
Cabra anti-E-CaderinaR& DAF648Diluição 1:400 (anticorpo primário)
Cabra anti-SOX17R& DAF1924Diluição de 1:500 (anticorpo primário)
HCOs padronizando o meioN/AN/AMeio intestinal básico, 100 ng/mL EGF e 100 ng/mL BMP2. Ao preparar o BMP2, adicione 1 mL de HCl 4 mM estéril 0,1% BSA aos frascos para injetáveis de BMP2 (100 µ g). Alíquota 25 µ L de solução BMP4 em 4 tubos. O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
HemocitômetroSigma-AldrichZ359629N/A
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)Instalação de células-tronco pluripotentesN/ACélulas semeadas em uma placa de 24 poços revestida com Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Solução gelada de paraformaldeído a 4% (PFA)N/AN/AN/A
Solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS)N/AN/AO pH deve ser 7,4.
Caneta de barreira hidrofóbica ImmEdgeLaboratórios de vetores101098-065N/A
Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)Instalação de células-tronco pluripotentes (Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati)N/AOutras linhas hESC ou iPSC podem ser usadas, mas o protocolo precisa ser otimizado para cada linha celular.
Micrótomo LeicaN/AN/AN/A
LSM 880microscópio confocal
Matriz de Membrana Embasal MatrigelCorning354234N/A
Matriz qualificada por Matrigel hESCCorning354277Prepare 4 alíquotas de Matrigel que correspondem a volumes suficientes para fazer Matrigel diluído suficiente para pratos de 4 x 6 poços.
Meio de indução do intestino médio (RPMI 1640)CorningMT10041CVAminoácidos não essenciais (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µ M CHIR99021 e 500 ng/mL FGF4. O meio base é estável por até 3 semanas, mas deve ser usado imediatamente após a adição de fatores de crescimento.
Esferoides do intestino grossoN/AN/AN/A
Unidades de filtro a vácuo descartáveis estéreis MilliporeSigma SteriflipMilliporeSigmaSCGP00525N/A
Mouse anti-CDX2BioGenexMU392-UCDiluição de 1:300 (anticorpo primário)
Rato anti-FOXA2Abnova/NovusH00003170-M01Diluição 1:500
mTeSR1 meio de crescimento completoTecnologias de células-tronco85870Adicione 100 mL de suplemento de mTeSR (85870) em um meio de 400 mL de mTeSR (85870) e alíquota em tubos de 50 mL, evitando contaminação. Armazene a 4° C até o uso.
Solução clara de Murray (também conhecida como BABB)MurrayN/Abenzoato de benzilo 1:2 e álcool benzílico.
Meio de padronização NOG HION/AN/AMeio intestinal básico, 100 ng/mL EGF e 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µ g de NOGGIN em 250 µ l PBS estéril com 0,1% BSA).
NucleoSpin RNATakara740955.25Outros kits de isolamento de RNA podem ser usados.
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 24 poços (Nunc)Thermo Científico73521-004N/A
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 24 poços revestida com MatrigelThermo Científico73521-004N/A
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 6 poços (Nunc)Thermo Científico73520-906N/A
Placa de cultura de tecidos de superfície delta Nunclon 6-poços revestidos com  Matrigel.Thermo Científico73520-906N/A
Meio de crescimento para HIOs, CTRL HIOs e HCOsN/AN/AMeio intestinal básico e 100 ng/mL EGF (concentração final)
Tampão fosfato salino, 0,5% Triton X (PBS-T)N/AN/AN/A
PrimersTecnologias de DNA integradas, Inc. (IDT)N/AOs primers estão listados na Tabela 2 do protocolo.
Coelho anti-CDX2Marca de célulaEPR22764YDiluição 1:100 (anticorpo primário)
Coelho anti-SATB2Marca de célulaEP281Diluição 1:100 (anticorpo primário)
Proteína BMP-4 humana recombinanteR& D314-BP-010Reconstitua o pó liofilizado a 100 µ g/mL em HCl 4 mM estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA). Adicione 4,17 mL de solução de HCl a 45,83 mL de água molecular, totalizando 50 mL de 1 M de HCl. Em seguida, adicione 200 µ L de 1 M HCl a 49,8 mL de água de grau molecular, totalizando 50 mL de 4 mM HCl. Em seguida, adicione 0,05 g de BSA a 50 mL de HCl 4 mM e filtre para tornar estéril. Alíquota estéril 4 mM HCl 0,1% BSA para 33 tubos de microcentrífuga totalizando e armazenando a -20 ° C. Adicionar 100 ° C; l de HCl 4 mM estéril 0,1% BSA para os frascos BMP4 (10 µ g) fazer solução BMP4 a 100 µ g/mL.
Proteína FGF-4 humana recombinanteR& D235-F4-01MReconstituir a 100 µ g/mL em PBS estéril contendo 0,1% de albumina sérica bovina. Adicione 0,05 g de BSA em 50 mL de PBS para obter 0,1% de BSA. Filtro 0.22 µ M BSA para esterilizar o BSA. Alíquota 10 mL de BSA 0,1% em 5 tubos. Adicione 1 mg de FGF-4 em 10 mL de BSA estéril a 0,1%. Alíquota 250 µ L em tubos de microcentrífuga pré-resfriados 40 e armazene a -80 ° C.
Inibidor de ROCK Y-27632Tocris1254A concentração final é de 10 mM (10 mmol/L). Ressuspender em DMSO a 10 mM e esterilizar com filtro. Adicione 3 mL de PBS estéril a cada frasco. Aliqout 100 µ L de inibidor de ROCK em 30 tubos e armazenar a -20 °C.
Kit de síntese de cDNA SuperScript VILOThermo Científico11-754-250N/A
Lâminas de microscópio SuperFrost Plus
Composto Tissue Tek OCTVWR25608-930N/A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

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