Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar o extrato nuclear ativo do estágio 4 C. elegans larval e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro .
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Artigo de método
Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Caenorhabditis elegans tem sido um importante sistema modelo de pesquisa biológica desde que foi introduzido em 1963. No entanto, C. elegans não foi totalmente utilizado no estudo bioquímico de reações biológicas usando seus extratos nucleares, como transcrição in vitro e replicação de DNA. Um obstáculo significativo para o uso de C. elegans em estudos bioquímicos é interromper a grossa cutícula externa do nematoide sem sacrificar a atividade do extrato nuclear. Embora vários métodos sejam usados para quebrar a cutícula, como homogeneização de Dounce ou sonicação, eles muitas vezes levam à instabilidade proteica. Não há protocolos estabelecidos para isolar proteínas nucleares ativas de larvas ou adultos C. elegans para reações in vitro . Aqui, o protocolo descreve detalhadamente a homogeneização do estágio larval 4 C. elegans utilizando um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch usa pressão para forçar lentamente os animais através de uma estreita abertura quebrando a cutícula no processo. O design uniforme e a usinagem precisa do homogeneizador Balch permitem uma moagem consistente de animais entre experimentos. Fracionar o homogeneizador obtido a partir do homogeneizador Balch produz extrato nuclear funcionalmente ativo que pode ser usado em um método in vitro para avaliar a atividade de transcrição de C. elegans.
Introdução
O pequeno nematode caenorhabditis elegans é um organismo modelo simples, mas poderoso, para abordar uma ampla gama de questões biológicas. Desde sua introdução em 1963, os nematoides têm sido inestimáveis para responder perguntas em neurobiologia, metabolismo, envelhecimento, desenvolvimento, imunidade e genética1. Algumas das muitas características do animal que o tornam um organismo modelo ideal incluem o curto tempo de geração, a eficácia da interferência do RNA, o corpo transparente e os mapas completos de sua linhagem celular e sistema nervoso.
Embora as contribuições do nematode para a ciência sejam va....
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Protocolo
1. Preparações de mídia
- Prepare placas de ágar estéril (LB) e mídia líquida seguindo as instruções do fabricante.
- Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 em uma placa de ágar LB. Incubar a raia das bactérias a 37 °C durante a noite.
- Armazene a placa de raia E. coli OP50 a 4 °C após a incubação. A placa E. coli OP50 pode ser armazenada com segurança a 4 °C por 2 semanas se embrulhada em parafilme para evitar a perda de umidade.
- Prepare 2 L de Nematode Growth Media (NGM) utilizando a receita na Tabela 1.
NOTA: Nystatin é opcional. A nystatina ajuda a evitar que o mofo e o....
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Resultados
Seguindo as etapas descritas deve produzir extrato nuclear funcional (Figura 1), o desvio nas etapas de moagem ou lavagem pode levar a má atividade ou baixos rendimentos. Se o extrato nuclear C. elegans funcional for obtido, ele transcreverá a região a jusante do promotor do CMV no modelo de DNA quando adicionado ao ensaio in vitro descrito anteriormente. A transcrição resultante do RNA pode ser purificada a partir das proteínas nucleares e.......
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Discussão
C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar o sistema de transcrição eucariótica devido à sua manutenção de baixo custo e à facilidade de manipulação genética. Aqui é descrito um protocolo para o isolamento consistente do extrato nuclear funcionalmente ativo de L4 C. elegans . Embora este protocolo tenha se concentrado em visualizar a atividade de transcrição, o cDNA produzido após a transcrição pode ser quantificado usando o RT-qPCR para obter uma medição mais precisa da atividade de
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Divulgações
Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH MIRA (R35GM124678 a J. S.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Consumíveis e reagentes | |||
| 0,2 mL Tubos de 8 tiras e Tampas de Tira Plana, Transparente | Genesee Scientific | 24-706 | |
| Tubos de PCR individuais de 0,2 mL | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL microtubos estéreis | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% etanol de grau molecular absoluto | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% etanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| pipeta sorológica de 10 mL | VWR internacional | 89130-898 | |
| Placas de Petri de 150 mm | Tritech Research | T3325 | |
| Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Seringas plásticas de 20 mL | Seringas Fisher Scientific | 14955460 | |
| Norm-Ject de 2 mL | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| Copo de filtro de vácuo de 500 mL 0,22 µ m PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| tubos de centrífuga cônicos de 50 mL | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| pipeta sorológica de 50 mL | VWR international | 89130-902 | |
| pipeta serológica de 5 mL | VWR internacional | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Marcador à prova de álcool | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Dicloreto de cálcio | Millipore Sigma | C4901 | |
| Colesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Controle DNA templos clonagem primers, para a frente 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3' | |||
| Controle de primers de clonagem de templos de DNA, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3' | |||
| Água | |||
| Ditiotreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Mancha de DNA gel, seguro para SYBR | Invitrogen | S33102 | |
| Mistura de escada de DNA, O' régua genética | Fisher Scientific | SM1173 | |
| Corante de Carregamento de DNA, 6x TriTrack | Fisher Scientific | ||
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | ||
| Gelo | |||
| Escherichia coli OP50 cepa | CGC | OP50 | |
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A38 | |
| Glicerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa extrato nuclear in vitro sistema de transcrição, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Solução Hepes, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Ácido clorídrico 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Alvejante de hipoclorito | Clorox | ||
| LB Caldo | Millipore Sigma | L3022 | |
| Dicloreto de magnésio | Millipore Sigma | M8266 | |
| Sulfato de Magnésio | Millipore Sigma | M7506 | |
| Pratos de pesagem média | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| lâminas de microscópio, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| água de grau molecular, Hypure | Hyclone Laboratories | ||
| Nistatina | Millipore Sigma | Sistema de PCR N1638 | |
| , FailSafe com pré-mistura A | Lucigen | ||
| Cloreto de potássio | Millipore Sigma | P39111 | |
| Fosfato de potássio dibásico | Millipore Sigma | P3786 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Millipore Sigma | P0662 | |
| Inibidor de protease, Halt coquetel de uso único 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| kit de ensaio de proteína, Qubit | ThermoFisher Scientific | Kit de transcrição reversa Q33211 | |
| , Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| kit de extração de RNA RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase | Inhibitor Applied Biosystems | ||
| Cloreto de Sódio | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Hidróxido de Sódio | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Filtro de seringa estéril com 0.2 µ m Membrana de polietersulfona | VWR international | 28145-501 | |
| Sacarose | VWR International | 200-334-9 | |
| primers de transcrição, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3' | |||
| primers de transcrição, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3' | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 ° C incubadora | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 ° C incubadora | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 ° C incubadora | Forma Scientific | ||
| 4 ° Geladeira C | ThermoFisher Scientific-80 | ||
| ° C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogeneizador, homogeneizador de células isobiotec | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | Microscópio de dissecção 82013-800 | |
| , Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorômetro, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Sistema de imagem em gel, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Sistema de gel | ThermoFisher Scientific | ||
| Bloco de calor | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrífugas, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipeta L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipeta L-10 XLS+, pipeta Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| L-200 XLS+, pipeta Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| plataforma de balanço | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006). ....
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Reimpressões e permissões
