Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar o extrato nuclear ativo do estágio 4 C. elegans larval e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans tem sido um importante sistema modelo de pesquisa biológica desde que foi introduzido em 1963. No entanto, C. elegans não foi totalmente utilizado no estudo bioquímico de reações biológicas usando seus extratos nucleares, como transcrição in vitro e replicação de DNA. Um obstáculo significativo para o uso de C. elegans em estudos bioquímicos é interromper a grossa cutícula externa do nematoide sem sacrificar a atividade do extrato nuclear. Embora vários métodos sejam usados para quebrar a cutícula, como homogeneização de Dounce ou sonicação, eles muitas vezes levam à instabilidade proteica. Não há protocolos estabelecidos para isolar proteínas nucleares ativas de larvas ou adultos C. elegans para reações in vitro . Aqui, o protocolo descreve detalhadamente a homogeneização do estágio larval 4 C. elegans utilizando um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch usa pressão para forçar lentamente os animais através de uma estreita abertura quebrando a cutícula no processo. O design uniforme e a usinagem precisa do homogeneizador Balch permitem uma moagem consistente de animais entre experimentos. Fracionar o homogeneizador obtido a partir do homogeneizador Balch produz extrato nuclear funcionalmente ativo que pode ser usado em um método in vitro para avaliar a atividade de transcrição de C. elegans.

Introduction

O pequeno nematode caenorhabditis elegans é um organismo modelo simples, mas poderoso, para abordar uma ampla gama de questões biológicas. Desde sua introdução em 1963, os nematoides têm sido inestimáveis para responder perguntas em neurobiologia, metabolismo, envelhecimento, desenvolvimento, imunidade e ^genética1. Algumas das muitas características do animal que o tornam um organismo modelo ideal incluem o curto tempo de geração, a eficácia da interferência do RNA, o corpo transparente e os mapas completos de sua linhagem celular e sistema nervoso.

Embora as contribuições do nematode para a ciência sejam va....

Protocol

1. Preparações de mídia

1. Prepare placas de ágar estéril (LB) e mídia líquida seguindo as instruções do fabricante.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 em uma placa de ágar LB. Incubar a raia das bactérias a 37 °C durante a noite.
3. Armazene a placa de raia E. coli OP50 a 4 °C após a incubação. A placa E. coli OP50 pode ser armazenada com segurança a 4 °C por 2 semanas se embrulhada em parafilme para evitar a perda de umidade.
4. Prepare 2 L de Nematode Growth Media (NGM) utilizando a receita na Tabela 1.
   NOTA: Nystatin é opcional. A nystatina ajuda a evitar que o mofo e o....

Results

Seguindo as etapas descritas deve produzir extrato nuclear funcional (Figura 1), o desvio nas etapas de moagem ou lavagem pode levar a má atividade ou baixos rendimentos. Se o extrato nuclear C. elegans funcional for obtido, ele transcreverá a região a jusante do promotor do CMV no modelo de DNA quando adicionado ao ensaio in vitro descrito anteriormente. A transcrição resultante do RNA pode ser purificada a partir das proteínas nucleares e.......

Discussion

C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar o sistema de transcrição eucariótica devido à sua manutenção de baixo custo e à facilidade de manipulação genética. Aqui é descrito um protocolo para o isolamento consistente do extrato nuclear funcionalmente ativo de L4 C. elegans . Embora este protocolo tenha se concentrado em visualizar a atividade de transcrição, o cDNA produzido após a transcrição pode ser quantificado usando o RT-qPCR para obter uma medição mais precisa da atividade de

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumíveis e reagentes
0,2 mL Tubos de 8 tiras e Tampas de Tira Plana, Transparente	Genesee Scientific	24-706
Tubos de PCR individuais de 0,2 mL	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL microtubos estéreis	Genesee Scientific	24-282S
100% etanol de grau molecular absoluto	Fisher Scientific	BP2818
100% etanol, Koptec	Decon Labs	V1001
pipeta sorológica de 10 mL	VWR internacional	89130-898
Placas de Petri de 150 mm	Tritech Research	T3325
Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL	Genesee Scientific	28-103
Seringas plásticas de 20 mL	Seringas Fisher Scientific	14955460
Norm-Ject de 2 mL	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
Copo de filtro de vácuo de 500 mL 0,22 µ m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
tubos de centrífuga cônicos de 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
pipeta sorológica de 50 mL	VWR international	89130-902
pipeta serológica de 5 mL	VWR internacional	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Marcador à prova de álcool	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Dicloreto de cálcio	Millipore Sigma	C4901
Colesterol	Millipore Sigma	C8667
Controle DNA templos clonagem primers, para a frente 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Controle de primers de clonagem de templos de DNA, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Água
Ditiotreitol	Invitrogen	15508-013
Mancha de DNA gel, seguro para SYBR	Invitrogen	S33102
Mistura de escada de DNA, O' régua genética	Fisher Scientific	SM1173
Corante de Carregamento de DNA, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen
Gelo
Escherichia coli OP50 cepa	CGC	OP50
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A38
Glicerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa extrato nuclear in vitro sistema de transcrição, HeLaScribe	Promega	E3110
Solução Hepes, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Ácido clorídrico 37%	Millipore Sigma	P0662
Alvejante de hipoclorito	Clorox
LB Caldo	Millipore Sigma	L3022
Dicloreto de magnésio	Millipore Sigma	M8266
Sulfato de Magnésio	Millipore Sigma	M7506
Pratos de pesagem média	Fisher Scientific	02-202-101
lâminas de microscópio, Vista vision	VWR International	16004-368
água de grau molecular, Hypure	Hyclone Laboratories
Nistatina	Millipore Sigma	Sistema de PCR N1638
, FailSafe com pré-mistura A	Lucigen
Cloreto de potássio	Millipore Sigma	P39111
Fosfato de potássio dibásico	Millipore Sigma	P3786
Fosfato de potássio monobásico	Millipore Sigma	P0662
Inibidor de protease, Halt coquetel de uso único 100x	ThermoFisher Scientific	78430
kit de ensaio de proteína, Qubit	ThermoFisher Scientific	Kit de transcrição reversa Q33211
, Sensiscript	Qiagen	205211
kit de extração de RNA RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase	Inhibitor Applied Biosystems
Cloreto de Sódio	VWR International	BDH9286-12KG
Hidróxido de Sódio	Millipore Sigma	1-09137
Filtro de seringa estéril com 0.2 µ m Membrana de polietersulfona	VWR international	28145-501
Sacarose	VWR International	200-334-9
primers de transcrição, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
primers de transcrição, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 ° C incubadora	ThermoFisher Scientific
20 ° C incubadora	ThermoFisher Scientific
37 ° C incubadora	Forma Scientific
4 ° Geladeira C	ThermoFisher Scientific-80
° C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogeneizador, homogeneizador de células isobiotec	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	Microscópio de dissecção 82013-800
, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorômetro, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Sistema de imagem em gel, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Sistema de gel	ThermoFisher Scientific
Bloco de calor	VWR International	12621-048
Microcentrífugas, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipeta L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipeta L-10 XLS+, pipeta Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
L-200 XLS+, pipeta Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
plataforma de balanço	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010