Ressonância magnética quantitativa da permeabilidade endotelial e (dis)função na aterosclerose

Summary

Desenvolvemos um método preciso, não invasivo e fácil de usar para quantificar a permeabilidade e disfunção endotelial nas artérias usando ressonância magnética (MRI), denominado qMETRIC. Essa técnica permite avaliar o dano vascular e o risco cardiovascular associados à aterosclerose em modelos pré-clínicos e humanos.

Abstract

As doenças cardiovasculares são as principais causas de morte em todo o mundo. Um endotélio permeável/permeável e disfuncional é considerado o marcador mais precoce de dano vascular e acredita-se que conduza à aterosclerose. Um método para identificar essas alterações in vivo seria desejável na clínica. As ferramentas baseadas em ressonância magnética (RM) e outras tecnologias permitiram uma compreensão profunda do papel do endotélio nas doenças cardiovasculares e no risco in vivo. Há, no entanto, a necessidade de abordagens simples e reprodutíveis para extrair dados quantificáveis que reflitam o dano endotelial de um único estudo de imagem. Um fluxo de trabalho de ressonância magnética não invasivo, fácil de implementar e quantitativo foi desenvolvido para adquirir e analisar imagens que permitem a quantificação de dois biomarcadores de imagem de dano endotelial arterial (vazamento/permeabilidade e disfunção). Aqui, o protocolo descreve a aplicação deste método na artéria braquiocefálica de camundongos ApoE^-/- ateroscleróticos usando um scanner de ressonância magnética clínica. Primeiro, são descritos os protocolos de mapeamento T1 de realce tardio com gadolínio (LGE) e Modified Look-Locker Inversion Recovery (MOLLI) para quantificar o vazamento endotelial usando uma sonda de ligação à albumina. Em segundo lugar, são descritas sequências anatômicas e quantitativas de fluxo sanguíneo para medir a disfunção endotelial, em resposta à acetilcolina. É importante ressaltar que o método descrito aqui permite a aquisição de imagens 3D de alta resolução espacial com grande cobertura volumétrica, permitindo a segmentação precisa das estruturas da parede do vaso para melhorar a variabilidade inter e intraobservador e aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade. Além disso, fornece dados quantitativos sem a necessidade de alta resolução temporal para modelagem cinética complexa, tornando-o independente do modelo e até mesmo permitindo imagens de vasos altamente móveis (artérias coronárias). Portanto, a abordagem simplifica e agiliza a análise de dados. Finalmente, esse método pode ser implementado em diferentes scanners, pode ser estendido para obter imagens de diferentes leitos arteriais e é clinicamente aplicável para uso em humanos. Este método pode ser usado para diagnosticar e tratar pacientes com aterosclerose, adotando uma abordagem de medicina de precisão.

Introduction

As doenças cardiovasculares (DCV) continuam sendo a principal causa de mortalidade e morbidade em todo o mundo, sendo responsáveis por quase um terço das mortes¹, e a causa de incapacidades ao longo da vida que exercem um alto custo financeiro para os sistemas de saúde¹. Entre as DCVs, a doença cardíaca isquêmica e o acidente vascular cerebral são causados principalmente por placas ateroscleróticas. A aterosclerose é uma doença multifatorial; no entanto, uma característica comum é o dano precoce das células endoteliais vasculares que levam à formação, progressão e eventuais complicações da aterosclerose. Um endotélio vascular íntegro tem propriedades vasculoprotetoras fundamentais². O endotélio regula a permeabilidade vascular controlando a translocação de células e moléculas entre a circulação sistêmica e a parede do vaso; controla o tônus vascular equilibrando a produção de vasodilatadores (por exemplo, óxido nítrico, prostaciclina) e vasoconstritores (por exemplo, endotelina-1, angiotensina II); e também tem propriedades anticoagulantes. No entanto, tanto a função quanto a permeabilidade das células endoteliais podem se deteriorar na presença de fatores de risco cardiovascular (por exemplo, tabagismo, colesterol alto, diabetes, inflamação sistêmica, estresse oxidativo) e por padrões hemodinâmicos do fluxo sanguíneo. Um endotélio disfuncional reduziu a vasodilatação em resposta a estressores, consequentemente aumentando a rigidez arterial. Além disso, um endotélio permeável / com vazamento alargou as junções comunicantes apertadas entre as células adjacentes 3,4,5,6,7. Essa alteração ocorre tanto no endotélio luminal quanto nos microvasos de placas recém-formados, que parecem frágeis, permeáveis e dismórficos⁸. As células endoteliais permeáveis atuam como pontos de entrada para moléculas e células transmitidas pelo plasma, exacerbando o risco de doenças cardiovasculares.

Com base nesse conhecimento, nos últimos 15 anos, a permeabilidade e a função endotelial surgiram como um alvo terapêutico e de imagem promissor para melhor diagnosticar indivíduos com risco de doença cardiovascular e avaliar os efeitos de medicamentos conhecidos ou novos. No entanto, a imagem direta e quantitativa da função do endotélio é limitada 9,10,11,12. Atualmente, grande parte da interpretação da função endotelial in vivo é baseada em estudos de dilatação endotelial-dependente (DFM) em vasos periféricos cuja função se correlaciona modestamente com a carga de aterosclerose em leitos vasculares que causam eventos clínicos 13,14,15. Apenas um número limitado de estudos de imagem mostrou uma ligação direta entre disfunção endotelial e carga de aterosclerose in vivo 9,10,11,12. Por outro lado, abordagens baseadas em ressonância magnética mais acessíveis permitiram a permeabilidade endotelial por imagem de forma mais ampla. O uso do aumento percentual do sinal da parede do vaso após a administração de agentes de gadolínio na RM forneceu uma medida semiquantitativa da permeabilidade endotelial^16,17. Posteriormente, o desenvolvimento de protocolos dinâmicos com contraste (DCE) permitiu uma medição aprimorada e mais quantitativa da permeabilidade endotelial vascular. Parâmetros quantitativos como a taxa de extravasamento de contraste (K^trans) e o volume microvascular (Vρ) derivados da modelagem cinética ou da área sob a curva (AUC), inclinação ascendente, tempo até o pico e concentração de pico extraídos de métodos não modelados correlacionaram-se não apenas com a permeabilidade endotelial, mas também com a vascularização da placa 18,19,20. No entanto, a aplicação do DCE vascular permanece desafiadora, apesar dos avanços técnicos significativos, porque: (i) requer alta resolução espacial (0,5-0,7 mm²) e temporal²¹ para delineamento preciso da parede do vaso. A amostragem da concentração de agente de contraste no sangue para calcular a função de entrada arterial também requer modelagem cinética, o que leva a uma troca de limitar a cobertura anatômica^22,23 para obter resolução temporal ou vice-versa^24,25; (ii) a análise de dados pode exigir modelagem farmacocinética complexa (por exemplo, Patlak vs. Tofts); (iii) fornece qualidade de imagem limitada, baixa reprodutibilidade de varredura e revarredura e variabilidade média interobservador e intraobservador^26,27. Portanto, ainda há necessidade de abordagens reprodutíveis e simples para extrair dados diretos e quantificáveis de permeabilidade endotelial e (dis)função de estudos de imagem única que possam ter melhor utilidade clínica.

Aqui, desenvolvemos uma ressonância magnética não invasiva, fácil de implementar e quantitativa para adquirir e analisar imagens que permite a quantificação direta de dois marcadores de dano endotelial arterial (vazamento/permeabilidade e disfunção) usando modelos pré-clínicos de aterosclerose em um único exame. O método é denominado Quantitative MRI de EndoThelial peRmeabIlidade edisdiversão (qMETRIC). Envolve a aquisição de protocolos de mapeamento T1 de realce tardio com gadolínio (LGE) e Modified Look-Locker Inversion Recovery (MOLLI) para quantificar o vazamento endotelial, após a administração de uma sonda intravascular de ligação à albumina; e aquisição de sequências anatômicas e quantitativas de fluxo sanguíneo para medir a disfunção endotelial, em resposta a um bolus de acetilcolina. Demonstramos que o qMETRIC detecta com precisão: a gravidade da aterosclerose e o risco de complicações; respostas ao tratamento; e pode ser adaptado para uso em pacientes ^5,6,7. É importante ressaltar que o método descrito aqui permite a aquisição de imagens de alta resolução espacial para permitir a segmentação precisa da parede do vaso para minimizar o viés inter/intraobservador e aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade com grande cobertura anatômica. Finalmente, esse método pode ser adaptado para uso em diferentes scanners e pode ser estendido para imagens de diferentes leitos arteriais (até mesmo artérias coronárias²⁸). O fluxo de trabalho simples torna essa abordagem mais acessível à comunidade de imagens cardiovasculares.

Protocol

Todos os componentes deste estudo foram realizados de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido, de 1986, e com a aprovação do Painel de Revisão Ética do King's College London.

O fluxo de trabalho experimental está resumido na Figura 1.

1. Preparação animal

1. Induza a aterosclerose alimentando camundongos ApoE^-/- com uma dieta rica em gordura contendo 21% de gordura da banha e 0,15% (peso / peso) de colesterol em média por até 12 semanas.
2. Carregue uma seringa de insulina de agulha de 29 G com o volume certo do agente de contraste (gadofosveset trisordium) para atingir uma dose de 0,03 mmol / kg. Mantenha o volume de injeção entre 50-150 μL.
3. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C para pré-aquecer o animal e manter a temperatura corporal.
4. Induza a anestesia colocando o camundongo em uma caixa de indução forrada com tecidos absorventes. Ajuste o medidor de vazão para 3%-5% de isoflurano a 1 L/min de O₂ por cerca de 3-5 min.
   NOTA: Garanta a profundidade correta da anestesia identificando a frequência respiratória lenta, que deve diminuir para menos de 70 respirações por minuto (bpm).
5. Confirme a anestesia usando o método de pinça do dedo do pé (ou seja, perda do reflexo de retirada para pinçar o dedo do pé). Transfira o animal para um suporte e insira o nariz em um cone do nariz. Coloque o suporte em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal dos animais.
6. Mantenha a anestesia, administrada pelo nariz, ajustando o fluxo de ar da anestesia no suporte para 1%-2% de isoflurano a 1 L/min de O₂.
7. Aplique pomada veterinária nos olhos do animal para evitar o ressecamento durante a anestesia.
8. Coloque o animal de bruços ou de lado e limpe a cauda com um cotonete embebido em álcool. Localize uma das duas veias da cauda. Se necessário, aqueça a cauda com uma lâmpada UV para tornar as veias da cauda mais visíveis.
9. Insira a agulha de insulina 29 G paralela à veia com o bisel da agulha voltado para cima. Injete suavemente o volume da seringa pré-cheia contendo gadofosveset trissódico. Certifique-se de que não há sangramento no local da injeção após retirar a agulha.
10. Aguarde 30 segundos para que o gadofosveset circule e, em seguida, transfira o mouse para o leito de ressonância magnética.

2. Preparação do scanner de ressonância magnética (ver Figura 1)

1. Cubra a mesa de ressonância magnética com lenços absorventes.
2. Coloque a bobina receptora de loop único de ressonância magnética no leito de ressonância magnética. Use uma plataforma para levantar a bobina receptora e evitar o contato direto entre a bobina receptora e a mesa de ressonância magnética.
3. Prenda a bobina à plataforma usando fita cirúrgica.
4. Coloque e prenda o tubo conectado a uma bomba de aquecimento circulante ao redor da bobina e ajuste-o para 37 ° C para manter a temperatura corporal do animal durante a imagem.
5. Coloque o tubo de administração de anestesia no orifício do scanner de ressonância magnética e prenda-o com fita adesiva de forma que o cone do nariz atinja a ponta da bobina receptora onde a cabeça do animal será colocada.
6. Ligue a câmera interna para monitorar o animal da sala do console.
7. Na sala do console de ressonância magnética, use a interface do software para iniciar um novo estudo para o animal (paciente).

3. Posicionamento do animal no scanner de ressonância magnética e monitoramento (ver Figura 2)

1. Transfira o animal anestesiado para a sala do scanner. Coloque o mouse na posição de bruços na bobina do receptor e certifique-se de que seu focinho se encaixe no cone do nariz para manter a anestesia. Gire o fluxo de ar da anestesia para 1%-1,5% de isoflurano a 1 L/min de O₂.
2. Certifique-se de colocar o animal na bobina de ressonância magnética com as regiões do coração e pescoço localizadas no centro da bobina receptora.
3. Prenda o nariz do rato no cone do nariz, no abdômen e na cauda do rato na plataforma com fita adesiva.
4. Coloque quatro eletrodos nas patas anterior e traseira, certificando-se de que a palma dos dedos esteja completamente aberta para registrar o eletrocardiograma (ECG). Use gel condutor de ECG nas patas do mouse antes de conectar as almofadas de ECG para melhorar a condutividade.
5. Certifique-se de usar fita adesiva para prender firmemente os eletrodos à plataforma.
6. Alinhe o laser da cama do scanner com a base (extremidade proximal) do coração; Use a clavícula e a linha anterior da pata como ponto de referência. Posicione o animal no isocentro do ímã usando uma mesa automática de RM.

4. Planejamento e aquisição de imagens de ressonância magnética

1. Inicie uma varredura de reconhecimento para executar as calibrações padrão para o sistema de ressonância magnética.
2. Defina o equipamento de monitoramento para detectar a onda R do ECG. Ajuste os limites para cada mouse e dentro das sessões de imagem para que haja um acionamento confiável.
   NOTA: A frequência cardíaca do camundongo sob anestesia profunda geralmente varia entre 400-600 batimentos por minuto (bpm).
3. Adquira uma varredura de eco gradiente 3D (GRE) para obter imagens piloto multiplanares (imagens de reconhecimento) para planejar o restante das varreduras (consulte a Tabela 1 para os parâmetros de aquisição de ressonância magnética e a Figura 3 para planejamento).
4. Identifique o coração nas imagens de escoteiro, particularmente na visão coronal, mais facilmente por seus artefatos de fluxo.
   NOTA: Se as imagens mostrarem que o mouse não está bem centralizado sobre a bobina ou o isocentro, retraia a cama e repita o posicionamento.
5. Planeje uma angiografia por RM (ARM) com contraste 3D (consulte a Tabela 1 para verificar os parâmetros de aquisição de ressonância magnética e a Figura 3 para planejamento) em um plano transversal que se estende da base do coração em direção ao pescoço e às artérias carótidas com um campo de visão (FOV) de 8 mm.
6. Use as imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) para visualizar o arco aórtico, as artérias braquiocefálicas e carótidas e planeje o subsequente realce tardio com gadolínio (LGE), mapeamento T1 e cine scans (consulte a Figura 3 para imagens representativas).
   NOTA: Se o nível do volume de imagem não estiver correto, repita a aquisição movendo os cortes proximal ou distalmente.
7. Aquisição de imagens de ressonância magnética para medir a permeabilidade endotelial.
   1. Use as imagens MIP e transversais de RM adquiridas anteriormente para planejar uma aquisição 2D-Look-Locker (LL) de corte único perpendicular à aorta ascendente ou artérias carótidas (consulte a Tabela 1 para varredura para os parâmetros de aquisição de ressonância magnética e a Figura 3 para imagens representativas).
   2. Defina a frequência cardíaca para 60 bpm ao usar um sinal de ECG simulado ou defina um período de supressão para garantir que o pulso de recuperação de inversão entre os pulsos de recuperação de inversão subsequentes seja de 1000 ms ao usar o sinal de ECG gravado.
   3. Use as imagens do Look-Locker para determinar o tempo de inversão (TI) ideal para a anulação do sinal sanguíneo necessária para a varredura LGE.
   4. Imagem LGE: Após 20-30 min de injeção de gadofosveset e imediatamente após a varredura LL (descrita nas etapas 4.7.1-4.7.3), adquira uma varredura LGE usando uma sequência de eco gradiente rápido 3D de recuperação de inversão (consulte a Tabela 1 para os parâmetros de aquisição de ressonância magnética e a Figura 3 para imagens representativas).
   5. Planeje uma varredura LGE de eco de gradiente rápido 3D transversal para cobrir a base do coração (para incluir parte da raiz da aorta), a artéria braquiocefálica (entre a raiz da aorta e a bifurcação subclávia) e parte das artérias carótidas com um campo de visão (FOV) de 8 mm na direção pé-cabeça usando a mesma geometria da ARM acima (consulte a Figura 3 para imagens representativas).
   6. Defina a frequência cardíaca para 60 bpm, ao usar um sinal de ECG simulado, ou defina um período de supressão para garantir que pulsos sucessivos de recuperação de inversão ocorram a cada 1000 ms para a varredura LGE ao usar o sinal de ECG gravado (como na etapa 4.7.2 acima).
      NOTA: Isso é importante para a recuperação consistente e independente da frequência cardíaca da magnetização entre sucessivos pulsos de recuperação de inversão.
   7. Insira o T1 obtido do Look-Locker na sequência LGE em Contraste > Atraso de Inversão.
   8. Imagem de mapeamento T1: Use uma aquisição de eco gradiente rápido 3D para adquirir imagens de mapeamento T1 transversal 45 min após a injeção de gadofosveset. Planeje a sequência na mesma orientação e geometria da varredura LGE acima (consulte a Tabela 1 para os parâmetros de aquisição de ressonância magnética e a Figura 3 para imagens representativas).
   9. Defina a frequência cardíaca para 120 bpm, ao usar um ECG simulado, ou defina um período de supressão para garantir que o pulso de recuperação de inversão entre os dois trens de imagem ocorra a cada 500 ms ao usar o traçado de ECG registrado.
      NOTA: A sequência de mapeamento T1 usa dois pulsos de inversão não seletivos com tempos de inversão entre 20-2000 ms, seguidos por oito leituras segmentadas para oito imagens individuais. A combinação das duas trilhas de imagem resulta em um total de dezesseis imagens por fatia com tempos de inversão variados. As imagens são reconstruídas automaticamente no scanner usando um modelo de ajuste de três parâmetros. As equações usadas para gerar os mapas paramétricos T1 são:
      
      
8. Aquisição de imagens de ressonância magnética para medir a função endotelial
   1. Prepare uma solução de acetilcolina diluída em solução salina. Carregue uma seringa de insulina agulha de 29 G com o volume certo de solução a atingir (16,6 mg/kg). Mantenha o volume de injeção entre 50-150 μL.
   2. Usando a ARM transversal e as imagens MIP correspondentes, coloque um corte transversal através da artéria braquiocefálica, entre a raiz da aorta e a bifurcação subclávia (Figura 3 para imagens representativas).
   3. Use um eco gradiente 2D transversal (GRE) com gating de ECG retrospectivo para adquirir imagens cine resolvidas temporalmente da artéria braquiocefálica (consulte a Tabela 1 para os parâmetros de aquisição de ressonância magnética Figura 3 para imagens representativas).
   4. Ajuste o número de fases cardíacas máximas à frequência cardíaca de cada animal.
      NOTA: Normalmente, 14 fases cardíacas fornecem resolução temporal suficiente.
   5. Depois de adquirir as imagens de linha de base, entre na sala do scanner de ressonância magnética. Enquanto o mouse está anestesiado no scanner, injete suavemente acetilcolina intraperitonealmente (IP). Evite mover o mouse na bobina.
   6. Aguarde de 6 a 10 minutos para que a frequência cardíaca se estabilize e repita a aquisição.
   7. No final do procedimento de imagem, retorne o mouse à sua gaiola e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento para recuperação.
      NOTA: Os camundongos são recuperados quando recuperam a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
   8. Exporte as imagens adquiridas em formato DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) e use um software de análise de imagem de plataforma aberta.

5. Segmentação de ressonância magnética e análise de dados (ver Figura 4)

1. Arraste e solte os arquivos Dicom no banco de dados de um software de plataforma aberta para carregar todas as imagens.
2. Use as imagens LGE para visualizar a captação de contraste na parede do vaso e calcular a área de realce como um marcador substituto de vazamento de células endoteliais.
3. Selecione as verificações de recuperação de MRA e inversão. Pressione Enter para carregar essas imagens lado a lado. Clique no pequeno ícone ao lado do nome da digitalização e arraste e solte as imagens MRA nas imagens LGE.
4. Selecione a opção Reamostrar para refatiar as imagens MRA usando as imagens LGE como referência para levar em conta as diferenças na espessura da fatia.
5. Clique no pequeno ícone ao lado do nome da verificação. Arraste e solte as imagens LGE nas imagens MRA (como na etapa 5.4 acima). No menu, escolha Image Fusion para sobrepor as imagens LGE e MRA.
6. Na barra de ferramentas, clique em Visualizador 2D e escolha Painel de posição 3D. Use os botões para corrigir manualmente as mudanças no plano para levar em conta possíveis pequenos deslocamentos devido à respiração do animal.
7. Use a ferramenta Polígono fechado localizada na barra de ferramentas para segmentar manualmente o segmento visualmente aprimorado da parede do recipiente. Use as imagens MRA e LGE coregistradas para orientar a segmentação.
8. Segmente todas as imagens LGE que abrangem a artéria braquiocefálica.
   NOTA: Se o aprimoramento da parede do vaso tiver uma aparência difusa ou irregular, segmente-os individualmente em cada fatia.
9. Clique no botão Plug-ins na barra de ferramentas e escolha Ferramentas de ROI e, em seguida, Exportar ROIs para exportar a área segmentada (mm²) para cada região de interesse (ROI) em uma planilha.
10. Some a área de cada fatia para calcular a área total de realce na artéria braquiocefálica na planilha.
    NOTA: A área total de realce pode ser usada como um marcador quantitativo da permeabilidade endotelial.
11. Use os mapas T1 que são gerados automaticamente no computador do scanner de ressonância magnética para calcular o valor médio de T1 da parede do vaso que reflete a quantidade de captação de gadofosveset na parede do vaso - este é outro marcador quantitativo da permeabilidade endotelial.
12. Carregue as imagens do mapa MRA e T1 e siga uma abordagem semelhante à descrita acima (etapas 5.3-5.9) para segmentar a parede do vaso e extrair os valores T1 (ms).
13. Em uma planilha, inverta os valores de T1 e multiplique por 1000 para calcular o tempo de relaxamento R1 = 1/T1 em segundos. Calcular a média de R1 para todos os cortes que cobrem a artéria braquiocefálica em cada animal.
14. Carregue as imagens de angiografia de contraste de fase e os mapas de velocidade para calcular as mudanças na área do vaso e na velocidade do fluxo sanguíneo, respectivamente, durante o ciclo cardíaco.
15. Segmente as imagens adquiridas antes e depois da injeção de acetilcolina para calcular a vasorreatividade dependente do endotélio, um marcador substituto da (dis)função endotelial.
16. Use a ferramenta semiautomatizada Grow Region disponível na guia ROI ou use a opção Closed Polygon disponível na barra de ferramentas (conforme descrito na etapa 5.7) para segmentar a área do lúmen (mm²) da artéria braquiocefálica nas imagens de angiografia.
    NOTA: A ferramenta semiautomatizada usa limite de pixels para agrupar pixels que abrangem o pool de sangue com base na intensidade do sinal.
17. Use a ferramenta Fechar polígono para segmentar os mapas codificados de velocidade do fluxo sanguíneo correspondentes para calcular a velocidade do fluxo sanguíneo (cm/s).
18. Exporte a área do lúmen (mm²) e a velocidade do fluxo sanguíneo (cm/s) em uma planilha (conforme descrito na etapa 5.9) e identifique aquelas que correspondem às fases cardíaca diastólica final (área máxima) e sistólica final (área mínima).
19. Use a planilha tabulada para calcular a vasodilatação dependente do endotélio (calcule a alteração percentual na área do lúmen diastólico final (ED) e na velocidade do fluxo sanguíneo pré e pós-injeção de acetilcolina). Use as seguintes fórmulas:
    mudança de área=
    mudança de fluxo=
20. Para cada animal, tabular os dados correspondentes derivados das imagens LGE, mapas T1 e o teste de acetilcolina em software estatístico para análise.

Results

Neste relato, a aplicação de um método Quantitative MRI é demonstrada para medir ameabIlidadee (dis)função (qMETRIC) na artéria braquiocefálica de camundongos ApoE^-/- ateroscleróticos. Este método fornece dados diretos e quantificáveis de dois marcadores de dano endotelial - permeabilidade e (dis)função, que podem ser extraídos de varreduras in vivo da parede do vaso adquiridas em uma única sessão de imagem. Primeiro, LGE são usados para medir a área de realce da parede do vaso (mm³), e mapas T1 (ou R1) são usados para quantificar a taxa de relaxamento da parede do vaso (^s-1) após a administração de gadofosveset, ambos marcadores substitutos de permeabilidade (ver Figura 5 para resultados representativos). A taxa de relaxamento R1 da parede do vaso variou de 2,42 ^s-1 ± 0,35 ^s-1 a 3,45 ^s-1 ± 0,54 ^s-1 a 3,83 ^s-1 ± 0,52 ^s-1 em 4 semanas, 8 semanas e 12 semanas de dieta rica em gordura, respectivamente. Por outro lado, camundongos do tipo selvagem (R1 = 2,15 ± 0,34 ^s-1) e tratados com estatina ^ApoE-/- (R1 = 3,0 ± 0,65 ^s-1) mostraram menos realce. Em camundongos ApoE^-/- alimentados com uma dieta rica em gordura por até 12 meses, o estudo mostra com análise histológica, corante Evans Blue e microscopia eletrônica que a permeabilidade endotelial aumenta durante a progressão da aterosclerose, o que estava de acordo com o aumento do volume da parede do vaso LGE, aumento da mudança na relaxividade R1 da parede do vaso e vasoconstrição paradoxal após injeção de acetilcolina⁵. Por outro lado, a estatina e outros tratamentos direcionados ao endotélio diminuíram a permeabilidade endotelial e o tamanho da placa, o que se refletiu em menor volume de LGE, menores valores de R1 ^5,7 e melhor vasodilatação. Mecanicamente, o gadofosveset liga-se reversivelmente à albumina sérica. Isso resulta em um aumento de 5 a 6 vezes na relaxividade T1 da sonda²⁹, tornando-a detectável por ressonância magnética com alta sensibilidade. Aqui, o estudo mostra que, ligada à albumina, a captação da sonda reflete o vazamento endotelial porque se correlaciona com a captação do corante azul de Evan - um método ex vivo padrão-ouro para quantificar o vazamento endotelial (Figura 5) - e junções comunicantes mais estreitas⁵. Em segundo lugar, um teste simples é demonstrado para medir a (dis)função endotelial, em resposta à acetilcolina. Nos vasos de controle, a acetilcolina causa relaxamento vascular dependente do endotélio, levando ao aumento da área/volume arterial e do fluxo sanguíneo. Para medir a (dis)função endotelial, foram utilizadas imagens de angiografia acionadas por ECG adquiridas antes e após a administração de acetilcolina. O estudo calcula a mudança na área diastólica final (ou volume) do lúmen do vaso antes e depois da administração de acetilcolina. Verificou-se que, ao contrário dos vasos normais que vasodilatam em resposta à acetilcolina, os vasos ateroscleróticos demonstram diminuição da função vasodilatadora dependente do endotélio que se manifesta como uma mudança reduzida na área (ou volume) do vaso ou mesmo vasoconstrição paradoxal do vaso (Figura 5). Curiosamente, o tratamento com estatinas melhorou as propriedades vasodilatadoras do endotélio¹³.

Figura 1: Fluxo de trabalho para obter imagens da permeabilidade endotelial e (dis)função em camundongos ateroscleróticos. (AB) Os camundongos são primeiro anestesiados e depois injetados com o agente de contraste de albumina. (C) Os camundongos são então transferidos para uma bobina de ressonância magnética, onde as almofadas de ECG são usadas para monitorar a atividade cardíaca. (D-E) As imagens de ressonância magnética são adquiridas para quantificar a permeabilidade endotelial e a (des)função que são posteriormente analisadas usando um software de plataforma aberta (criado com BioRender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Posicionamento do animal e monitoramento de ECG para imagem da permeabilidade endotelial e (des)função usando um scanner clínico de ressonância magnética de 3 Tesla. (AB) O animal é posicionado em decúbito ventral sobre uma bobina de superfície e mantido anestesiado com isoflurano inalável. Sacos de areia são usados para estabilizar a plataforma de imagem. (CD) As almofadas de ECG são colocadas nas patas e conectadas a um módulo clínico de ECG para registrar a atividade cardíaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Planejamento de ressonância magnética e aquisição de imagens para quantificar a permeabilidade endotelial e a (des)função na artéria braquiocefálica de camundongos ateroscleróticos. (A) Imagens Scout são adquiridas para identificar a região anatômica entre a raiz da aorta e as artérias carótidas. (B) A angiografia por RM é usada para visualizar a vasculatura e planejar os exames subsequentes. (C) As imagens do Look-Locker são adquiridas ao nível da artéria braquiocefálica para determinar o atraso de tempo adequado para anular o sinal do sangue nas imagens subsequentes de realce de gadolínio (LGE). (D) As imagens LGE fornecem uma avaliação visual do aprimoramento da parede do vaso. (E) O mapeamento T1 é usado para calcular a taxa de relaxamento da parede do vaso que é indicativa da concentração de gadolínio. (F) As propriedades vasodilatadoras dependentes do endotélio da parede do vaso são quantificadas após a administração de acetilcolina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Segmentação e análise de imagens para quantificar a permeabilidade endotelial e (dis)função na artéria braquiocefálica de camundongos ateroscleróticos. (A) A parede do vaso é segmentada manualmente nas imagens LGE para quantificar a área/volume de captação de contraste. (B) A parede do vaso é segmentada no mapeamento T1 para calcular a taxa de relaxamento T1 da parede do vaso. (C) A parede do vaso segmentada nas angiografias de RM e nas imagens codificadas do fluxo sanguíneo é usada para estudar as propriedades vasodilatadoras da parede do vaso, calculando as mudanças nas alterações na parede do vaso.
área (ou volume) do lúmen diastólico e fluxo sanguíneo após a administração de acetilcolina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem quantitativa da permeabilidade endotelial e (dis)função (qMETRIC) em camundongos ateroscleróticos. (A) As imagens LGE e os mapas de relaxamento R1 mostram aumento da captação do agente de contraste ligante à albumina dentro da parede do vaso durante a progressão da aterosclerose e a melhora após o tratamento com estatinas. Os dados de imagem são corroborados pelo acúmulo do corante azul de Evan, um corante de ligação à albumina, ex vivo. (B) Alterações nas propriedades vasodilatadoras da parede do vaso, em resposta à administração de acetilcolina, permitem quantificar a vasodilatação dependente do endotélio. Os vasos de controle vasodilatam, enquanto os vasos ateroscleróticos vasoconstringem em resposta à acetilcolina, sugestivo de dano endotelial. O tratamento com estatina melhora o dano endotelial. Os termos "semanas" e "HFD" na figura representam "semanas" e "dieta rica em gordura", respectivamente. Esta figura foi modificada de Phinikaridou, A. et ^al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Varredura / Sequência	Parâmetros de aquisição
Varredura de batedor / piloto	Eco gradiente rápido 3D Transversal: FOV = 50 mm x 27 mm x 14 mm, matriz = 96 x 52, resolução no plano = 0.5 mm x 0.5 mm, espessura do corte = 0.5 mm, TR/TE = 15/6.1 ms, ângulo de inversão = 30°, médias = 1 Coronal: FOV = 200 mm x 102 mm x 14 mm, matriz = 336 x 173, resolução no plano = 0,5 mm x 0,5 mm, espessura do corte = 0,5 mm, TR/TE = 12/6 ms, ângulo de inversão = 30°, médias = 1
Varredura MRA	Eco gradiente rápido 3D, FOV = 30 mm x 30 mm x 8 mm, matriz = 200 x 200, resolução no plano = 0,15 mm x 0,15 mm, espessura da fatia = 0,5 mm, TR/TE = 15/6,1 ms, ângulo de inversão = 40°, médias = 1
Verificação do Look-Locker	Eco gradiente rápido 2D, FOV = 30 mm x 30 mm, matriz = 80 x 80, resolução no plano = 0,38 mm x 0,38 mm, espessura do corte = 2 mm, TR/TE = 19/8,6 ms, TR entre pulsos IR subsequentes = 1000 ms e ângulo de inversão = 10°, médias = 1.
Varredura LGE	Eco gradiente rápido 3D, FOV = 30 mm x 30 mm x 8 mm, matriz = 304 x 304, resolução no plano = 0,1 mm x 0,1 mm, espessura medida do corte = 0,5 mm, fatias = 32, TR/TE = 28/8 ms, TR entre pulsos IR subsequentes = 1000 ms e ângulo de inversão = 30°, médias = 1.
Varredura de mapeamento T1	Eco gradiente rápido 3D, FOV = 36 mm x 22 mm x 8 mm, matriz = 192 x 102, resolução no plano = 0,18 mm x 0,22 mm, espessura de corte medida = 0,5 mm, cortes = 16, TR/TE = 9,6/4,9 ms, ângulo de inversão = 10°, médias = 1.
Angiografia com contraste de fase	2D, eco gradiente rápido, FOV = 40 mm x 23 mm, matriz = 132 x 77, resolução no plano = 0,3 mm x 0,3 mm x 1 mm, TR/TE = 9,8/4,9 ms, ângulo de inversão = 30°, fases cardíacas = 14, médias = 6, velocidade do fluxo (direção pé-cabeça) = 30 cm/s.

TABELA 1: Parâmetros de aquisição de ressonância magnética

Discussion

Determinar a saúde endotelial vascular é um biomarcador de imagem atraente que pode ser usado para diagnosticar riscos relacionados à aterosclerótica e monitorar os efeitos do tratamento. O protocolo qMETRIC descrito aqui pode ser usado para quantificar de forma reprodutível a permeabilidade/vazamento endotelial e (dis)função em um protocolo de ressonância magnética abrangente, rápido e clinicamente aplicável. Essa abordagem pode fornecer uma ferramenta alternativa ou complementar mais simples aos protocolos DCE-MRI existentes para quantificar a permeabilidade endotelial. Também pode fornecer uma ferramenta não invasiva para avaliação direta da (dis)função endotelial em leitos vasculares, como as artérias coronárias e carótidas, em vez de usar técnicas invasivas ou medições substitutas em artérias periféricas menos gravemente afetadas pela doença. A medição da permeabilidade endotelial usando esse método permite a cobertura da aorta, do arco aórtico e das artérias braquiocefálicas e carótidas em alta resolução espacial (0,1 mm para as imagens LGE e 0,22 mm para o mapeamento T1), que é crucial para a segmentação precisa da parede do vaso em roedores. A análise das imagens pode ser realizada usando uma plataforma de código aberto e requer apenas uma simples segmentação da parede do vaso sem a necessidade de modelagem farmacocinética complexa. É importante ressaltar que este protocolo pode ser adaptado para ser usado em vários scanners diferentes disponíveis comercialmente e pode ser estendido para ser usado em diferentes modelos animais e também em humanos. Embora este protocolo descreva a metodologia usando uma configuração de scanner clínico, os protocolos de ressonância magnética também podem ser implementados ao usar scanners de pequenos animais de alto campo. Esses scanners frequentemente oferecem recuperação de inversão, mapeamento T1 e protocolos de angiografia que podem ser usados ou programados em colaboração com os fabricantes de scanners.

Para obter resultados precisos e reprodutíveis, atenção especial deve ser dada a algumas etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, ao criar imagens de pequenos animais em um scanner clínico, bobinas receptoras adequadas e personalizadas são necessárias para maximizar a relação sinal-ruído para alta qualidade de imagem. O posicionamento do animal na bobina também é crucial, evitando a separação e espaços cheios de ar entre o animal e a bobina para melhorar a relação sinal-ruído. Por esse motivo, a área anatômica de interesse deve ser colocada no centro da bobina e, em seguida, movida para o isocentro do ímã para expô-los ao campo magnético com a máxima homogeneidade. Em segundo lugar, um sinal de ECG estável, forte e preciso é fundamental para o acionamento/bloqueio de imagem confiável. Isso é importante para a excitação consistente da magnetização e o tempo da janela de aquisição de imagem em pontos de tempo específicos e para a aquisição de imagens precisas resolvidas no tempo que incluem a fase diastólica final para o teste funcional. Eletrodos baseados em almofada de animais pequenos ou baseados em agulha são opções mais adequadas quando usados em scanners de intensidade de campo mais alto, que são mais bem protegidos em comparação com scanners clínicos. Quando essas opções são usadas em scanners de campo clínico, os cabos de ECG precisam ser deformados juntos para evitar a formação de circuitos ressonantes na frequência de Lamour de ressonância magnética que podem deteriorar o sinal de ECG durante a sequência de pulso. Alternativamente, propomos o uso do módulo de ECG e almofadas usadas para varreduras humanas com ajuste do tamanho da almofada para o da pata do rato e estabilização extra das almofadas com fita adesiva para melhorar a condutividade. Em terceiro lugar, ao adquirir imagens LGE enquanto o agente de contraste ainda está circulando na corrente sanguínea, é crucial escolher o tempo de anulação correto para suprimir eficientemente o pool de sangue para delinear a parede do vaso. Uma sequência de bloqueio visual deve ser executada antes de cada sequência LGE, e o tempo de atraso de inversão precisa ser ajustado de acordo. Em quarto lugar, para um mapeamento T1 exato e preciso usando uma sequência modificada de recuperação de inversão look-locker (MOLLI), o esquema de aquisição de imagem proposto deve ser implementado para cobrir uma série de atrasos de inversão que variam pelo menos de 20 ms a 2000 ms para capturar as espécies T1 curtas e longas. Por fim, a segmentação dos dados de RM deve ser rigorosa e rigorosa para evitar vieses intra e/ou interobservador nos cálculos de área/volume e valor de T1.

Ao contrário da DCE-MRI, o procedimento descrito aqui não fornece dados cinéticos da lavagem e lavagem do agente de contraste na parede do vaso. Em vez disso, fornece um instantâneo da permeabilidade endotelial em um ponto de tempo específico após a injeção do agente de contraste de ligação à albumina, gadofosveset. No entanto, os dados quantitativos extraídos desses pontos de tempo altamente correlacionados com outros corantes de albumina, como o corante azul de Evan, que é considerado um padrão-ouro para medir a permeabilidade endotelial e aumentar a largura da junção comunicante endotelial. Mecanicamente, tanto a fração ligada à albumina quanto a não ligada do gadofosveset são pequenas o suficiente para passar por rupturas nas junções endoteliais e levar ao aumento do sinal de ressonância magnética. Além disso, é possível que a fração não ligada também possa se ligar à albumina intraplaca depois de entrar na parede do vaso e resultar em aumento do sinal. Observou-se que a relaxividade da parede do vaso é de r₁≈17 mmol/L/s, quando o gadofosveset é injetado em dose clínica. Esse valor é mais próximo do relatado para a fração ligada à albumina (r₁≈25 mmol/L/s) em comparação com a fração livre (r₁≈6,6 mmol/L/s)^5,29.

As aplicações futuras deste método de imagem incluem estudos científicos básicos em diferentes modelos animais e outros segmentos arteriais e o uso deste método para avaliar as respostas biológicas a agentes farmacêuticos existentes ou novos. Os estudos podem ser realizados transversalmente ou longitudinalmente para coletar dados mecanicistas e de resultados, respectivamente. O fluxo de trabalho simples torna essa abordagem acessível e clinicamente aplicável para uso em humanos também. A adaptação desse método para imagens de artérias carótidas e periféricas humanas é mais iminente, mas a aplicação desse método para imagens das artérias coronárias requer mais avanços na aquisição de imagens, reconstrução e correção de movimento que estão sendo desenvolvidos^{atualmente 30,31}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetilcolina	Sigma Aldrich	A6625- 100G, 16,6 mg/kg
Equipamento de anestesia	Serviços de anestesia geral	Serviços de anestesia geral Bomba
de aquecimento de circulação	ThermoFisher Scientific, EUA	BOM: 152510101
gel condutor de ECG (Nuprep)	Waever and Company, EUA	Módulo de monitoramento de ECG 10-30-T
	Invivo, EUA	REF 0700-1002
Gadofosveset trisordium (Vasovist/ Ablavar)	Lantheus Medical Imaging Inc, North Billerica, MA, EUA	0,03 mmol/kg
Dieta rica em gordura	Special Diets Services, Witham, Reino Unido	21% de gordura de banha, 0,15% (peso/peso) de colesterol
Caixa de indução	Vet Tech Solutions LTD
Seringas de insulina	BD Biosciences	0,5 mL, 29 G
Software OsirixX	OsiriX Foundation, Genebra, Suíça		Plataforma de código aberto
Philips Achieva MRI Scanner (3 Tesla)	Philips Healthcare, Best, Holanda	Equipado com um sistema de gradiente clínico (30 mT m-1, 200 mT m-1 ms-1)
Único– bobina receptora de microscopia de superfície de loop	Phillips Hamburg	Diâmetro = 23 mm	Construído sob medida