Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Resumo

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Resumo

Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) fornecem uma ferramenta poderosa para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica ( ELA) in vitro. As gravações de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) são um meio de registrar potenciais de campo elétrico de grandes populações de neurônios e analisar a atividade da rede ao longo do tempo. Foi demonstrado anteriormente que a presença de hiPSC-A que são diferenciados usando técnicas para promover um fenótipo de astrócitos da medula espinhal melhorou a maturação e a atividade eletrofisiológica dos neurônios hiPSC-motores (MN) da medula espinhal regionalmente específicos quando comparados àqueles cultivados sem hiPSC-A ou na presença de astrócitos de roedores. Descrito aqui é um método para co-cultura de hiPSC-A da medula espinhal com hiPSC-MN e registrar a atividade eletrofisiológica usando registros de MEA. Embora os protocolos de diferenciação descritos aqui sejam específicos de astrócitos e neurônios que são regionalmente específicos da medula espinhal, a plataforma de co-cultura pode ser aplicada a astrócitos e neurônios diferenciados com técnicas específicas para outros destinos, incluindo hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Esses protocolos visam fornecer um ensaio eletrofisiológico para informar sobre as interações glia-neurônio e fornecer uma plataforma para testar drogas com potencial terapêutico na ELA.

Introdução

Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) são ferramentas poderosas para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) in vitro e fornecem um paradigma translacional para estratégias de descoberta de medicamentos¹. Pesquisadores demonstraram que a cocultura de hiPSC-A com hiPSC-N aumenta a maturação morfológica, molecular, eletrofisiológica e farmacológica de ambos os tipos celulares, gerando redes neuronais complexas e interações astrócitos-neurônios que se assemelham às suas contrapartes in vivo ^2,3....

Protocolo

1. Preparação do meio de cultura celular

1. Preparar os meios de cultura celular individuais utilizando as composições mencionadas na Tabela 1.
2. Misture e filtre o meio estéril em frascos filtrados de 500 mL e armazene protegido da luz a 4 °C por até 2 semanas.

2. Manutenção e passagem de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos não confluentes (hiPSC)

1. Descongelar a matriz da membrana basal (armazenada em alíquotas a -80 °C) num frigorífico de 2-8 °C durante a noite.
2. Diluir a matriz da membrana basal a 1:100 (v/v) em solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) ou no me....

Resultados

O protocolo de padronização da medula espinhal para a geração de hiPSC-MN e hiPSC-A da medula espinhal está descrito na Figura 1. Nesse protocolo, as hiPSCs são mantidas e passadas como colônias não confluentes (Figura 2A). A neurogênese é iniciada (indução neural) através da inibição dupla do SMAD pela adição de LDN193189 e SB431542, inativando as vias da proteína morfogenética óssea (BMP) e do fator de crescimento transformador-beta (TGF-β), respectivamente. U.......

Discussão

Até o momento, métodos baseados em hiPSC e MEA para registros eletrofisiológicos de coculturas de astrócitos-neurônios encontraram aplicação limitada no campo da ELA⁶ e ainda não em plataformas totalmente humanas, em contraste com seu uso mais difundido para modelagem in vitro da epilepsia⁹. Esta plataforma, no entanto, tem o potencial de abordar questões patofisiologicamente relevantes na pesquisa da ELA, como os mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal, a contr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura estéreis de 10 cm	Falcon	353003
frascos de cultura estéreis de 25 cm2	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Concentração de trabalho 110 µ M
500 mL 0,2 µ m Sistema de Filtro CA	Corning	430769
pipeta de 5 mL	Falcon	357543
placas de cultura estéreis de 6 poços	Falcon	3046
Anfotericina B	Gibco	15290018	Concentração de trabalho 2,0 μ g/mL
Detergente aniônico com enzima protease - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Concentração de trabalho 1% m/v
Ácido ascórbico (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolva 100 mg em 250 mL de dH2O para obter estoque de 0,4mg/ml. Filtro estéril através de um 0,22 µ m filtrar, alíquota e congelar a -80 °C. Diluir a 1:1000 para uso. (concentração de trabalho 0,4 µ g/mL).
Placas Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge Plataforma MEA	Matriz de	Maestro Edge
- Matrigel	Corning	354277	Detalhes no protocolo
Microscópio de bancada (estéril sob a capa de cultura de células)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Concentração de trabalho10 μ
M Fator neurotrófico ciliar (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µ g em 1mL de PBS estéril e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 µ g/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para uso. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Tanques e regulador de CO2 para Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µ g em 2,0387 mL de DMSO para obter um 250 µ Estoque M. Alíquota e congelar a -80 °C. Diluir 1:2000 para uso. (concentração de trabalho 125 nM).
Cianquixalina  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Concentração de trabalho 50 μ
M Ácido di-hidrocaínico (DHK)	Tocris	111	Concentração de trabalho 50 μ M e 300 μ M
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Concentração de trabalho 1x
Essential 8 Médio + Suplemento Essencial 8	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL de suplemento Essential 8 (10x)  com 500 mL de Essential 8 Meio de Crescimento (1x)
Soro Fetal Bovino (FBS)	Thermofisher	16140071	Concentração de trabalho 1x
Neurotrófico derivado de linha de células gliais (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolver 100 µ g em 1mL de PBS para 100 µ g/mL e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 µ g/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para uso. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Microscopia Eleitoral	Hemocitômetro	63510-20
Heparina	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolva 200 mg em 100 mL de PBS para obter 2 mg/mL de solução estoque. Alíquota do estoque em 15 mL e 500 µ Tubos L. Diluir 1:1000 para uso. (concentração de trabalho 2 µ g/mL).
Incubadora de cultura de células com umidade controlada	ThermoFisher	370	ajustada para 37 º C, 5 % CO2
Fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1)	R& D systems	291-G1-200	Dissolver 200 µ g em 2 mL de PBS para 100 µ g/mL, em seguida, adicione 18 mL de 0,1% BSA-PBS para fazer 10 µ g / mL de estoque e armazene a -80 & C. Alíquota e congele a -80 & C. Dilua 10 & micro; g/mL de estoque a 1: 1000 para uso. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Ácido Kainc	Abcam	ab144490	Concentração de trabalho 5 μ M
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Concentração de trabalho 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Solução estoque 1 mg/mL, concentração de trabalho 10 µ g/mL (revestimento), 1 µ g/mL (meio celular)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolver 2 mg de LDN em 500 µ L de clorofórmio para obter estoque de 10 mM. Alíquota e congele a -80 ° C. Para usar, dilua o estoque de 1 a 10 em DMSO [para 1 mM] primeiro, depois dilua 1:5000 de 1 mM na mídia desejada para obter 0,2 µ Solução de trabalho
M L-Glutamina	Thermofisher	25030	Concentração de trabalho 100x
placas de vidro MEA	Sistemas Multicanal	60MEA200/30iR-Ti-gr
Pipeta Multicanal P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Concentração de trabalho 1x
Aminoácidos Não Essenciais (NEAA)	Thermofisher	11140050	Concentração de trabalho 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Concentração de trabalho 100x
Poliornitina (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolva 100 mg em 1 mL de ddW para obter 100 mg/mL de solução estoque. Alíquota do estoque em 100 µ Tubos L. (concentração de trabalho 100 µ g / mL)
Cloreto de potássio (KCl)	NA	NA	Concentração de trabalho 100 mM
Purmorlamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolva 5 mg em 9,6 mL de DMSO para obter uma solução de 1 mM. Alíquota e congelar a -80 °C. Diluir 1:1000 para uso. (concentração de trabalho 1 µ M).
Fator neurotrófico recombinante derivado do cérebro humano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrífuga brevemente antes da reconstituição. Dissolver 100 µ g em 1 mL de PBS para 100 µ g/mL e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 µ g/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para uso. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Ácido retinóico (RA)	Sigma	R2625	Dissolva 100 mg em 3,3 mL de DMSO para obter uma solução estoque de 100 mM. Aliquot o estoque 100 µ L/tubo e congelar a -80 °C. Pegue 200 µ L de estoque de 100 mM e diluir 10x (adicionar 1,8 mL de DMSO) para fazer estoque de 10 mM. Alíquota 50 µ L/tubo  e armazene a -80 ° C. Dilua a 1: 10000 para uso. (concentração de trabalho 2 µ M).
Inibidor ROCK-I	Peprotech	1293823	Dissolver 5 mg em 1480 µ L de dH2O para obter estoque de 10 mM, alíquota e congelar a -80 &C. Diluir a 1: 500 para uso. (concentração de trabalho 20 µ M).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolva 5 mg em 1,3 mL de DMSO para obter uma solução estoque de 10 mM. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1:1000 para uso. (funcionando com 10 µ M)
Capas de cultura de células estéreis	Baker Company	SG-600
Suplemento B - B27	Thermofisher	21985023	Concentração de trabalho 50x
Suplemento N - N2 Suplemento	Thermofisher	17502048	Concentração de trabalho 100x
Centrífuga de cultura de células de mesa	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Termoplástico  filme plástico -	Parafilm PARAFILM	P7793
Protease de dissociação tecidual - Dispase	StemCell Technologies	7923	Concentração de trabalho 1x
Inibidor de tripsina	Sigma	T6522-1G	Dissolva 1g em 100mL ddH2O para obter estoque de 10 mg/mL. Alíquota e armazenar a 4 °C. Diluir 1:10 de volume de tripsina para uso. (concentração de trabalho 1 mg/mL).
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermofisher	2530054	Concentração de trabalho 1x
Banho-maria	ThermoFisher	2332	Isotemp

membrana basal Axion Ciências de de