Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (MSC) têm sido tradicionalmente estudadas para suas propriedades regenerativas, mas, mais recentemente, suas características imunoregulatórias têm estado na vanguarda. Eles interagem e regulam a atividade das células imunes. O foco deste estudo é a regulação do MSC da atividade fagocítica do macrófago. A fagocitose macrófago (MΦ) é uma parte importante da resposta do sistema imunológico inato à infecção, e os mecanismos pelos quais a MSC modula essa resposta estão sob investigação ativa. Apresentado aqui é um método para estudar a fagocitose de MΦ de partículas de zimosã não opssonizadas conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH enquanto em co-cultura com MSC. À medida que a atividade fagocítica aumenta e as partículas de zimosã rotuladas são fechadas dentro do ambiente ácido do fagolico, a intensidade de fluorescência da molécula sensível ao pH aumenta. Com os comprimentos de onda de excitação e emissão adequados, a atividade fagocítica é medida usando um espectrofotômetro fluorescente e os dados cinéticos são apresentados como alterações em unidades fluorescentes relativas durante um período de 70 minutos. Para suportar esses dados quantitativos, a mudança na atividade fagocítica é visualizada por meio de imagens dinâmicas. Os resultados utilizando este método demonstram que, quando na co-cultura, o MSC melhora a fagocitose de zymosan não opssonizado tanto ingênua quanto ifn-γ tratada MΦ. Esses dados se somam ao conhecimento atual da regulação do MSC do sistema imunológico inato. Este método pode ser aplicado em investigações futuras para delinear totalmente os mecanismos celulares e moleculares subjacentes.

Introdução

Células-tronco mesenquimais (MSC) são células progenitoras que dão origem a células de tecido conjuntivo. O MSC está presente em tecidos mamíferos adultos e pode ser isolado da medula^{óssea 1}. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, essas células são amplamente estudadas². Estudos iniciais focados na regulação do MSC das células T^3,4,5,^6, mas mais recentemente, sua regulação das células macrófagos (MΦ), um dos principais componentes celulares da imunidade inata, tem recebido maior atenção....

Protocolo

NOTA: Todas as técnicas de preparação média e cultura celular são realizadas sob condições assépticas usando um armário de biossegurança com fluxo laminar. Todas as etapas de incubação da cultura descritas são realizadas utilizando-se uma incubadora projetada para manter uma atmosfera de 37 °C, 5% de CO₂e 95% de umidade.

1. Cultura celular

1. Preparação do meio de crescimento
   1. Para MSC e LADMAC, adicione 50 mL de FBS e 5 mL de mistura antibiótico/antimíctico de 100x a 500 mL de DMEM de alta glicose.
   2. Para o MΦ, adicione 50 mL de FBS, 100 mL de meio de condição LADMAC (preparado seguindo as etapas da seção ....

Resultados

Após calcular a média ± SEM para cada grupo em todos os pontos de tempo, os dados são apresentados em formato gráfico de linha com o eixo Y como a Intensidade Fluorescente Relativa e o eixo X como Tempo. O Arquivo Suplementar 1 fornece um exemplo de dados brutos de uma leitura cinética da placa de 96 poços em formato de planilha.

Neste estudo, os resultados ideais apresentados na Figura 3A, e na Tabela 3 demonstram que 1) a cocult.......

Discussão

A análise da fagocitose utilizando biopartículas conjugadas a um corante sensível ao pH é uma ferramenta relativamente nova que tem se mostrado vantajosa sobre partículas tradicionais rotuladas fluorescentes^12,19,20. Com partículas tradicionais rotuladas por fluorescentes, apenas a análise de ponto final é viável. A detecção é realizada com microscopia fluorescente e/ou espectrofluorometria após a lavagem ou sacieçação de partíc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplaca de Poliestireno Preto de 96 Poços	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
Solução de 0,4% de azul de tripano	MilliporeSigma	T8154-20ML
Tubos de Centrífuga de Polipropileno Estéril Cônico de 15 mL e 50 mL	ThermoFisher	339653
Tampa de Vidro com Câmara de 4 poços com poços não removíveis	ThermoFisher	155382PK
Antibiótico-Antimicótico (100X)  Sistema de Imagem Gibco	ThermoFisher	15240096
Axiobserver 7	Zeiss
Albumina de Soro Bovino (BSA)	MilliporeSigma	A8806-1G
Elevador de células	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
Frascos de cultura, tratados para cultura de tecidos, área de superfície 75  cm2, pescoço inclinado, com tampa, filtrado	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	Linha Celular MSC de Camundongo
DMEM, Soro Bovino Fetal 11965092 ThermoFisher com Alto Teor de Glicose
		02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	Mouse MΦ Linha celular
LADMAC Linha celular	ATCC	CRL-2420	As células LADMAC secretam o fator de crescimento fator estimulador de colônias 1 (CSF-1).
Solução de imagem de células vivas	ThermoFisher	A14291DJ
PBS, pH 7,4	ThermoFisher	10010031
pHrodo Green Zymosan Biopartículas Conjugadas	ThermoFisher	P35365
IFN murino recombinante-&gama;	Preprotech	315-05
Spectramax i3X	Molecular Devices
Unidades de Filtro de Vácuo de Uso Único Estéril, 250 mL, 0.2 µ m	ThermoFisher	568-0020
Filtros de seringa estéreis, 0,2 micrômetro	ThermoFisher	723-2520
Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos, 100 mm x 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	ThermoFisher	25300054

, qualificado, inativado pelo calor ThermoFisher 16140071 Hemocitômetro FisherScientific