Medindo o pH, As Químicas Redox e a Capacidade Degradativa dos Macropinossos usando microscopia multiscopia memétrica de proporção de fluorofora dupla

Liam Wilkinson; Johnathan Canton

doi:10.3791/62733

Artigo de método

Medindo o pH, As Químicas Redox e a Capacidade Degradativa dos Macropinossos usando microscopia multiscopia memétrica de proporção de fluorofora dupla

1.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/62733

⸱

19 de agosto de 2021

Liam Wilkinson¹^,² , Johnathan Canton²^,³

¹Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, ²Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, ³Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

Descrevemos protocolos para medir pH, eventos oxidativos e digestão de proteínas em macropinosos individuais em células vivas. Uma ênfase é colocada na microscopia metométrica de dupla fluorofora e nas vantagens que oferece sobre técnicas de base populacional.

Resumo

Nos últimos anos, o campo da macropinocitose cresceu rapidamente. A macropinocistose emergiu como um mecanismo central pelo qual as células imunes inatas mantêm a homeostase e a imunidade do organismo. Simultaneamente, e ao contrário de seu papel homeostático, também pode conduzir várias patologias, incluindo câncer e infecções virais. Ao contrário de outros modos de endocitose, as ferramentas desenvolvidas para estudar a maturação de macropinossomos permanecem subdesenvolvidas. Aqui o protocolo descreve ferramentas recém-desenvolvidas para estudar o ambiente redox dentro do lúmen de macropinosos precoces e maduros. Metodologias para o uso de microscopia de fluorescência métrica ratiorada na avaliação do pH, produção de espécies reativas de oxigênio e a capacidade degradante dentro do lúmen de macropinosos individuais em células vivas são descritas. Medidas únicas de organela oferecem a vantagem de revelar a heterogeneidade espacial, que muitas vezes se perde com abordagens de base populacional. A ênfase é colocada nos princípios básicos da microscopia multiscopia multiscopia multiscopia fluoroforatométrica, incluindo seleção de sondas, instrumentação, calibração e métodos unicelulares versus populações.

Introdução

Macropinocistose refere-se à absorção de grandes quantidades de fluido extracelular em organelas citoplasmáticas ligadas à membrana chamadas macropinossomos¹^,². É um processo altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida livre, como a ameba Dictyostelium spp. ³, assim como anthozoans⁴ e metazoanos². Na maioria das células, a macropinocitose é um evento induzido. A ligadura dos receptores de superfície celular induz a saliência de extensões de membrana plasmática movidas por actina, referidas como babados. Uma ....