A preparação isolada do pulmão do coelho é uma ferramenta padrão-ouro na pesquisa pulmonar. Esta publicação tem como objetivo descrever a técnica desenvolvida para o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos na reatividade das vias aéreas, preservação pulmonar e pesquisa pré-plínica em transplante de pulmão e edema pulmonar.
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Artigo de método
Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema isolado de perfusão pulmonar tem sido amplamente utilizado em pesquisas pulmonares, contribuindo para elucidar o funcionamento interno dos pulmões, tanto micro quanto macroscopicamente. Esta técnica é útil na caracterização da fisiologia pulmonar e patologia medindo atividades metabólicas e funções respiratórias, incluindo interações entre substâncias circulatórias e os efeitos de substâncias inaladas ou perfumadas, como no teste de drogas. Enquanto os métodos in vitro envolvem o corte e a colheita de tecidos, o sistema isolado de perfusão pulmonar ex vivo permite trabalhar com um órgão funcional completo possibilitando o estudo de uma função fisiológica contínua ao mesmo tempo em que recria ventilação e perfusão. No entanto, deve-se notar que os efeitos da ausência de inervação central e drenagem linfática ainda devem ser totalmente avaliados. Este protocolo tem como objetivo descrever a montagem do aparelho pulmonar isolado, seguido da extração cirúrgica e cannulação de pulmões e coração de animais de laboratório experimentais, bem como exibir a técnica de perfusão e processamento de sinais dos dados. A viabilidade média do pulmão isolado varia entre 5-8 h; durante esse período, a permeabilidade capilar pulmonar aumenta, causando edema e lesão pulmonar. A funcionalidade do tecido pulmonar preservado é medida pelo coeficiente de filtragem capilar (Kfc), usado para determinar a extensão do edema pulmonar ao longo do tempo.
Introdução
Brodie e Dixon descreveram pela primeira vez o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo em 1903 1. Desde então, tornou-se uma ferramenta padrão-ouro para estudar a fisiologia, farmacologia, toxicologia e bioquímica dos pulmões2,3. A técnica oferece uma forma consistente e reprodutível de avaliar a viabilidade dos transplantes de pulmão, e determinar o efeito de mediadores inflamatórios como histamina, metabólitos ácido aracidônico e substância P, entre outros, bem como suas interações durante fenômenos pulmonares como broncoconstrição, atelectasia e edema pulmonar. O sistema pulmonar isolado tem sido uma técnica fundamental para desvendar o importante papel dos pulmões na eliminação de aminas biogênicas de circulação geral4,5. Além disso, o sistema tem sido utilizado para avaliar a bioquímica do surfactante pulmonar6. Nas últimas décadas, o sistema de perfusão de pulmão ex-vivo tornou-se uma plataforma ideal para pesquisas de transplante de pulmão7. Em 2001, uma equipe liderada por Stig Steen descreveu a primeira aplicação clínica do sistema de perfusão pulmonar ex-vivo, usando-o para recondicionar os pulmões de um doador de 19 anos, que foi inicialmente rejeitado pelos centros de transplante devido às suas lesões. O pulmão esquerdo foi colhido e perfundido por 65 min; depois, foi transplantado com sucesso em um homem de 70 anos com DPOC8. Outras pesquisas sobre o recondicionamento pulmonar usando a perfusão ex-vivo levaram ao desenvolvimento da técnica de Toronto para perfusão pulmonar prolongada para avaliar e tratar os pulmões doados feridos9,10. Clinicamente, o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo tem se mostrado uma estratégia segura para aumentar as piscinas de doadores, tratando e recondicionando pulmões doadores abaixo do padrão, não apresentando diferença significativa de riscos ou desfechos em relação aos doadores de critérios padrão10.
A principal vantagem do sistema isolado de perfusão pulmonar é que os parâmetros experimentais podem ser avaliados em um órgão funcional completo que preserva sua função fisiológica sob uma configuração artificial de laboratório. Além disso, permite medir e manipular a ventilação mecânica pulmonar para analisar os componentes da fisiologia pulmonar, como resistência às vias aéreas, resistência vascular total, troca de gás e formação de edema, que até o momento não podem ser medidos precisamente em animais de laboratório2. Notavelmente, a composição da solução com a qual o pulmão é perfusado pode ser totalmente controlada, permitindo a adição de substâncias para avaliar seus efeitos em tempo real e coleta amostral de perfusão para posterior estudo11. Os pesquisadores que trabalham com o sistema pulmonar isolado devem ter em mente que a ventilação mecânica causa decomposição do tecido pulmonar encurtando seu tempo útil. Esta queda progressiva nos parâmetros mecânicos pode ser significativamente retardada por hiperinflar os pulmões ocasionalmente durante o tempo do experimento4. Ainda assim, a preparação geralmente não pode durar mais de oito horas. Outra consideração para o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo é a ausência de regulação nervosa central e drenagem linfática. Os efeitos de sua ausência ainda não são totalmente compreendidos e poderiam potencialmente ser uma fonte de viés em certos experimentos.
A técnica isolada do sistema de perfusão pulmonar pode ser realizada no modelo coelho com alto grau de consistência e reprodutibilidade. Este trabalho descreve os procedimentos técnicos e cirúrgicos para a implementação da técnica de perfusão pulmonar isolada ex-vivo , desenvolvida para o modelo coelho no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, na Cidade do México, com a intenção de compartilhar os insights e fornecer um guia claro sobre os passos-chave na aplicação desse modelo experimental.
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Protocolo
O sistema isolado de perfusão no modelo coelho tem sido amplamente utilizado no Laboratório de Hiperresponsividade Brônquica no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. O protocolo inclui coelhos neozelandeses com um peso aproximado de 2,5-3 kg. Todos os animais foram mantidos em condições padrão de vivarium e alimentação ad libitum em conformidade com as diretrizes oficiais mexicanas para animais de laboratório (NOM 062-ZOO-1999) e sob o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição, 2011). Todos os procedimentos de animais e métodos de cuidado animal apresentados neste protocolo foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
NOTA: A preparação do sistema isolado de perfusão pulmonar envolve a morte deliberada de um animal sob anestesia e via eutanásia.
1. Equipamento e preparação de aparelhos.
- Arranjo do equipamento:
- Configure uma mesa de operação com tamanho de acordo com o peso do coelho.
- Monte a tampa do tórax artificial na coluna de aço com a câmara de vidro por baixo e o ventilador com uma bomba de rolo pelos lados.
- Certifique-se de que a tampa está facilmente inclinada a ter a cânula traqueal em linha com a traqueia para permitir uma conexão mais rápida.
- Tórax artificial:
NOTA: É uma parte essencial do sistema. Consiste em uma câmara de vidro revesida de água selada por uma capa especial. A tampa funciona como o porta-órgãos com as conexões para cannular a traqueia e os vasos embutidos nela.- Configure um jato venturi operado por ar comprimido para gerar a pressão negativa dentro do tórax artificial.
NOTA: O módulo de controle de ventilação (VCM) permite ajustes separados de pressões inspiratórias e expiratórias finais, bem como taxa de respiração e a razão de duração inspiratória à duração total do ciclo.
- Configure um jato venturi operado por ar comprimido para gerar a pressão negativa dentro do tórax artificial.
- Aparelho:
- Certifique-se de que um aparelho normalmente funcionando consiste em uma coluna de aço principal montada em uma placa base segurando o tórax artificial, com o pneumotachômetro e transdutor de peso localizado acima dele e atrás da bobina pré-aquecimento com uma armadilha de bolhas.
- Conecte um transdutor de pressão diferencial ao pneumotámetro e outro à pressão da câmara. Coloque um par diferente de transdutores de pressão atrás do tórax para medir a perfusão e pressões venosas.
- Conecte o estoque de troca abaixo do oxigenador com um eletrodo de nível e o sistema de ventilação ao lado do aparelho.
2. Extração cirúrgica do bloco cardiopulmonar.
- Anestesia:
- Use uma combinação de um sedativo (xilazine) e um barbiturato (pentobarbital).
NOTA: Diferentes coquetéis anestésicos podem ser usados sem efeito em desfechos experimentais. - Primeiro, sedeia os coelhos saudáveis da Nova Zelândia com uma única injeção intramuscular de cloridrato de xilazina (3-5 mg/kg). Certifique-se de que os coelhos permaneçam calmos e relaxados para permitir mais manipulação após alguns minutos da injeção.
- Após a sedação, utilize as veias auditivas marginais (laterais) como acesso à anestesia dos coelhos com uma injeção intravenosa de sódio pentobarbital (28 mg/kg).
- Use uma combinação de um sedativo (xilazine) e um barbiturato (pentobarbital).
- Monitorização:
- Para evitar anestesia insuficiente ou depressão excessiva das funções cardíacas e respiratórias, monitore os seguintes parâmetros. Para avaliar a profundidade da anestesia, realize um teste de beliscão do dedo do dedo do dedo.
- Certifique-se de que a membrana mucosa é rosa. Tons azuis ou cinzentos indicam hipóxia.
- Certifique-se de que a frequência cardíaca está entre 120-135 batidas/min, e que a temperatura corporal não caia abaixo de 36,5 °C.
- Colocação animal:
- Raspe o tronco do coelho e coloque o animal na mesa de operação em posição supina. Coloque o sistema de ventilação perto da mesa, atrás da cabeça do coelho, para permitir conectar a cânula rapidamente após a traqueotomia para evitar danos tissulares.
- Incisão e traqueotomia:
- Disseca a pele com uma incisão de linha mediana ventral de 3-5 cm do diafragma até o pescoço.
- Com a tesoura de operação, corte o 2/3 anterior da traqueia entre dois anéis de cartilagem para inserir a cânula traqueal através da membrana fibrosa traqueal.
- Inserir um 5 mm (diâmetro externo; OD) cânula traqueal através da membrana fibrosa traqueal e use uma sutura de seda 4-0 para corrigi-la cuidadosamente.
- Coloque as pinças ou pinças debaixo da traqueia para garantir que a cânula não se dobre contra a traqueia.
- Ventilação de pressão positiva:
- Enquanto os pulmões permanecerem fora do tórax artificial, use uma bomba de respiração de pequenas espécies para ventilar uma pressão positiva, a fim de evitar o colapso pulmonar durante a cirurgia.
- Inicie a ventilação através da cânula traqueal conectada à bomba de respiração rapidamente após a traqueotomia e antes que o tórax seja aberto.
- Ajuste o volume da maré em 10 mL/kg.
NOTA: Dependendo da configuração do experimento e do modelo de tórax artificial, forneça ventilação de pressão positiva pela mesma bomba de ventilação usada para fornecer pressão negativa ou outra, concedendo uma rápida relaculação.
- Toracotomia e exsanguinação:
- Para acessar a cavidade torácica, use um bisturi ou uma tesoura para abrir a parede do tórax e realizar uma esternotomia medial até o terço superior do tórax.
- Mantenha as metades do tórax abertas por dois retratores. Vários retalhos pulmonares geralmente cercam o coração.
- Localize a veia cava superior e inferior e encaminhe-as com roscas.
- Antes da exsanguinação do animal, identifique o ventrículo direito e injete 1000 UI/kg de heparina.
- Imediatamente após a injeção, ligar a veia cava superior e inferior com o fio pré-looped e realizar a exsanguinação.
- Colheita coração-pulmão:
- Colher o bloco cardiopulmonar suavemente e rapidamente. Use dissecção digital direta ou tesoura de mola para separar o tecido conjuntivo de modo a remover os pulmões do tórax.
- Dissecar a vasculatura na área, bem como o esôfago.
- Corte o manúbrio sterni para estender a esternotomia medial em direção à cânula traqueal, liberando a traqueia em ambos os lados de tecido de conexão.
- Agora, ressegue a traqueia acima da cânula traqueal. Puxe suavemente a cânula em um eixo craniocaudal à medida que a fixação dorsal da traqueia e pulmões é ressecada.
- Canulação:
- Levante os pulmões isolados do tórax e coloque-os cuidadosamente sobre uma gaze estéril em uma placa de petri.
- Para evitar atelectasia, ventile os pulmões usando ventilação de pressão positiva com pressão final positiva (PEEP) fixada em 2 cmH2O.
- Remova os ventrículos cortando-os do coração ao nível da ranhura atrioventricular.
- Depois de abrir os dois ventrículos, introduza a cânula da artéria pulmonar OD de 4,6 mm para o coelho com uma cesta através da artéria pulmonar e introduza a cânula de átrio esquerdo de 5,9 mm para o coelho com a cesta através da válvula mitral no átrio esquerdo.
- Use uma sutura de seda 4-0 na artéria pulmonar e átrio esquerdo para consertar as cânulas. Inclua os tecidos circundantes nas ligaduras da artéria pulmonar e átrio esquerdo para evitar a distensão dessas estruturas.
- Injete 250 mL de solução isotônica salina através da cânula arterial para retirar o sangue restante do leito vascular.
3. Técnica de perfusão.
- Configuração:
- Coloque os pulmões isolados cuidadosamente na câmara pulmonar.
- Coloque a traqueia no transdutor na tampa da câmara.
- Conecte as naves cânuladas ao sistema de perfusão.
- Feche a câmara e fixe-a com a fechadura rotativa.
NOTA: O circuito de perfusão recirculante consiste em um reservatório venoso aberto, uma bomba peristáltica, um trocador de calor e uma armadilha de bolhas. - Neste ponto, conecte a tampa da câmara e troque sobre uma torneira para mudar de ventilação de pressão positiva para negativa. Para verificar a ventilação de pressão negativa dos pulmões e o fechamento hermético da câmara, inspecione a excursão respiratória da pressão pulmonar e de câmara no medidor de pressão.
- Perfuuse os pulmões com 200 mL de perfusato artificial sem sangue (um tampão bicarbonato Krebs-Ringer contendo 2,5% de albumina bovina).
- Inicie o fluxo de perfusato a 3 mL/min/kg, em seguida, intensifique lentamente o fluxo durante um período de 5 minutos para 5 mL/min/kg. Atinja um fluxo de 8 mL/min/kg ao longo dos próximos 5 minutos e, em seguida, após outro período de 5 min, atinja um fluxo máximo de 10 mL/min/kg. Tome cuidado para evitar que o ar entre no circuito.
NOTA: Mantenha o pH e a temperatura do perfusato dentro das faixas fisiológicas (pH 7.4-7.5; temperatura, 37 °C-38 °C). Para ajustar o pH, adicione NaHCO3 (1N) ou aumente o fluxo de dióxido de carbono. Alternativamente, use HCl (0.1N) para acidificar.
- Parâmetros:
- Verifique se os parâmetros de perfusão e ventilação predeterminados estão definidos conforme necessário.
- Ventilar os pulmões com ar umidificado a uma frequência de 30 bpm, um volume de maré de 10 mL/kg, e uma pressão expiratória final (Pe) de 2 cmH2O.
NOTA: A pressão arterial pulmonar (0-20 mmHg) corresponde à altura do nível líquido no oxigenador ou reservatório em centímetros acima do tronco pulmonar, enquanto a pressão venosa pulmonar corresponde à altura da câmara de equilíbrio de pressão acima do átrio esquerdo. Ambos os valores podem ser modificados. Note que a pressão do átrio esquerdo também é de 0-20 mmHg.
- Alcançar condições da zona 3:
- Use os dois cateteres conectados às portas laterais do cânulas fixados na artéria pulmonar, átrio esquerdo e transdutores de pressão para medir as pressões arterial (Pa) e venosa (Pv).
- Coloque as pressões da linha de base no nível do hilum pulmonar (referência zero).
- Conduzir os experimentos sob condições de ventilação da zona 3. Para isso, espere de 10 a 15 min para obter um equilíbrio caracterizado por um estado isogravimétrico.
- Certifique-se de que a pressão venosa é maior do que a pressão alveolar (Palv) e que a pressão arterial permaneça maior do que ambas (Pa > Pv > Palv) para que as condições da Zona 3 ocorram.
- Certifique-se de que o peso dos pulmões permaneça constante e as pressões atrial arterial e esquerda são estáveis para alcançar condições da zona 3 para abrir um número máximo de vasos pulmonares e manter o teor de leito microvascular durante o experimento.
NOTA: A medição do Kfc como indicador de edema pulmonar não tem variação entre um sistema manual e de perfusão automática.
- Controle eletrônico e processamento de sinais: Certifique-se de que o fluxo respiratório, as alterações de peso, a pressão microvascular, o volume da maré, a resistência vascular, entre outros, sejam registrados em uma unidade eletrônica central múltipla que integra sinais provenientes dos transdutores e os exibe no sistema de avaliação.
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Resultados
O sistema isolado de perfusão pulmonar permite manipulação de órgãos para biópsia, coleta de amostras de perfusão e coleta de dados em tempo real de parâmetros fisiológicos. O sistema isolado pode ser usado para testar muitas hipóteses envolvendo diferentes funções e fenômenos pulmonares, desde atividade metabólica e enzimática até períodos de formação e preservação de edema para transplantes de pulmão.
A Figura 1 exibe um diagrama do sistema de perfusão pulmonar ...
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Discussão
Este trabalho apresenta uma visão geral do sistema isolado de perfusão pulmonar, uma técnica essencial na pesquisa de fisiologia pulmonar. O sistema isolado de perfusão pulmonar oferece um grande grau de versatilidade em seus usos e permite a avaliação de vários parâmetros relevantes no teste de uma ampla gama de hipóteses15. Um sistema pulmonar isolado é uma ferramenta com presença mundial que, na última década, estabeleceu ainda mais sua relevância para avaliações específicas de órgãos e também ...
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à doutora Bettina Sommer Cervantes pelo apoio na redação deste manuscrito, e kitzia Elena Lara Safont por seu apoio às ilustrações.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubulação Tygon E-Lab de 2 paradas, 3,17 mm de diâmetro, 12/pacote, preto/branco | Sachs Elektronik | 73-4312 | |
| Adaptador para ventilação com pressão positiva no IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Fornecimento alternativo de gás livre de pressão para IPL-4: Para fornecer à traqueia uma mistura de gases diferente do ar ambiente durante a ventilação negativa | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Unidade Base para o Pulmão Perfundido Isolado de Coelho para Fetal | de Porco Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Soro bovino A2: D41albumina liofilizado em pó | sigma | 3912 | 500 g |
| Cloreto de cálcio, CaCl2· 2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Frascos criogênicos | Corning | 430659 | 2 mL |
| de D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Transdutor Diferencial de Baixa Pressão DLP2.5, Faixa +- 2,5 cmH2O, Conector HSE | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Transdutor de Pressão Diferencial MPX, Faixa +- 100 cmH2O, Conector HSE | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Etanol tubos | Caledon | ||
| Falcon | 14 mL | ||
| Bomba Peristáltica Harvard P-230 (Completa com Caixa de Controle e Acionamento do Motor P-230) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Pneumotacômetro Linear Aquecido 0 a 10 L / min faixa de fluxo | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Controlador de Aquecedor para Pneumotacômetro Único 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparina | PISA | 5000 UI | |
| Coluna HPLC (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4,6 mm |
| Filtro de Seringa Hidrofílica | Millex | SLLGR04NL | |
| de Núcleo IPL-4 de 4 mm para Pulmão de Coelho Isolado para Porco Fetal, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Sistema de núcleo IPL-4 para pulmão isolado de coelho para fetal, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Reservatório de vidro revestido para solução tampão, com fritas e tubos, 6,0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Termostático Circulador, Tipo E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Volume de Banho, Faixa de Temperatura 20 a 150° C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Cânula de Átrio Esquerdo para Coelho com Cesta, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Transdutor de Pressão Arterial de Baixo Alcance P75 para Módulo PLUGSYS | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4· 7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Tubo de Microcentrífuga | Corning | 430909 | |
| Opção de Controle de Ventilação por Pressão Negativa com Regulador de Pressão para IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| Coelhos | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital de sódio) | PISA | Q-7833-215 | |
| Estojo PLUGSYS, Tipo 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| Módulo Contador de Tempo PLUGSYS TCM | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| Módulo Amplificador Transdutor PLUGSYS (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| Módulo Amplificador Transdutor PLUGSYS (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| Módulo de Controle de Ventilação PLUGSYS VCM-4R com Regulador de Pressão | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Cloreto de potássio, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Di-hidrogenofosfato de potássio, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (cloridrato de xilacina) | PISA | Q-7833-099 | |
| Cânula de Artéria Pulmonar para Coelho com Cesta, OD 4,6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Faca | de bisturi | ||
| Servo controlador de serotonina 5-HT | |||
| para perfusão (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Tubo de microcentrífuga | Costar | 3620 | 1,7 mL |
| Bicarbonato de sódio, NaHCO < sub>3< / sub> | sigma | S6014 | |
| Cloreto de sódio, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Luvas cirúrgicas nº 7 1/2 | |||
| Luvas cirúrgicas nº 8 | |||
| Tubos Taygon | |||
| para coelho, OD 5,0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
Referências
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Reimpressões e permissões
