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Artigo de método

Perfil de N-glicano de Glicoproteínas por Cromatografia Líquida de Interação Hidrofílica com Fluorescência e Detecção por Espectrometria de Massa

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DOI:

10.3791/62751

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25 de setembro de 2021

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 2Department of Chemistry, Hacettepe University

Neste artigo

Resumo

O perfil de N-glicanos das glicoproteínas é essencial para descobrir novos biomarcadores e entender as funções dos glicanos em eventos celulares. Além disso, a análise de N-glicanos de biofármacos proteicos é muito importante para uso humano. Neste artigo, uma estratégia de alto rendimento para identificar e quantificar estruturas de N-glicanos foi apresentada usando a técnica HILIC-FLD-MS/MS.

Resumo

A glicosilação é uma modificação vital encontrada nas proteínas. O perfil de N-glicano das glicoproteínas é necessário para detectar novos candidatos a biomarcadores e determinar alterações de glicanos em doenças. A maioria das proteínas biofarmacêuticas disponíveis comercialmente são glicoproteínas. A eficácia desses medicamentos é afetada pelos padrões de glicosilação. Portanto, é necessário um método de caracterização aprofundado para os N-glicanos. Aqui, apresentamos uma abordagem abrangente para análise qualitativa e quantitativa de N-glicanos usando cromatografia líquida de interação hidrofílica equipada com detecção de fluorescência e espectrometria de massa em tandem (HILIC-FLD-MS/MS). Os N-glicanos foram liberados das glicoproteínas com um método fácil e marcados por uma marca de fluoróforo de procainamida na estratégia. Posteriormente, os N-glicanos marcados com procainamida foram analisados por uma técnica de HILIC-FLD-MS/MS. Nesta abordagem, as estruturas de N-glicanos foram confirmadas pela análise espectrométrica de massa em tandem, enquanto a detecção de fluorescência foi usada para a análise quantitativa. Um aplicativo para análise de dados dos picos de N-glicanos detectados é descrito no estudo. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer glicoproteína extraída de várias espécies.

Introdução

A glicosilação é uma modificação pós-traducional vital observada nas proteínas1. Múltiplos processos enzimáticos regulam a modificação da glicosilação em organismos celulares. Os glicanos estão ligados às proteínas por esses processos enzimáticos, e as proteínas submetidas a essa modificação são chamadas de glicoproteínas1. Dois tipos de glicosilação são comumente observados em proteínas. A O-glicosilação é a ligação dos O-glicanos à cadeia lateral de resíduos de aminoácidos serina ou treonina. A N-glicosilação é a ligação de N-glicanos à cadeia lateral do resíduo de aminoácido asparagina em uma proteína.

A estrutura, estabilidade e dobramento das proteínas são afetados pelas ligações de glicano2. O processo de glicosilação influencia drasticamente as funções das proteínas, e as glicoproteínas regulam muitas funções celulares nos organismos 3,4. Por exemplo, proteínas fortemente glicosiladas protegem suas glicoproteínas da degradação proteolítica5. Outro exemplo são os glicanos de proteínas da glândula tireoide que regulam o transporte de Tg e a síntese hormonal 6,7. Para explicar seus papéis nos eventos celulares, é necessária uma caracterização aprofundada das glicoproteínas8.

Os perfis de N-glicanos das glicoproteínas mudam em situações de doença 9,10,11,12. O perfil de N-glicanos derivados de glicoproteínas cruciais ou fluidos corporais é necessário para descobrir novos biomarcadores e entender as mudanças na atividade enzimática em casos de doenças. Por outro lado, a maioria dos biofármacos proteicos são glicoproteínas, e seus perfis de glicanos influenciam a eficácia dos medicamentos13. Portanto, um método aceitável de perfil de N-glicano deve ser realizado no desenvolvimento de biofármacos proteicos adequados para uso humano14.

A glicômica é uma disciplina emergente usada para identificar e quantificar estruturas glicânicas de moléculas glicosiladas 15,16. Muitos métodos têm sido utilizados para traçar o perfil dos glicanos de espécies glicosiladas, incluindo NMR17 e MS18. A cromatografia líquida de interação hidrofílica com detecção de fluorescência (HPLC-HILIC-FLD) é o método padrão-ouro para traçar o perfil de N-glicanos derivados de glicoproteínas19. Quando essa estratégia é combinada com a detecção por espectrometria de massa, a identificação de estruturas de N-glicanos pode ser mais fácil e confiável. A maioria das etiquetas de fluorescência usadas na análise de N-glicanos com espectrometria de massa tem baixa eficiência de ionização. Em contraste, a procainamida aumenta a eficiência de ionização dos N-glicanos, que é usada para obter espectros de massa em tandem eficientes de estruturas de N-glicanos 20,21. Fragmentos específicos podem ser obtidos a partir desta estratégia por espectrometria de massa em tandem para a identificação estrutural de N-glicanos, como núcleo fucosilado22 (proc-HexNAc1Fuc1) e bissecting tipos23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

Este estudo demonstra um protocolo fácil para o perfil de N-glicano de glicoproteínas com HILIC-FLD-MS/MS. O método apresentado inclui quatro etapas: (1) liberação de N-glicanos das glicoproteínas, (2) marcação de N-glicanos por um marcador de procainamida, (3) purificação dos N-glicanos marcados com procainamida e (4) análise de dados.

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Protocolo

NOTA: O plasma humano usado está disponível comercialmente (Tabela de Materiais). Não foram utilizadas outras amostras biológicas obtidas de humanos.

1. Liberação de glicano

  1. Desnaturação de (glico)proteínas
    1. Prepare os padrões de glicoproteína (por exemplo, IgG, um anticorpo monoclonal) a uma concentração de 10 μg·μL-1 em H2O deionizado. Para o plasma humano, a concentração utilizada é de 70 μg·μL-1.
      NOTA: As amostras devem ser vortexadas até que todas as proteínas sólidas sejam dissolvidas. O plasma humano (liofilizado) foi utilizado para a preparação das amostras de plasma.
    2. Pegue 20 μL de amostras de glicoproteína (200 μg) e plasma humano liofilizado (1,4 mg).
    3. Adicionar 40 μL de SDS a 2% (dodecil sulfato de sódio) (p/v).
    4. Incubar as amostras a 60 °C durante 10 minutos para desnaturar as (glico)proteínas.
      NOTA: As amostras podem ser misturadas a 500 rpm por um termomixer durante a incubação. Um banho-maria agitado pode ser usado alternativamente.
  2. Liberação de glicanos
    1. Adicione 20 μL de 4% de Igepal-CA630 às amostras da etapa 1.1.4.
    2. Adicione 20 μL de 5x PBS (tampão fosfato salino).
    3. Preparar a enzima PNGase F na concentração de 1 U·μL-1 em água deionizada.
    4. Adicione 1 U de enzima para padrões de glicoproteína e 2 U de enzima para amostras de plasma humano.
    5. Incubar as amostras a 37 °C durante 16 h.
  3. Rotulagem de procainamida
    1. Prepare a solução de rotulagem usando ácido clorídrico procainamida (110 mg · mL-1 em DMSO / AA (dimetilsulfóxido / ácido acético glacial) 7/3, v / v).
    2. Preparar a solução de aminação redutora com cianoborohidreto de sódio (65 mg·mL-1 em DMSO/AA, 7/3, v/v).
      CUIDADO: O cianoborohidreto de sódio é muito tóxico e inflamável. Use protetores oculares. O complexo de 2-picolina borano (107 mg·mL-1 em DMSO) pode ser usado alternativamente.
    3. Misture essas soluções na proporção de 1:1, v/v para preparar a mistura de rotulagem.
    4. Adicione 100 μL desta mistura de rotulagem à amostra liberada de glicano da etapa 1.2.5.
    5. Incubar as amostras a 65 °C durante 2 h.

2. Purificação de N-glicanos marcados com procainamida por cartucho de extração em fase sólida (SPE)

  1. Prepare uma solução de celulose microcristalina (100 mg · mL-1) em água deionizada.
  2. Pegue 300 μL de celulose microcristalina e insira-a nos tubos da microcentrífuga.
  3. Lave a celulose microcristalina com 1 mL de H2O deionizado.
  4. Lave a celulose microcristalina com 1 mL de ACN/MQ (acetonitrila/dH2O), 85/15, v/v para condicionamento.
    NOTA: A microcentrífuga deve ser usada por 1 min para descartar cuidadosamente as soluções de lavagem.
  5. Pegue 120 μL de solução de liberação de glicano e misture com 680 μL de ACN para obter condições de carga adequadas (85/15, v / v, ACN / amostra).
  6. Misture esta mistura com celulose microcristalina nos tubos de microcentrífuga.
  7. Incube-o à temperatura ambiente em um termomisturador agitando a 500 rpm por 15 min.
  8. Transfira a pasta para um cartucho SPE (capacidade de volume de 1 mL).
    NOTA: Não permita que o ar entre na embalagem do cartucho.
  9. Descarte as soluções de carregamento passando lentamente (1 gota/segundo).
    NOTA: Certifique-se de que o sistema SPE esteja conectado à bomba de vácuo. Os solventes podem fluir com a gravidade. Quando necessário, aplique vácuo através de uma bomba de vácuo. A pressão de vácuo aplicada deve ser ajustada adequadamente para transferir líquidos lentamente.
  10. Lave a amostra passando 1 mL de solução ACN/MQ/TFA (acetonitrila/dH2O/ácido trifluoroacético) (85/14/1, v/v/v) duas vezes.
  11. Lave a amostra passando 1 mL da mistura ACN/MQ (85/15, v/v) duas vezes.
  12. Eluir os N-glicanos marcados com procainamida com 0,75 mL de água.
  13. Seque a solução de eluição com um concentrador durante a noite.
    NOTA: Use uma temperatura concentradora de 45 °C para secar.
  14. Dissolva as amostras secas em uma mistura de 100 μL de ACN/MQ (75/25, v/v) e transfira esta solução para os frascos, incluindo um inserto.
    NOTA: As amostras redissolvidas devem ser submetidas a vórtices durante 20 segundos.

3. Análise HILIC-FLD-MS/MS

  1. Insira adaptadores em T (T) na coluna HILIC para separar o fluxo em dois volumes iguais. Conecte um dos dois ao detector FLD, o outro ao detector MS.
    NOTA: As linhas de fluxo devem ter os mesmos comprimentos.
  2. Ajuste um programa de gradiente para separações HILIC de N-glicanos marcados com procainamida, conforme indicado na Figura Suplementar 1. Utilizar fase móvel A: formato de amónio a 50 mM (pH: 4,4 e fase móvel B: 100 % ACN).
    NOTA: O programa de gradiente pode ser otimizado ainda mais dependendo da heterogeneidade do glicano das amostras.
  3. Clique no botão Sampler e defina o volume de injeção para 10 μL.
  4. Clique na composição da coluna e ajuste a temperatura da coluna para 60 °C.
  5. Clique em FLD e ajuste os comprimentos de onda de excitação e emissão FLD para 310 nm e 370 nm, respectivamente.
  6. Ajuste a fonte MS, a sintonia e os parâmetros MS/MS conforme exibido na Figura Suplementar 2.
    NOTA: Os parâmetros MS e MS/MS podem ser alterados dependendo da espectrometria de massa usada na análise.

4. Análise de dados

  1. Identificação de N-glicanos marcados com procainamida
    1. Exporte dados MS/MS por um formato adequado para pesquisas em bancos de dados (por exemplo, .mgf, .xml).
    2. Insira-os em uma ferramenta de pesquisa de banco de dados para a identificação de N-glicanos.
    3. Selecione o nome da amostra listado no software e clique no botão Glycan Search para a identificação de N-glicanos marcados com procainamida usando o banco de dados Carbbank com parâmetros fornecidos (Figura Suplementar 3).
    4. Abra o botão editar cromatogramas no software de análise de dados para dados brutos e selecione o tipo de cromatograma de íons extraído filtrando todos os MSn.
    5. Adicione massas específicas para o fragmento fucosilado proc-N1F1 (m/z 587.3+) e os fragmentos bissectados proc-H1N3 (m/z 1009.5+) e proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+).
    6. Determinar os precursores que contêm fragmentos de estrutura de N-glicano fucosilados e bisseccionados.
    7. Exporte as estruturas de N-glicano identificadas pelo software (Tabela Suplementar 1-3).
    8. Verificar os precursores detectados manualmente para a determinação de estruturas de N-glicano fucosiladas e bisseccionadas.
  2. Quantificação de N-glicanos marcados com procainamida por um software de código aberto24
    1. Selecione o cromatograma FLD nos cromatogramas e clique no método no software. Abra um método para exportar cromatogramas como formato de arquivo .xy.
    2. Converta o formato de arquivo .xy dos cromatogramas exportados em arquivos .txt.
    3. Abra o software de análise quantitativa.
      NOTA: O software usado no estudo pode ser baixado de uma fonte do Github (https://github.com/Tarskin/HappyTools).
    4. Siga as instruções e tutoriais do programa apresentados pelo desenvolvedor.
      NOTA: Recomenda-se usar um processo em lote para exportar áreas relativas.
    5. Ajuste os parâmetros de configuração (Figura Suplementar 4). Defina quatro picos mínimos e 27 relações sinal/ruído para calibrações.
    6. Abra o arquivo de resultados com o software adequado, como o Microsoft Excel, para avaliação posterior.

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Resultados

Nesta abordagem apresentada, os N-glicanos foram liberados pela primeira vez, marcados pela etiqueta de procainamida e purificados por cartuchos de SPE contendo celulose. Em seguida, a análise de N-glicanos de IgG, trastuzumabe e plasma humano foi realizada por um sistema HPLC-HILIC-FLD-MS/MS. Os cromatogramas MS (pico de base) e FLD das estruturas N-glicano determinadas obtidas de IgG e trastuzumab são mostrados na Figura 1, respectivamente. Os dados de MS/MS obti...

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Discussão

O perfil de N-glicanos das glicoproteínas inclui etapas desafiadoras. Embora existam muitas metodologias diferentes para esse fim, uma abordagem adequada deve ser selecionada para a identificação e quantificação das estruturas do N-glicano 14. HILIC-FLD é a abordagem padrão-ouro para a quantificação de N-glicanos. No entanto, a identificação de todos os tipos de N-glicanos pela detecção de FLD não é alcançada. Portanto, a anális...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Ministério do Desenvolvimento-República da Turquia com o número do projeto: 2016 K121230. Bekir Salih agradece à Academia Turca de Ciências (TUBA) pelo apoio financeiro parcial.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes de ácido acéticoCarlo Erba401413Glacial RS para LC / MS
AcetonitrilaMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC com dedector FLD da série 1260Agilent Technologies
Formato de amônioCarlo ErbaReagentes 419741para LC / MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Espectrometria de massaBruker Daltonics
CeluloseSigma Aldrich310697microcristalina, pó, 20 μ m
Água DeionizadaCarlo ErbaReagents 412111Para LC/MS
Dimetil sulfóxido SigmaAldrich41639BioUltra, para biologia molecular, ≥ 99,5% (GC)
Tubo SPE de polipropileno vazio com fritas de PESigma Aldrich5422020 μ m porosidade, volume 1 mL
Coletor de extração, 20 posiçõesÁguasWAT200607Completo com rack para tubos de 13 x 100 mm
Plasma humanoSigma AldrichP9523liofilizado
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896para biologia molecular
IgGSigma AldrichI4506pó liofilizado
Fosfato tamponado salinoSigma AldrichP4417Comprimido
PNGase F enzimaPromegaV483A
Cloridrato de procainamidaabcamab120955
Cianoborohidreto de sódioSigma Aldrich156159grau de reagente, 95%
dodecil sulfato de sódioSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
Ácido trifluoroacéticoSigma Aldrich302031para HPLC, ≥ 99,9%

Referências

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