Desenvolvimento de uma tira imunocromatográfica de fluxo lateral para detecção rápida e quantitativa de compostos de pequenas moléculas

As tiras imunocromatográficas de fluxo lateral baseadas em membrana (ICSs) são ferramentas úteis para detecção rápida e de baixo custo. A membrana de nitrocelulose como o portador e o ouro coloidal como marcadores de reagentes de diagnóstico rápido de cromatografia imune são o método POCT (teste de ponto de cuidado) mais usado, e o escopo de teste do projeto é mais amplo. A partir de sua aplicação original no monitoramento durante a gravidez, seu uso foi estendido para monitorar o estado de coagulação sanguínea^1,2, lesão do miocárdio³, medicina veterinária⁴, resíduos de pesticidas^5,doenças infecciosas⁶ e concentrações de medicamentos. Mais tipos de amostras podem ser avaliadas, incluindo urina, saliva, sangue inteiro, soro e outros fluidos corporais^7,8,9.

Nos últimos anos, inúmeros novos ensaios foram desenvolvidos para detectar biomarcadores no diagnóstico de transtornos, incluindo HPLC, UPLC, LC-MS e ELISA, sensíveis e precisos, críveis e específicos. No entanto, esses métodos requerem instrumentação sofisticada, pré-processamento complexo e tratamentos demorados⁹. Assim, desenvolver uma estratégia de diagnóstico de ponto de cuidado mais rápida e conveniente para a detecção auto e em tempo real de compostos ativos medicinais é urgente^10,11.

A popularidade dos ICSs, especialmente para testes comuns, é impulsionada pela facilidade de uso, pois não necessitam de profissionais ou configurações instrumentais elaboradas¹². Em outras palavras, pessoas que não possuem treinamento especial podem operar tiras ou autotestes¹³. Os resultados do teste podem ser obtidos em 5 minutos, o que significa que pode ser usado para inspeções no local¹⁴. Além disso, de acordo com nossos cálculos, o custo das tiras poderia ser inferior a 1 RMB^15,o que significa que os testes são baratos para promover¹⁶. Portanto, o ICS é um dispositivo descartável relativamente preciso, simples e barato. ICSs baseados em ouro coloidal^17,18 também são aplicados na detecção rápida covid-19.

O princípio do ICS pode ser dividido em sanduíche ICS e ICS competitivo. Figura 1A é um diagrama esquemático do sanduíche ICS, que é usado principalmente para detectar substâncias macromoleculares como proteínas, incluindo marcadores tumorais, fatores inflamatórios e gonadotropina coriônica humana (HCG, antígeno da gravidez precoce). Neste método, anticorpos emparelhados direcionados a diferentes epítopos do antígeno são usados, e o anticorpo de captura é seco na membrana NC como uma linha de teste. O anticorpo rotulado é seco na almofada conjugada, e o anticorpo secundário é usado como linha de controle.

Figura 1B é um diagrama esquemático do ICS competitivo, que é usado principalmente para detectar pequenas substâncias moléculas (MWCO < 2000 Da). O antígeno de revestimento é fixado na membrana NC como uma linha de teste, e o anticorpo rotulado é seco na almofada conjugada. Durante a detecção, a amostra e o fluxo de anticorpos rotulados através da linha de detecção sob ação capilar, e o antígeno revestido liga competitivamente o antígeno livre na amostra e desenvolve uma cor vermelha na linha de detecção.

Recentemente, descrevemos o procedimento de geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais¹⁹. Neste trabalho, desenvolvemos um novo imunoensaio de fluxo lateral baseado no preparado anti-SSD mA²⁰ para detecção rápida e no local. Os resultados indicam que o ensaio de imunocromatografia é uma ferramenta indispensável e conveniente para detectar compostos derivados de produtos naturais.

Figura 1 Diagrama esquemático do ensaio de imunocromatografia (A) Tiras de teste imunocromatomatográficas sanduíche. (B) Tiras de teste anti-cromatográficas imunes competitivas indiretas. Este número foi modificado a partir de Zhang et al., 2018²¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Revisão ética da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (número de aprovação 2017BZYYL00120).

1. Preparação e Caracterização do Ouro Coloidal

NOTA: Para a síntese de ouro coloidal, como o ouro coloidal é facilmente adsorvido na parede interna do vaso e é propenso à precipitação por impurezas, o recipiente para síntese e armazenamento de ouro coloidal deve ser completamente limpo e encharcado em ácido (40 mL de água destilada, 360 mL de ácido sulfúrico concentrado, 20 g de dícroma de potássio) ou submetido ao tratamento de passivação superficial. Foi utilizado um método de redução de ácido cítrico para sintetizar o ouro coloidal.

1. Ligue o agitador magnético e coloque o frasco (250 mL) na batedeira.
2. Prepare 4% solução de ácido cloreto de ouro e solução de citrato de sódio de 1%, respectivamente.
3. Adicione 120 mL de água destilada a um frasco de fundo redondo e aqueça-o a ferver em um agitador magnético termostático.
4. Continue fervendo, e adicione rapidamente 0,5 mL de ácido cloroaurico de 4% e 5 mL de 1% de citrato de sódio.
5. Observe a cor da solução. A solução de ácido cloroaurico amarelo pálido torna o vinho tinto em poucos minutos.
6. Continue aquecendo por 10 minutos, até que a solução mude de incolor para vinho transparente.
7. Desligue a potência da batedeira magnética termostática, esfrie até a temperatura ambiente e mova a mistura para uma garrafa limpa. Armazene a 4 °C.
8. Determine o tamanho e a morfologia dos AuNPs por espectroscopia ultravioleta e imagem TEM.
   NOTA: Diferentes tamanhos de partículas de ouro coloide para várias aplicações podem ser obtidos alterando a proporção de sódio citrato e ácido cloroaurico.

2. Síntese de AuNPs-mAb Conjugado

NOTA: Uma vez que os anticorpos se ligam ao ouro coloidal por adsorção eletrostática, as cargas na superfície das proteínas e do ouro coloidal afetam diretamente a intensidade de ligação; portanto, o valor do pH tampão é um fator importante que afeta a estabilidade do conjugado de ouro anticorpo-colooidal. Os mAbs SSD e anti-SSD são usados como exemplos neste protocolo.

1. Avaliação do pH de acoplamento
   1. Adicione 100 μL de solução NaCl (10% m/v) em oito tubos.
   2. Ajuste as soluções AuNP em pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 com 0,1 M K₂CO₃.
   3. Adicione 100 μL de solução de ouro coloidal (pH ajustado 5-12) a oito tubos contendo NaCl.
   4. Deixe as soluções em pé por vários minutos após a mistura. Observe a mudança de cor de cada solução de tubo e grave o tubo que permanece vermelho.
   5. Escolha o valor do pH com a menor adição de K₂CO₃ e cor de solução estável como o valor ideal de pH para preparar conjugados AuNP-mAb.
      NOTA: Não use um medidor de pH porque a sonda pode ser destruída por AuNPs.
2. Avaliação da quantidade de anticorpos
   1. Adicione 100 μL de solução NaCl (10% m/v) a oito tubos.
   2. Adicione 100 μL de solução de ouro coloidal com pH ideal a cada tubo.
   3. Adicione as soluções de anticorpos monoclonais (concentração proteica 0,1 mg/mL-3,2 mg/mL) aos oito tubos acima mencionados.
   4. Deixe as soluções em pé por vários minutos após a mistura. Observe a mudança de cor de cada solução de tubo e grave o tubo que permanece vermelho.
   5. Escolha a quantidade de anticorpos com a menor concentração de mAb e cor de solução estável como a quantidade mAb ideal para preparar conjugados AuNP-mAb.
3. Prepare o tampão de resuspensão: adicione 1 M Tris-HCl (pH 8.8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Interpol 20 e 1% (v/v) PEG 20000 e misture bem.
4. Síntese de conjugados AuNP-mAb
   1. Pegue 10 mL de solução de ouro coloidal e use 0,1 M K₂CO₃ para ajustar a solução ao valor ideal de pH.
   2. Adicione lentamente mAbs SSD em concentrações apropriadas e agite à temperatura ambiente por 30 minutos.
   3. Centrifugar a mistura a 83 x g (1.000 rpm) por 10 min a 4 °C. Remova o precipitado, que contém impurezas ou ouro coloidal precipitado.
   4. Centrifugar a mistura a 8.330 x g (10.000 rpm) por 30 min a 4 °C. Descarte o supernasal, e o precipitado é o conjugado coloidal de ouro-mAb.
   5. Adicione o tampão de ressuspensão para dissociar a precipitação.

3. Montagem da Tira

NOTA: Para imunoensaio de fluxo posterior, a seleção e o pré-tratamento do material da membrana afetarão diretamente o teste, que deve ser investigado. A tira imunocromatográfica consiste em uma amostra pad, uma almofada conjugada, uma membrana nitrocelulose (NC), uma almofada absorvente e uma placa de PVC(Figura 1). O material da membrana deve ser verificado e avaliado por estereomicroscopia para eliminar a inhomogeneidade.

1. Cole a membrana NC em uma placa de PVC 2 cm além da borda da extremidade de sucção da placa.
2. Adicione SSD-BSA (2 mg/mL) em voz baixa à membrana NC (2 cm além da borda superior) como linha de teste (1 mm de largura), e adicione igG anti-rato de cabra (1,5 mg/mL) em gota na membrana NC (2 cm além da borda inferior) como linha de controle (1 mm de largura). Controle a quantidade de proteína adicionada.
3. Conecte a almofada absorvente à folha de PVC acima da membrana NC e sobreponha-a com a membrana NC por 2 mm.
4. Submergir a membrana de fibra de vidro na solução conjugada AuNPs-mAb. Seque a membrana úmida em uma incubadora a 37 °C.
5. Corte a membrana de fibra de vidro para 5 cm de comprimento e 2 cm de largura e use-a como uma almofada conjugada.
6. Cole a almofada conjugada pré-tratada sob a membrana NC. O comprimento da sobreposição com a membrana NC deve ser de 0,1 cm.
   NOTA: A membrana de fibra de vidro tem uma forte capacidade de ligar e liberar proteínas.
7. Corte a membrana de fusão de 3 para 1,8 cm de comprimento e 3,5 cm de largura e use-a como a almofada de amostra.
8. Cole a almofada de amostra na placa de PVC e sobreponha-a com a almofada conjugada por 2 mm.
9. Corte a placa de papel montada em tiras de 3,5 mm de largura usando uma máquina de corte e compacte-a usando um sistema de laminação em lote.
10. Por fim, coloque as tiras de teste na casca, sele-as em um saco de papel alumínio contendo dessecante e armazene-as longe da luz. Os ICSs estão agora montados.
    NOTA: O acima é o procedimento laboratorial. Na produção, equipamentos de pulverização de ouro e instrumentos de membrana cruzada são usados para pulverizar ouro e fazer as linhas T e C.

4. Detecção quantitativa

1. Solte 50 μL de solução amostral no orifício da amostra para observar o processo de cromatografia.
   NOTA: Como resultado da ação capilar impulsionada pelo absorvente, a solução amostral migra para a outra extremidade da tira. Quando a solução amostral chega à almofada conjugada, o SSD (antígeno) da amostra reage com o AuNPs-mAb pré-carregado na almofada. Quando a solução migra e atinge a linha T, o AuNPs-mAb sem SSD pode ser capturado seletivamente pelo SSD-BSA (conjugado de proteína portador de antígeno), mostrando como uma cor vermelha na linha T. Em seguida, a solução migra para a linha C, onde os AuNPs-mAb são capturados por IgG anti-rato de cabra na região, mostrando assim como uma cor vermelha na linha C.
2. Analise as tiras com um leitor de tiras portátil. A máquina pode fornecer a razão da linha de teste para a linha de controle (T/C).
3. Avalie a especificidade, sensibilidade, repetibilidade e estabilidade do teste ics.
   NOTA: Sob detecção qualitativa, uma linha vermelha indica um resultado positivo (linha de controle). Duas linhas vermelhas indicam um resultado negativo (linhas de teste e controle). Se a linha de controle não estiver presente, o teste será considerado inválido.

Caracterização do ouro coloidal
As soluções de ouro coloidal preparadas eram vermelho claret. Foram utilizadas análises tem para determinar a morfologia e a forma de AuNPs (Figura 2A-D). A Figura 2A e a Figura 2B revelam que as partículas são poliédricas em forma e uniformemente distribuídas. O diâmetro médio dos AuNPs foi encontrado em aproximadamente 14 nm (Figura 2C). Uma imagem TEM (HRTEM) de alta resolução (HRTEM) de AuNPs é mostrada na Figura 2D e Figura 2E. A imagem HRTEM tirada de um AuNP individual mostra um padrão de franja contínua com um espaçamento de 0,117 nm. Os picos de absorção UV-vis das cinco soluções coloidais de ouro foram de 518 nm, 521 nm, 524 nm, 534 nm e 540 nm, o que mostrou que o tamanho da partícula aumentou ligeiramente com a diminuição da citrato de sódio(Figura 2F).

Figura 2 Caracterização do ouro coloidal. (A) imagem TEM de AuNPs (100.000× ampliação). (B) Imagem TEM de AuNPs (500.000× ampliação). (C) A distribuição de tamanho de AuNPs. Como visto na imagem TEM, os diâmetros dos AuNPs variaram de 10 nm a 18 nm, com um diâmetro médio de aproximadamente 14 nm. (D, E) Imagem TEM (HRTEM) de alta resolução (HRTEM) de AuNPs. A imagem HRTEM tirada de um AuNP individual mostra um padrão de franja contínua com um espaçamento de 0,117 nm. (F) Espectros de absorção UV-vis de diferentes AuNPs variando de 10 nm a 18 nm. Este número foi modificado a partir de Zhang et al., 201821. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação das varetas
Sensibilidade do ICS
Para determinar a sensibilidade do ICS, foram utilizadas tiras imunocromatográficas para detectar uma variedade de diferentes concentrações de SSD (150.000, 60.000, 12.000, 2400, 480 e 96 ng/mL) amostras padrão(Figura 3A). A água duplamente destilada foi usada como controle. No experimento quantitativo, as tiras foram escaneadas por um leitor de ICS portátil JY1502GS(Figura 3B-C). A equação de regressão linear foi y = −0,113ln(x) + 1,5451, com coeficiente de correlação (R2) de 0,983(Figura 3D). Exibiu boa linearidade em 96 ng/mL a 150 μg/mL. O valor ic50 foi de 10,39 μg/mL. No experimento quantitativo, o tempo ideal de teste foi sugerido para ser de 10 minutos.

Figura 3 Caracterização do imunoensaio de fluxo lateral para SSD. (A) Fotografias de resultados para soluções padrão contendo diferentes concentrações de SSD avaliadas utilizando o ICS. (B) Fotografia da varredura de ouro coloidal combinada. (C) Os padrões de intensidade das linhas de teste e controle escaneadas pelo instrumento quantitativo de ouro coloidal. (D) Curva padrão de icELISA para determinação SSD utilizando o ICS. A equação de regressão é y = −0,113ln(x) + 1,5451, com coeficiente de correlação (R2) de 0,983. Este número foi modificado a partir de Zhang et al., 201821. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Especificidade do ICS
A especificidade do ICS foi testada avaliando a reatividade cruzada com compostos semelhantes ao SSD. A Tabela 1 mostra a reatividade cruzada do ICS com compostos relacionados ao SSD. Pode-se ver claramente que o ICS só tinha baixa reatividade cruzada com o SSa e não teve reação cruzada com outros compostos, incluindo SSc, SSb1 ou SSb2 (Tabela 1),indicando que o ICS preparado tem alta especificidade.

Mesa 1. Reatividade cruzada de compostos medidos pelo ICS e icELISA.  A especificidade do ICS foi avaliada pelo ICS (a) e icELISA (b). Esta tabela foi modificada a partir de Zhang et al., 201821.

Taxa de recuperação
Conforme mostrado na Tabela 2,a taxa média de recuperação foi de 102,05% (média ± SD, n = 3). Com base em sua precisão e consistência, este ensaio foi suficientemente confiável para a determinação do SSD em amostras biológicas.

Mesa 2. Taxa de recuperação de SSD.   Os dados são a média ± SD de amostras triplicadas em cada concentração picotada de SSD. O percentual de recuperação foi calculado da seguinte forma: recuperação (%) = quantidade/quantidade medida × 100%. Esta tabela foi modificada a partir de Zhang et al., 201821.

Análise de estabilidade do ensaio do ICS
Para avaliar a estabilidade do ICS, foram testadas as tiras de teste armazenadas durante 8 e 16 semanas e comparadas com as tiras recém-preparadas. A Tabela 3 mostra que os resultados das tiras armazenadas e recém-preparadas para as amostras negativas e positivas foram essencialmente inalterados, indicando que o ICS pode ser armazenado à temperatura ambiente por pelo menos vários meses e que é adequado para promoção e aplicação em larga escala.

Mesa 3. Variações entre ICS utilizadas para análise de SSD.   aOs valores indicam coeficientes de variância para amostras triplicadas em 3 tiras diferentes utilizadas 1 dia após a fabricação. b Os valores indicam coeficientes de variância para amostras triplicadas em 3 tiras diferentes utilizadas após serem armazenadas por 4 semanas. c Os valores indicam coeficientes de variância para amostras triplicadas em 3 tiras diferentes utilizadas após serem armazenadas por 8 semanas. Esta tabela foi modificada a partir de Zhang et al., 201821.

Os autores não têm nada a revelar.