Isolamento de RNA Total de Pseudomonas aeruginosa em Biofilmes para Medição da Expressão Gênica

Resumo

Este protocolo apresenta um método para isolar RNA de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa cultivados em lâminas de câmara para sequenciamento de alto rendimento.

Resumo

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno bacteriano oportunista que causa infecções nas vias aéreas de pacientes com fibrose cística (FC). P. aeruginosa é conhecida por sua capacidade de formar biofilmes protegidos por uma matriz de exopolissacarídeos. Essa matriz permite que os microrganismos sejam mais resistentes a fatores externos, incluindo o tratamento com antibióticos. Um dos métodos mais comuns de crescimento de biofilme para pesquisa é em placas de microtitulação ou lâminas com câmara. A vantagem desses sistemas é que eles permitem o teste de múltiplas condições de crescimento, mas sua desvantagem é que eles produzem quantidades limitadas de biofilme para extração de RNA. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo detalhado, passo a passo, sobre como extrair RNA total de pequenas quantidades de biofilme de qualidade e quantidade suficientes para sequenciamento de alto rendimento. Este protocolo permite o estudo da expressão gênica dentro desses sistemas de biofilme.

Introdução

A maioria das infecções bacterianas crônicas, como infecções pulmonares em pacientes com fibrose cística (FC) e infecções relacionadas a próteses, são caracterizadas pelo crescimento de organismos dentro de biofilmes. Os biofilmes¹ são comunidades de bactérias envoltas em uma matriz composta principalmente de polissacarídeos². As bactérias dentro dos biofilmes podem ser de crescimento lento, metabolicamente dormentes e em condições anaeróbicas e hipóxicas. Os biofilmes são mais resistentes aos antibióticos devido a fatores como diminuição da penetração de antibióticos, aumento da express....

Protocolo

O Comitê de Ética em Pesquisa (REB) é necessário para a coleta e processamento de amostras de escarro de seres humanos. Este estudo foi aprovado pelo Hospital for Sick Children (REB#1000019444). O Conselho de Ética em Pesquisa (REB) é obrigado a coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Esses estudos foram aprovados pelo Hospital for Sick Children REB#1000058579.

1. Formação de biofilme

1. Cultive isolados de Pseudomonas aeruginosa obtidos a partir de amostras de escarro de pacientes com FC usadas neste estudo em placas de ágar Luria Broth (LB) em uma incubadora a 37 ° C du....

Resultados

A visão geral do método é mostrada na Figura 1. Anteriormente, usamos lâminas de câmara de 8 poços para cultivar biofilmes de P. aeruginosa e expô-los a antibióticos antes de examiná-los por microscopia confocal em diferentes momentos^12,13. Este método pode ser usado para extrair RNA total diretamente de biofilmes cultivados neste sistema, a fim de estudar alterações na expressão gênica pós-tratamento. Este protocolo foi oti.......

Discussão

O RNA total é extraído com sucesso de 17 amostras diferentes de biofilme bacteriano em triplicata, resultando em um total de 51 amostras. As quarenta e nove bibliotecas de RNA são agrupadas e sequenciadas com sucesso. No geral, isso valida nossos critérios de qualidade com uma taxa de sucesso de 96%, embora mais da metade das amostras sejam consideradas de baixa abundância e de qualidade abaixo do ideal 34,35,36,37.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Eletroforese automatizada de biomoléculas
Kit Agilent RNA 6000 pico	Agilent	5067-1513 Chip de	eletroforese de RNA de alta sensibilidade para gerar um
tampão de lise de DNA/RNA	Zymo Research	D7001-1-50	Um tiocianato de guanidínio e tampão de lise à base de N-Lauroilsarcosina vendido como parte de um kit de purificação de ácido nucleico
Pesquisa	D7010-2-10	Zymo do tampão da preparação do dna/RNA	Um tampão do HCl da guanidina e do álcool etílico usado para a purificação do ADN e do RNA Protetor do
ADN/RNA		R1100-50	do ADN e do RNA preservação/reagente da proteção
do ADN/RNA Tampão de lavagem do tampão	Zymo Pesquisa	D7010-3-6	Um tampão do sal e do álcool etílico usado para a purificação do ADN e do RNA
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	Sequenciador de alto rendimento
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Gere bibliotecas para plataformas de sequenciamento de alto rendimento MGI a partir do RNA total.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	Um disruptor de células de alta energia e alto rendimento
NEBNext rRNA Depletion Kit (bactérias)	New England Biolabs	E7850X	Depleção eficiente e específica de rRNA bacteriano (5S, 16S, 23S)
Sistema de lâminas de câmara Nunc Lab-Tek II	Thermo Fisher Scientific	154534	lâmina de câmara de 8 poços com poços removíveis
Fluorômetro	QubitFluorômetro Thermo Fisher Scientific	Q33238	para DNA, RNA e proteínas
Kit de Ensaio Qubit RNA HS	Thermo Fisher	Scientific Q32852	Ensaio fluorométrico de alta sensibilidade para medir a concentração de RNA
Filtros Spin-Away	Zymo Research	C1006-50-F	Coluna giratória à base de sílica usada principalmente para ligar ou remover DNA genômico
Alças de inoculação estéreis, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Alças de inoculação estéreis e descartáveis para manipulação de microrganismos
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	Tubos de 2 mL contendo matriz de lise de esferas de 0,1 e 0,5 mm para homogeneização de amostras biológicas
Zymo Spin IIICG Colunas	Zymo Research	C1006-50-G	Coluna giratória à base de sílica para purificação de DNA e RNA
Filtros Zymo-Spin III-HRC	Zymo Research	C1058-50	Remover inibidores como compostos polifenólicos, ácidos húmicos/fúlvicos, taninos, melanina, etc.
Kit Zymobiomics DNA/RNA Miniprep	Zymo Research	R2002	Kit de extração dupla de DNA e RNA
Solução Zymobiomics HRC Prep	Zymo Research	D4300-7-30	Para ser usado com filtros Zymo-Spin III-HRC para remover inibidores de PCR

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