Aqui, apresentamos uma metodologia simples, potente e versátil para investigar a sobrevivência neuronal ao estresse citotóxico em neurônios corticais primários com resolução celular em tempo real ou em material fixo.
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Artigo de método
Um método escalável para estudar a sobrevivência neuronal em cultura neuronal primária com resolução de célula única e em tempo real
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A perda neuronal está no centro de muitas neuropatologias, incluindo acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Diferentes métodos foram desenvolvidos para estudar o processo de sobrevivência neuronal sob estresse citotóxico. A maioria dos métodos é baseada em abordagens bioquímicas que não permitem a resolução de uma única célula ou envolvem metodologias complexas e caras. Apresentado aqui é um paradigma experimental versátil, barato e eficaz para estudar a sobrevivência neuronal. Este método aproveita a marcação fluorescente esparsa dos neurônios, seguida de imagens ao vivo e quantificação automatizada. Para isso, os neurônios são eletroporados para expressar marcadores fluorescentes e co-cultivados com neurônios não eletroporados para regular facilmente a densidade celular e aumentar a sobrevida.
A etiquetagem esparsa por eletroporação permite uma quantificação automatizada simples e robusta. Além disso, a marcação fluorescente pode ser combinada com a co-expressão de um gene de interesse para estudar vias moleculares específicas. Aqui, apresentamos um modelo de AVC como um modelo neurotóxico, a saber, o ensaio de privação de oxigênio-glicose (OGD), que foi realizado em uma câmara hipóxica caseira acessível e robusta. Finalmente, dois fluxos de trabalho diferentes são descritos usando o IN Cell Analyzer 2200 ou o ImageJ de código aberto para análise de imagem para processamento semiautomático de dados. Esse fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado a diferentes modelos experimentais de toxicidade e ampliado para triagem de alto rendimento. Em conclusão, o protocolo descrito fornece um modelo in vitro de neurotoxicidade acessível, acessível e eficaz, que pode ser adequado para testar os papéis de genes e vias específicas em imagens ao vivo e para triagem de medicamentos de alto rendimento.
Introdução
O estudo de distúrbios neuronais requer modelos experimentais que sejam passíveis de análises genéticas, moleculares e celulares. Os neurônios corticais primários são um modelo muito potente para estudar a sobrevivência e toxicidade neuronal 1,2,3,4. Sob as condições apropriadas, os neurônios primários desenvolverão progressivamente contatos sinápticos e apresentarão características de neurônios maduros. Portanto, este modelo é mais confiável do que as linhagens celulares imortalizadas na modelagem da fisiologia dos neurônios e mais passível de manipulações do que os modelos animais. No entanto, em comparação com as linhagens celulares, os neurônios corticais primários são difíceis de transfectar e relativamente frágeis. Além disso, a intrincada morfologia dos neurônios corticais pode complicar a imagem e a análise em culturas de alta densidade. Por outro lado, as culturas neuronais primárias de baixa densidade são mais fáceis de analisar, mas tendem a ser mais frágeis.
Levando tudo isso em consideração, este artigo apresenta um fluxo de trabalho in vitro acessível, versátil e escalável para modelar e investigar a sobrevivência neuronal (Figura 1). Os pontos-chave deste protocolo são: i) o método de eletroporação in vitro dos neurônios com um marcador fluorescente para permitir a marcação e imagem esparsas de células vivas; ii) sua versatilidade em diferentes modelos de citotoxicidade; e iii) a análise semiautomatizada ou automatizada.
O sistema de eletroporação (ver Tabela de Materiais) fornece um procedimento aberto e barato que não envolve kits e soluções específicas 4,5,6. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado para obter uma ótima eficiência de transformação e densidade de neurônios transfectados, misturando células eletroporadas com células não eletroporadas. A co-cultura com neurônios ingênuos (não eletroporados) melhora significativamente a viabilidade das células eletroporadas em comparação com culturas de baixa densidade. Além disso, permite a marcação esparsa com uma densidade ajustável dos neurônios eletroporados, mantendo um nível consistente de expressão gênica. É importante apontar para 3-5% de neurônios eletroporados em ensaios de sobrevivência.
Ter rotulagem esparsa facilita essencialmente a automação da análise de imagem porque as células são bem separadas e facilmente distinguíveis. Notavelmente, este paradigma experimental pode ser adaptado para testar vários genes de interesse, co-cultivando simultaneamente neurônios co-eletroporados com diferentes marcadores fluorescentes citosólicos (por exemplo, proteína fluorescente ciano, proteína fluorescente vermelha (RFP), proteína fluorescente verde (GFP)) no mesmo poço. Semelhante a outros ensaios de citotoxicidade (por exemplo, iodeto de propídio ou lactato desidrogenase), o ensaio aqui descrito é baseado no fato de que a morte neuronal é acompanhada pela ruptura da membrana celular. Isso provoca a liberação de proteínas citosólicas por difusão e, consequentemente, a perda da fluorescência da GFP.
Um modelo in vitro de AVC, o modelo OGD, é apresentado como um exemplo de neurotoxicidade 7,8,9. Este protocolo envolve a exposição dos neurônios primários a um tampão de sal semelhante a um líquido cefalorraquidiano artificial, mas privado de oxigênio e glicose. Embora esse modelo tenha sido apresentado como um exemplo de estresse neurotóxico, diferentes condições citotóxicas podem ser testadas com o mesmo fluxo de trabalho 8,9. Finalmente, a rotulagem esparsa permite facilmente o desenvolvimento de análises automatizadas de imagens. Aqui, um protocolo foi estabelecido com base na imunofluorescência padrão e na análise ImageJ em uma configuração menor. Em seguida, esse fluxo de trabalho foi adaptado e ampliado usando um sistema de imagem celular que permite uma análise automatizada em imagens ao vivo nos modos de médio e alto rendimento. Em conclusão, este artigo apresenta uma metodologia flexível, acessível e escalável para estudar a sobrevivência neuronal em diferentes modelos experimentais de toxicidade usando imagens ao vivo e quantificação automatizada.
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Protocolo
Todos os procedimentos que usam animais devem ser supervisionados pelo comitê bioético de animais do instituto e realizados em conformidade com os regulamentos locais. Os procedimentos aqui apresentados foram aprovados pela autoridade delegada e estão em conformidade com os regulamentos da Espanha e da Europa.
1. Cultura neuronal primária
NOTA: Todas as etapas são realizadas dentro da capela de cultura, utilizando materiais e soluções estéreis para manter as condições estéreis.
- Revestimento de poli-L-lisina (PLL)
- Lave as lamínulas (CVs, 15 mm) em etanol a 70% durante a noite (o/n) em um agitador orbital.
NOTA: A velocidade do agitador orbital deve ser suficiente para mover o CV suavemente, mas não muito rápido para evitar danificar ou arranhar os CVs. O RPM específico varia de acordo com o modelo do agitador. Os CVs podem ser armazenados em etanol por longos períodos (meses). - Retire o etanol e lave duas vezes com água deionizada por 10 min cada.
- Deixe os CVs secarem à temperatura ambiente (RT) em uma placa de Petri de 100 mm (13 CVs/placa aproximadamente). Certifique-se de que os CVs não se tocam uns nos outros ou nas bordas da placa.
NOTA: Os CVs secos podem ser armazenados no RT por longos períodos (meses). - Preparar a solução-mãe de PLL 5 mg/ml em água, fazer alíquotas e conservá-las a -20 °C. Dilua a solução estoque em 1x PBS até uma concentração de trabalho de 0,1 mg / mL.
NOTA: Concentrações mais altas de até 1 mg / mL PLL podem ser testadas. - Adicione o volume mínimo de PLL para cobrir a superfície dos VCs (consulte os volumes ideais de PLL na Tabela 1). Adicione a solução PLL gota a gota para facilitar a formação de uma gota.
NOTA: O plaqueamento de neurônios em CVs é necessário para a imunofluorescência. Para imagens de lapso de tempo (por exemplo, para a célula IN), as células são plaqueadas diretamente sobre o poço sem CVs porque os CVs podem se mover durante o lapso de tempo. Nesse caso, adicione o volume mínimo de PLL para cobrir a superfície de cada poço.
- Lave as lamínulas (CVs, 15 mm) em etanol a 70% durante a noite (o/n) em um agitador orbital.
| Superfície | Volume PLL (mL) |
| Lamínulas 15 mm | 0.2 |
| Lamínulas 13 mm | 0.18 |
| Placa de 96 poços | 0.07 |
| Placa de 24 poços | 0.3 |
| Placa de 6 poços | 2 |
| Placa de 60 mm | 4.5 |
Tabela 1: Volumes ideais de poli-L-lisina de acordo com a área de superfície.
- Incubar durante um mínimo de 1 h a 37 °C.
NOTA: O período de incubação pode ser tão longo quanto o / n. - Remova o PLL dos CVs. Lave os CVs duas vezes com água deionizada por 10 min cada. Deixe os CVs secarem em RT.
NOTA: A solução PLL pode ser armazenada a 4 °C para reutilização (máximo de 3 vezes). - Armazene os CVs secos dentro de uma placa de Petri a 4 °C (por até 7-10 dias) ou coloque-os dentro dos poços com meio de revestimento (consulte a composição na Tabela 2 e os volumes de trabalho na Tabela 3). Adicione o meio de revestimento diretamente aos poços das placas de 12 poços (Tabela 3).
NOTA: Os neurônios são muito sensíveis à qualidade do soro fetal bovino (FBS). Diferentes lotes de FBS devem ser testados para identificar o lote em que as células parecem mais saudáveis. Uma vez identificado um bom lote de FBS, recomenda-se obter uma grande quantidade e armazená-la a -80 °C. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de CVs e placas (veja os diferentes volumes de trabalho na Tabela 3).
| Meio de chapeamento | |||
| MEM | 42.5 | Ml | |
| 10% de soro de cavalo ou FBS* | 5 | Ml | |
| 30% de glicose (concentração final de 0,6%) | 1 | Ml | |
| PS (penicilina, 10000 U/mL; estreptomicina, 10 mg/mL); | 0.5 | Ml | |
| Meio de eletroporação | |||
| Opti-MEM | |||
| Meio Neuronal | |||
| Meio neurobasal | 48.5 | Ml | |
| B-27 | 1 | Ml | |
| Glutamax 200 mM | 0.125 | Ml | |
| PS (penicilina, 10000 U/mL; estreptomicina, 10 mg/mL); | 0.5 | Ml | |
| OGD Médio (Tasca, et al. 2014) | |||
| CaCl2 | 1 | milímetro | |
| Kcl | 5 | milímetro | |
| NaCl | 137 | milímetro | |
| KH2PO4 | 0.4 | milímetro | |
| Na2HPO4 | 0.3 | milímetro | |
| MgCl2 | 0.5 | milímetro | |
| MgSO4 | 0.4 | milímetro | |
| HEPES | 25 | milímetro | |
| NaHCO3 | 4 | milímetro | |
Tabela 2: Composição dos diferentes suportes utilizados.
| Área de superfície de poços e placas | Volume de trabalho | |||
| Placa de 96 poços | 0.32 | cm2 | 0.1 | Ml |
| Placa de 24 poços | 1.9 | cm2 | 0.5 | Ml |
| Placa de 12 poços | 3.8 | cm2 | 1 | Ml |
| Placa de 6 poços | 9.5 | cm2 | 2.5 | Ml |
| Placa de 60 mm | 21.5 | cm2 | 6 | Ml |
Tabela 3: Área de superfície dos diferentes tipos de placas e os volumes de trabalho.
- Preparação da cultura neuronal
- Pré-aqueça (37 ° C) e equilibre (em uma atmosfera de 5% de CO2 ) o meio de plaqueamento, o meio neuronal e o meio de eletroporação (ver composição na Tabela 2) em um frasco parcialmente aberto dentro da incubadora de células por um mínimo de 2 h. Deixe a tripsina aquecer em RT. Pré-aqueça a solução salina balanceada de Hank 1x (HBSS) a 37 ° C em banho-maria.
- Predefina os parâmetros de eletroporação (Tabela 4).
| CONDIÇÕES DE ELETROPORAÇÃO: Pulso de poragem | |||||
| Comprimento | V | Intervalo | N | D. Taxa | Polaridade |
| 2 ms | 175 | 50 | 2 | 10 | mais |
| CONDIÇÕES DE ELETROPORAÇÃO: Pulso de transferência | |||||
| Comprimento | V | Intervalo | N | D. Taxa | Polaridade |
| 50 | 20 | 50 | 5 | 40 | mais/menos |
Tabela 4: Configurações de eletroporação para NEPA21.
- Dissecção cerebral e coleta de camundongos CD-1 embryos em E15 pós-coito
- Sacrifique a fêmea grávida por luxação cervical sem sedação. Esterilizar a barriga com etanol 70%; Corte e abra o abdômen com uma tesoura afiada.
- Extraia o útero e coloque-o em uma placa de Petri com 1x HBSS frio. Deixe-o no gelo dentro da capa de cultura de células com uma pinça comum.
- Extraia um embrião do útero com o auxílio de uma pinça e tesoura e decapite-o com um único corte usando uma tesoura.
- Segure a cabeça e introduza uma pinça (por exemplo, pinça fina de Dumont) na órbita do olho.
- Usando a agulha (seringa de agulha 30 G) como lâmina, corte o bregma e rompa a parte posterior da cabeça.
- Introduza pinças afiadas através da incisão verticalmente na bregma e quebre a fina camada de pele da região anterior. Puxe a pinça para seguir a fissura longitudinal entre os dois hemisférios sem danificar o córtex.
- Use a pequena pinça em um ângulo de 45°, da parte anterior para a posterior, para remover o cérebro da cabeça.
- Mova o cérebro para uma placa de Petri de 3,5 cm com 1x HBSS gelado sob um estereomicroscópio.
- Dissecção de córtices
NOTA: O protocolo para cultura neuronal é adaptado do procedimento descrito por Dotti e Banker10.- Use a pinça Dumont (11 cm) para segurar o tálamo e uma agulha inclinada em um ângulo de 45° para separar o córtex de cada hemisfério do mesencéfalo. Certifique-se de que o córtex não apresente vestígios de outros tecidos; Use uma pinça afiada para remover as meninges.
NOTA: As meninges formam uma fina membrana elástica que envolve o cérebro e são facilmente reconhecidas por causa de sua cor vermelha. Fazer movimentos suaves em zigue-zague ajudará a remover as meninges. Certifique-se de que todas as meninges foram removidas, pois são tóxicas para a cultura. - Mova o córtex limpo para uma placa de Petri limpa de 3,5 cm com 1x HBSS gelado e coloque-o no gelo.
- Use a pinça Dumont (11 cm) para segurar o tálamo e uma agulha inclinada em um ângulo de 45° para separar o córtex de cada hemisfério do mesencéfalo. Certifique-se de que o córtex não apresente vestígios de outros tecidos; Use uma pinça afiada para remover as meninges.
- Desagregação
- Corte cada córtex em duas metades e use uma pinça ou uma agulha afiada (30 G) para facilitar o efeito da tripsina na próxima etapa.
- Transfira as peças para 7 mL de tampão tripsina-EDTA em temperatura ambiente em um tubo de 15 mL usando uma pipeta P1000 (corte 3-4 mm da ponta). Espere até que eles afundem na parte inferior da ponta antes de soltá-los da ponta da pipeta. Misture inclinando.
- Incubar a 37 °C durante 12 min em banho-maria. Misture inclinando a cada 4-5 min.
NOTA: O tempo de incubação pode variar de 12 a 15 min. - Deixe o tecido afundar por gravidade e remova cuidadosamente a tripsina. Lave o tecido duas vezes com 8 mL de 1x HBSS e agite suavemente inclinando. Remova o 1x HBSS cuidadosamente usando uma pipeta P1000, mas usando uma ponta de pipeta não cortada.
- Lave o lenço uma vez com 5 mL de meio de plaqueamento. Agite inclinando. Remova o meio de plaqueamento cuidadosamente usando uma pipeta P1000.
- Adicione 1,5 mL de meio de revestimento. Desagregar a mistura mecanicamente usando uma pipeta P1000, aspirando o meio do fundo do tubo e soltando-o suavemente sobre as paredes por no máximo 8 a 12 vezes.
- Filtrar através de um filtro de células estéreis (70 μm) colocado num tubo de 50 ml. Adicione 10 mL ou outro volume desejado de meio de revestimento ao tubo.
- Introduza 5 μL da suspensão celular na câmara de contagem de células, adicione 5 μL de azul de tripano (0,4% p / v) e conte as células.
- Plaquear as células (ver secção 1.6) transferindo um volume adequado da suspensão celular para ter o número desejado de células para eletroporação (por exemplo, 106 células) num tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugue as células a 250 × g por 5 min. Prossiga para a seção 1.6.
- Células de revestimento
- Plaquear a densidade desejada da suspensão de células não centrifugadas da etapa 1.5.7 em cada alvéolo contendo o meio de plaqueamento.
NOTA: Neste protocolo, 100.000 a 200.000 células/poço foram semeadas em uma placa de 12 poços. Como referência, coloque pelo menos 3 CVs por condição experimental para levar em conta a variabilidade experimental. Um cenário experimental típico pode envolver imagens de 4 a 5 campos por CV (por exemplo, usando uma objetiva de 20x, espera-se que cada campo tenha ~ 1,3 mm2 de largura). - Mova a placa na capa de cultura de células em todas as direções cardeais para distribuir as células uniformemente.
- Plaquear a densidade desejada da suspensão de células não centrifugadas da etapa 1.5.7 em cada alvéolo contendo o meio de plaqueamento.
- Eletroporação
NOTA: Outros sistemas de transfecção podem ser usados. O sistema NEPA21 usado neste protocolo tem a vantagem de ser um "sistema aberto". O protocolo pode ser modificado pelo usuário, e não requer reagentes específicos para a transfecção de cubetas especiais utilizadas para a eletroporação. Este protocolo foi modificado de 5.- Continue a partir da etapa 1.5.9. Ressuspenda o pellet celular com 5 mL de meio de eletroporação em um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 250 × g durante 5 min.
- Repita a etapa 1.7.1. Ressuspender com meio de eletroporação para obter uma concentração de 106 células/mL em cada uma das cubetas de eletroporação. Misture as células com a quantidade desejada de DNA na cubeta.
NOTA: Para a expressão de GFP, 3 μg de plasmídeo foram usados por milhão de células. Devido à alta variabilidade, recomenda-se testar a concentração ideal para cada plasmídeo. Entre 2 e 24 μg de plasmídeo por milhão de células foram testados. Diversos plasmídeos podem ser combinados na mesma cubeta para realizar uma dupla transfecção. No caso de co-transfecção, transfecte o gene de interesse em excesso em comparação com a GFP (por exemplo, 3: 1 é uma proporção ideal que deve ser testada) para garantir que a maioria das células que expressam GFP co-expresse o gene de interesse. - Coloque a cubeta na câmara da cubeta (Figura 2). Pressione o botão Iniciar para executar o programa predefinido (consulte as condições de eletroporação na Tabela 4). Registre os valores de correntes e joules exibidos no quadro Medidas .
NOTA: O usuário pode alterar condições específicas. Por exemplo, diminuir a voltagem pode reduzir a eficiência da transfecção, mas aumentar a sobrevivência neuronal. - Retire a cubeta da câmara. Adicione 500 μL do meio de plaqueamento na cubeta imediatamente após a eletroporação e transfira a amostra da cubeta para um tubo de centrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta.
NOTA: Quanto mais rápida a adição de meio, melhor a sobrevivência após a eletroporação, pois ajuda a evitar danos celulares. - Coloque o número desejado de células eletroporadas em cada poço.
NOTA: Placa de 20.000 a 100.000 células em uma placa de 12 poços. Dependendo das condições, apenas 5-10% das células eletroporadas podem sobreviver. O número exato deve ser testado e adaptado pelo usuário. - Incubar durante 2-4 h em condições normais (37 °C, 5% CO2, humidade saturada).
NOTA: Após o período de incubação, observe as células ao microscópio. Se a cultura for saudável, a maioria das células teria aderido à superfície e começado a brotar extensões visíveis de neuritos. - Mude o meio de revestimento para meio neuronal (volumes e composição na Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente).
- Manutenção de células
- Para refrescar o meio, remova metade do meio e adicione um volume igual de meio fresco pré-equilibrado após 7 dias de cultivo.
- No dia 10 de cultura, substitua metade do volume por meio neuronal fresco sem o suplemento de glutamina (consulte a Tabela de Materiais). Repita esta etapa a cada dois dias após o dia 10.
NOTA: Após 10 dias de cultivo, as células produzem glutamato por si mesmas.
2. Construção da câmara hipóxica
- Use qualquer recipiente hermético com tampa de rosca ou sistema de vedação equivalente para esse fim (Figura 3A). Faça dois furos na parede do recipiente de plástico e introduza um tubo de plástico em cada um. Sele-os com silicone para que o recipiente fique hermeticamente fechado (Figura 3).
NOTA: Aqui, um recipiente plástico cilíndrico (tamanho 1 litro) com tampa de rosca foi usado para construir a câmara. Certifique-se de que o contêiner seja grande o suficiente para acomodar os currículos necessários para o experimento. Para tratar mais CVs no mesmo espaço, as plataformas de plástico podem ser empilhadas umas sobre as outras (Figura 3A). - Para preparar a câmara borbulhante (ver ponto 3.2), fazer um furo na tampa de um balão, utilizando uma broca mecânica normal, com uma broca ligeiramente mais pequena que o tubo, e introduzir um tubo de plástico através do orifício no balão. Sele o orifício com parafilme para manter a vedação hermética (Figura 3B).
- Esterilizar o recipiente e o balão com etanol a 70% e irradiar com luz ultravioleta durante um ciclo antes de os utilizar.
3. Privação de oxigênio-glicose (OGD)
NOTA: O protocolo para OGD é adaptado de Tasca et al.7
- Preparar a solução de OGD com solução de fosfato (Tabela 2) previamente suplementada com antibióticos.
NOTA: Para cada placa de 35 mm, use 5 mL; para uma placa de 100 mm, use 10 mL. - Adicionar a solução de DGO no interior da câmara borbulhante (figura 3B) e colocá-la num banho-maria (já pré-aquecido a 37 °C). Ligar o balão à fonte de azoto (N2, 100%).
NOTA: Observe que, como a solução OGD contém HEPES como tampão, ela não requer CO2. Se a solução OGD for baseada em um sistema tampão de bicarbonato, use 5% de CO2 e 95% de N2 para saturar a solução hipóxica e a câmara. - Sature a solução de OGD com nitrogênio borbulhando suavemente. Deixe a solução em um estado levemente borbulhante por 20-30 min.
- Transferir imediatamente o balão para a capa de cultura de células e adicionar 5 ml da solução de OGD sem oxigénio em placas de 35 mm ou 10 ml em placas de cultura de 100 mm.
- Mova os CVs com as células cultivadas para as placas com OGD. Sem cobrir as placas, mova-as para a câmara de hipóxia e feche-as com firmeza, mas com cuidado.
NOTA: As etapas 3.4 e 3.5 devem ser concluídas o mais rápido possível. Manter os CVs de controle (Meio Neuronal em normóxia) nas placas de poço dentro da incubadora. Alternativamente, exponha os neurônios de controle ao meio OGD normóxico suplementado com glicose (10 mM) para examinar os efeitos da hipóxia e da privação de glicose de forma mais seletiva. - Conecte o sistema de nitrogênio à câmara de hipóxia e verifique se os tubos estão abertos. Sature a câmara com N2 por alguns minutos a uma pressão de 2-3 bar (por exemplo, 2-3 min; 1 bar = 750 mmHg) (Figura 3C).
NOTA: Não se esqueça de borbulhar a solução OGD novamente por 15 minutos entre vários pontos de tempo. - Reduza a pressão de nitrogênio para 1,3-1,5 bar e feche os dois tubos da câmara de hipóxia ( Figura 3C ). Deixe a câmara na incubadora pelo tempo necessário (por exemplo, 60 min) a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: A duração do OGD pode exigir ajustes dependendo da condição experimental e dos objetivos da pesquisa. Um curto tempo de incubação (por exemplo, 30 min) simularia hipóxia leve. Duas horas de OGD são geralmente muito duras para os neurônios. Recomenda-se que uma duração de OGD de 45 a 90 min seja testada antes de iniciar o estudo. Obviamente, a duração do OGD afetará a sobrevida total e o início relativo da morte neuronal após a recuperação do OGD. Se o objetivo é analisar a morte neuronal em tempo real, procure alcançar condições de OGD que provocariam a morte celular algumas horas após a recuperação da OGD para uma análise mais eficaz. - Abra a câmara e mova os CVs para sua placa multipoços original para recuperação. Após esta etapa, considere duas alternativas: 1) para experimentos em pequena escala, prossiga para a seção 4 para imunofluorescência e análise de imagem; 2) Para triagem de alto conteúdo, prossiga para a seção 5 para a análise no analisador de células (ou plataforma equivalente).
NOTA: A imagem ao vivo fornece uma abordagem mais flexível porque permite o monitoramento em tempo real dos diferentes pontos experimentais.
4. Análise por imunofluorescência padrão e ImageJ
NOTA: O tempo de recuperação pode variar de 1 a 24 h, dependendo das condições.
- Lave os neurônios com 1x PBS por 10 min.
NOTA: Esta etapa é opcional, pois existem várias maneiras de prosseguir e analisar as imagens. - Fixe os neurônios com paraformaldeído a 4% por 10 min em RT. Lave-os três vezes com 1x PBS por 10 min a cada lavagem.
NOTA: Como o paraformaldeído é tóxico, trabalhe sob uma capa química. - Permeabilize os neurônios adicionando 1x PBS contendo 0,1% de Triton X-100 por 10 min. Lave as células rapidamente com 1x PBS. Repita a etapa de lavagem duas vezes por 10 minutos a cada lavagem.
- Adicione 350 μL de solução de bloqueio (1x PBS contendo 2% de albumina de soro bovino) aos CVs e deixe-os por pelo menos 30 min. Girar o estoque de anticorpo primário (AB) (5 × g por 30 s) e misturá-lo com a solução de bloqueio na diluição necessária, por exemplo, anti-GFP a 1:600.
- Transfira as lamínulas para o parafilme em uma câmara umidificada (uma caixa com lenço de papel embebido em água para manter a umidade e evitar a evaporação). Dependendo do tamanho dos CVs, adicione cuidadosamente 60 ou 80 μL da diluição do anticorpo primário a cada CV e certifique-se de que as células estejam em contato com o anticorpo. Incubar os CV o/n a 4 °C.
NOTA: Uma gota deve ser formada na superfície CV para cobrir toda a superfície CV. Evite perturbar as células durante a pipetagem da solução de anticorpos nos CVs. O tempo de incubação pode ser reduzido para 2 h em RT.
- Transfira as lamínulas para o parafilme em uma câmara umidificada (uma caixa com lenço de papel embebido em água para manter a umidade e evitar a evaporação). Dependendo do tamanho dos CVs, adicione cuidadosamente 60 ou 80 μL da diluição do anticorpo primário a cada CV e certifique-se de que as células estejam em contato com o anticorpo. Incubar os CV o/n a 4 °C.
- Lave os CVs com 1x PBS por 10 min sobre o parafilme. Repita a etapa de lavagem duas vezes.
- Dilua o AB secundário, por exemplo, Alexa 488 (1:500) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:2.000) em solução de bloqueio. Dependendo do tamanho dos CVs, adicione uma gota de 60-80 μL da solução AB secundária nas células. Incube os CVs por 1 h no escuro em RT. Lave o AB secundário e o DAPI dos neurônios com 1x PBS por 10 min e repita esta etapa duas vezes.
- Monte os CVs em meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) para análise de imunofluorescência e armazene-os no escuro a 4 °C após a secagem.
- Captura e análise de imagens.
NOTA: Um microscópio invertido foi usado para tirar as imagens em 20x (Figura 4A, consulte a Tabela de Materiais).- Use o software ImageJ de código aberto para analisar as imagens e obter a máscara para o canal GFP (Figura 4C).
NOTA: Existem várias formas de imagem e análise dos neurônios, dependendo da disponibilidade do equipamento e do formato experimental. O fluxo de trabalho a seguir é fornecido como um exemplo básico em que o objetivo é identificar a soma de neurônios individuais que expressam GFP presentes na imagem. Os valores específicos apresentados aqui, como o valor limite e o tamanho das partículas, devem ser testados pelo usuário com base em suas condições experimentais específicas. Além disso, diferentes filtros e etapas de processamento podem ser adicionados. Por exemplo, os filtros ImageJ Subtrair fundo e Despeckle geralmente ajudam na limpeza da imagem no início do processamento. A otimização do fluxo de trabalho para condições experimentais específicas requer experiência prévia em análise de imagens e o conhecimento de conceitos básicos de análise quantitativa de imagens. Como um guia detalhado sobre análise de imagens está fora do escopo do protocolo atual, recomendamos os seguintes recursos: Guia do usuário do ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; Para exemplos e tutoriais, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; Pacote MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm. - Para segmentação, selecione a segmentação de intensidade com os parâmetros necessários para isolar o soma, que é a região mais brilhante dos neurônios.: Menu | Imagem | Ajustar | Limiar | Definir limite mínimo (por exemplo, 100) | clique em Aplicar.
- Repita o limite de 4.8.2. a todas as imagens para ver a máscara (ou seja, a imagem segmentada) para os somas dos neurônios (Figura 4E).
- Para obter o número de células sobreviventes em cada imagem e exportar os resultados para uma planilha para realizar cálculos, selecione Menu | Analisar | Analise as partículas e insira os valores de parâmetro necessários (por exemplo, Tamanho: 50 pixels infinitos; Circularidade: 0,5-1,00). Considere que em t = 0 h, o número de células contadas é o número total de células identificadas e calcule a porcentagem de células que sobreviveram nos diferentes pontos de tempo.
NOTA: Um limite de tamanho mais baixo é útil para filtrar objetos menores do que o soma (por exemplo, 60-80 μm2). - Use a função Gravar Macro do ImageJ para automatizar e repetir a análise: Menu | Plugins | Macros | Registro | clique em Criar para gerar a macro.
- Use o software ImageJ de código aberto para analisar as imagens e obter a máscara para o canal GFP (Figura 4C).
5. Análise em tempo real com o IN Cell Analyzer 2200
- Insira a placa de 12 poços no analisador de células, conecte o sistema de CO2 e ajuste a temperatura em 37 °C.
NOTA: Esta etapa pode ser facilmente ampliada nesta plataforma, realizando um experimento semelhante em neurônios revestidos em uma placa de 96 poços. - Selecione a objetiva de 20x, selecione aleatoriamente 5 campos por poço (cobrindo 2,33% do poço neste exemplo) e focalize-os automaticamente para cada canal de fluorescência (isotiocianato de fluoresceína [FITC] neste caso). Selecione os parâmetros de aquisição (lapso de tempo de 30 min por 16 h). Pressione Iniciar e aguarde.
NOTA: O número de campos de imagem deve ser determinado pelo investigador e deve ser suficiente para levar em conta a variabilidade dentro de um único poço. - Use o IN Cell Developertoolbox v1.9 para configurar o fluxo de trabalho apropriado para análise.
- Analise as imagens dos neurônios (canal FITC) para gerar uma máscara para o soma dos neurônios (Figura 4).
NOTA: O objetivo é identificar o soma de neurônios individuais presentes na imagem. Essa análise segue etapas equivalentes às descritas na seção 4 para ImageJ. Consulte a seção 4 para obter o fluxo de trabalho e considerações gerais. O limiar de intensidade é determinado para selecionar o soma, que é a região mais brilhante dos neurônios.- Para segmentação, selecione a segmentação de intensidade com os parâmetros necessários (nesse caso, um limite mínimo de 20005,40).
- Para pós-processamento, selecione a opção Peneira , mantendo os alvos com uma área maior que um valor predeterminado (aqui, 189 pixels (~80 μm2)).
- Selecione o parâmetro Soma para contar e somar todos os neurônios identificados na máscara (neurônios sobreviventes) para cada campo e para todos os campos de um poço em cada ponto do curso de tempo.
- Exporte os resultados para uma planilha. Em t = 0 h, considere que o número de células contadas é o total de células identificadas e calcule a porcentagem de células que sobreviveram nos diferentes pontos de tempo. Calcule o tempo em que 50% das células estão mortas para facilitar a comparação entre as condições.
NOTA: Os parâmetros para as etapas de segmentação e pós-processamento devem ser ajustados pelo usuário para diferentes canais fluorescentes, dependendo das estruturas a serem identificadas.
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Resultados
Este protocolo visa estabelecer um modelo in vitro de AVC. É importante obter uma densidade neuronal adequada, que permita o reconhecimento de neurônios eletroporados individuais para analisá-los individualmente. O estágio da cultura neuronal após o plaqueamento também é crucial. A maturação dos neurônios em cultura é progressiva. A dependência de fatores de crescimento, crescimento de neuritos, conectividade e atividade eletrofisiológica varia muito dependendo do estágio. Nessas condições específicas em 4-6 dia...
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Discussão
Este protocolo mostra uma maneira eficaz de modelar um AVC in vitro. Para atingir esse objetivo, propusemos a marcação esparsa de neurônios corticais usando o sistema de eletroporação NEPA215. Este é um sistema aberto que permite a personalização do protocolo com custo operacional mínimo em comparação com outros sistemas que empregam kits ou dispositivos específicos. A cultura mista de neurônios ingênuos e eletroporados permite mais flexibilidade e robust...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Carlos Dotti por compartilhar sua experiência em cultura neuronal. Agradecemos também a Alicia Martínez-Romero do Cytomics Core Facility do Centro de Investigación Principe Felipe (CIPF), que é apoiado pelo financiamento europeu FEDERER. O projeto é apoiado pelo Ministério da Economia e Competitividade da Espanha para (SAF2017-89020-R) reagentes, materiais e salários de YDC e PF. A PF também é apoiada pela bolsa RyC-2014-16410. CGN e PF são apoiados pela Conselleria de Sanitat da Generalitat Valenciana, bem como AGM (ACIF/2019/015). Ángela Rodríguez Prieto é apoiada pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha, com a bolsa PRE2018-083562.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri de 10 cm | FISHER SCIENTIFIC, S.L. | 1130-9283 | |
| Placas de Petri de 3,5 cm | Sterilin | ||
| 75 cm2 | frasco Corning | 430641U | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Placas de cultura de células | Corning incorporation Costar® | 3513 | |
| Thermo Electron Corporation | Modelo 371 | ||
| Filtro de células 70 µ m | Falcon | 352350 | |
| Luzes frias | Schott | 223488 | KL 1500 LCD |
| Lamínulas (15 mm) | Marienfeld | 111530 | |
| CU500 Câmara de cubeta | Nepa Gene | ||
| CU600 Suporte de suporte de cubeta | Nepa Gene | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich Quimica, S. L. | D9542-10MG | 1:2000 |
| DMSO | Panreac | A3672 | |
| Dumont Pinça Fina | FST | 11254-20 | |
| Dumont Pinça Fina | FST | 11252-00 | |
| EC-002S NEPA Cubetas de Eletroporação, 2mm gap | Nepa Filtro de Filtro Gene | ||
| Falcon | 352350 | ||
| Tesoura Fina-Afiada-Blunt | FST | 14028-10 | |
| Tesoura Fina-ToughCut r | FST | 14058-09 | |
| GFP frango IgY | Aves | Labs GFP-1010 | 1:600 |
| Glicose | Sigma | 68769-100ml | |
| GlutaMAX-I Suplemento 200 mM 100 mL | Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HBSS | Thermofisher | 14175-095 | https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html |
| Hepes 1 M | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Soro de cavalo | Invitrogen | 26050088 | |
| MEM | Thermofisher | 11095080 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080 |
| Lâmina de microscópio (polilisina) | VWR | 631-0107 | Dimensão: 25 x 75 x 1 mm |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich Quimica, S. L. | 81381-250G | |
| Agulhas amarelas, calibre 30 | BD Microlance™ 3 | 304000 | |
| NEPA21 eletroporador | Nepa Gene | ||
| Neubauer câmara | Blau Marca | 717805 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher | 21103-49 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Paraformaldeído (PFA), 95% | Sigma-Aldrich Quimica, S. L. | 158127-500G | Use a solução: 4% |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Plasmídeo para GFP | pCMV-GFP-ires-Cre, descrito em Fazzari et al., Nature, 2010 | ||
| Poli-L-Lisina | SIGMA | P2636 | |
| PS (Penicilina, Estreptomicina) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Pinça serrilhada | FST | 11152-10 | |
| Estereomicroscópio | WORLD PRECISION INSTRUMENTS | ||
| Seringas | BD Plastipak 1ml | 303176 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Quimica, S. L. | Número MDL: MFCD00128254 | |
| Tripsina-EDTA | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tubos 15 mL | Fisher | 05-539-4 | |
| Tubos 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Tupperware | - | - | Tupperware hermético com tampa de rosca. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. Qualquer Tupperware hermético equivalente pode ser comprado em qualquer supermercado. |
| Banho-maria | SHELDON LABORATORY MODEL 1224 | 1641951 |
Referências
- Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
- Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
- NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
- Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
- Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
- Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
- Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
- Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).
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Reimpressões e permissões
