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Artigo de método

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

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DOI:

10.3791/62761

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1 de julho de 2021

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1Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Integrated Imaging Program, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Cente, 5Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.

Resumo

A metástase, responsável por ~90% da mortalidade relacionada ao câncer, envolve a disseminação sistêmica de células cancerígenas de tumores primários para locais secundários, como osso, cérebro e pulmão. Embora amplamente estudados, os detalhes mecanicistas desse processo permanecem mal compreendidos. Enquanto as modalidades de imagem comum, incluindo tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM), oferecem diferentes graus de visualização bruta, cada uma carece da resolução temporal e espacial necessária para detectar a dinâmica das células tumorais individuais. Para lidar com isso, inúmeras técnicas foram descritas para imagens intravitais de locais metastáticos comuns. Desses locais, o pulmão tem se mostrado especialmente desafiador para o acesso a imagens intravitais devido à sua delicadeza e papel crítico na manutenção da vida. Embora várias abordagens tenham sido descritas anteriormente para imagens intravitais unicelulares do pulmão intacto, todas envolvem procedimentos altamente invasivos e terminais, limitando a duração máxima possível de imagem a 6-12 h. Descrita aqui é uma técnica aprimorada para a implantação permanente de uma janela óptica torácica minimamente invasiva para imagem de alta resolução do pulmão (WHRIL). Combinada com uma abordagem adaptada à microcartografia, a inovadora janela óptica facilita a imagem intravital serial do pulmão intacto em resolução unicelular em várias sessões de imagem e abrangendo várias semanas. Dada a duração sem precedentes do tempo sobre o qual os dados de imagem podem ser coletados, o WHRIL pode facilitar a descoberta acelerada dos mecanismos dinâmicos subjacentes à progressão metastática e numerosos processos biológicos adicionais dentro do pulmão.

Introdução

Responsável por ~90% das mortes, a metástase é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer1. Entre os principais locais de metástase clinicamente observada (osso, fígado, pulmão, cérebro)2, o pulmão tem se mostrado particularmente desafiador para a imagem in vivo via microscopia intravital. Isso porque o pulmão é um órgão delicado em movimento perpétuo. O movimento contínuo dos pulmões, ainda mais agravado pelo movimento cardíaco intratorácico, representa uma barreira substancial para a imagem precisa. Portanto, devido à sua relativa inacessibilidade às modalidades de imagem óptica intravital de alta resolução, o crescimento do câncer no pulmão tem sido muitas vezes considerado um processo oculto3.

No cenário clínico, tecnologias de imagem como tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM) permitem a visualização profunda em órgãos vitais intactos, como o pulmão4. No entanto, embora essas modalidades proporcionem excelentes visões do órgão bruto (muitas vezes até mesmo revelando patologia antes do início dos sintomas clínicos), elas são de resolução inadequada para detectar células tumorais disseminadas individualmente à medida que avançam através dos estágios iniciais da metástase. Consequentemente, quando as modalidades supracitadas fornecem qualquer indicação de metástase para o pulmão, os focos metastáticos já estão bem estabelecidos e proliferando. Uma vez que o microambiente tumoral desempenha um papel fundamental na progressão do câncer e na formação de metástase5,6, há grande interesse em investigar os primeiros passos da semeadura metastática in vivo. Esse interesse é ainda mais alimentado pelo aumento da valorização que as células cancerígenas disseminam antes mesmo do tumor primário ser detectado7,8 e as evidências crescentes de que elas sobrevivem como células únicas e em um estado adormecido por anos a décadas antes de crescer em macro-metástase9.

Anteriormente, a imagem do pulmão em resolução unicelular envolveu necessariamente preparações ex vivo ou explant10,11,12,13, limitando análises a pontos de tempo único. Embora essas preparações forneçam informações úteis, elas não fornecem qualquer visão sobre a dinâmica das células tumorais dentro do órgão conectadas a um sistema circulatório intacto.

Os recentes avanços tecnológicos na imagem permitiram a visualização intravital do pulmão intacto em resolução unicelular durante períodos de até 12 h14,15,16. Isso foi realizado em um modelo murino utilizando um protocolo que envolvia ventilação mecânica, ressecção da caixa torácica e imobilização pulmonar assistida a vácuo. No entanto, apesar de oferecer as primeiras imagens de resolução celular única do pulmão fisiologicamente intacto, a técnica é altamente invasiva e terminal, impedindo assim mais sessões de imagem além do procedimento de índice. Essa limitação, portanto, impede sua aplicação ao estudo de passos metastáticos que levam mais de 12h, como dormência e reinsício do crescimento14,15,16. Além disso, os padrões de comportamento celular observados usando essa abordagem de imagem devem ser interpretados com cautela, uma vez que os diferenciais de pressão induzidos pelo vácuo provavelmente causarão desvios no fluxo sanguíneo.

Para superar essas limitações, foi desenvolvida recentemente uma Janela minimamente invasiva para Imagem de Alta Resolução do Pulmão (WHRIL), facilitando a imagem serial durante um longo período de dias a semanas, sem a necessidade de ventilação mecânica17. A técnica envolve a criação de uma "caixa torácica transparente" com cavidade torácica selada para a preservação da função pulmonar normal. O procedimento é bem tolerado, permitindo que o mouse se recupere sem alteração significativa na atividade e função da linha de base. Para localização confiável exatamente da mesma região pulmonar em cada sessão de imagem respectiva, uma técnica conhecida como microcartografia foi aplicada nesta janela18. Através desta janela, foi possível capturar imagens de células quando elas chegam ao leito vascular do pulmão, cruzam o endotélio, passam por divisão celular e crescem em micrometástas.

Aqui, o estudo apresenta uma descrição detalhada de um protocolo cirúrgico aprimorado para implantação do WHRIL, que simplifica a cirurgia ao mesmo tempo em que aumenta sua reprodutibilidade e qualidade. Embora este protocolo tenha sido projetado para permitir a investigação dos processos dinâmicos subjacentes à metástase, a técnica pode ser aplicada alternativamente a investigações de inúmeros processos de biologia pulmonar e patologia.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo aprovação prévia pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.

1. Passivation of windows

  1. Enxágüe as molduras ópticas das janelas(Figura Suplementar 2) com uma solução de 1% (w/v) de detergente enzimaticamente ativo.
  2. Dentro de um frasco de vidro, submerse as janelas ópticas em 5% (w/v) solução de hidróxido de sódio por 30 min a 70 °C.
  3. Remova e lave as molduras da janela com água desionizada.
  4. Dentro de um novo frasco de vidro, submerga as molduras ópticas da janela em 7% (w/v) solução de ácido cítrico por 10 min a 55 °C.
  5. Novamente, remova e lave as molduras da janela com água desionizada.
  6. Repetir o passo 1.2; em seguida, remova e lave as molduras das janelas com água deionizada.

2. Preparação para cirurgia

  1. Faça a cirurgia em um capô ou armário de fluxo laminar. Para evitar a contaminação do campo operacional, garanta áreas distintas e separadas para preparação, cirurgia e recuperação, respectivamente.
  2. Antes da cirurgia, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave. Se os procedimentos subsequentes forem planejados, ressarem os instrumentos usando um esterilizador de contas quentes. Para este procedimento cirúrgico, é utilizada uma técnica somente para pontas.
  3. Potência no conta-cirurgia aquecida e esterilizador de contas.
  4. Anestesiar o rato com 5% de isoflurane na câmara de anestesia.
  5. Para remover o cabelo, aplique generosamente creme depilatório no local de incisão do peito superior esquerdo. Depois de não mais de 20 anos, limpe firmemente o cabelo e o creme depilatório usando papel de tecido umedecido. Repita conforme necessário para remover todos os cabelos do local cirúrgico.
  6. Usando sutura de seda 2-0, amarre um nó na base de um cateter de 22 G, deixando caudas de 2 polegadas de comprimento (ver Figura 1A).

3. Cirurgia na janela pulmonar

  1. Lave as mãos usando sabão antisséptico.
  2. Antes de cada nova cirurgia, não faça novas luvas estéreis.
  3. Para evitar a secagem da córnea e danos aos olhos do camundongo, aplique pomada oftalmica em ambos os olhos.
  4. Diluir 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina em 90 μL de PBS estéril e, em seguida, injetar subcutânea para garantir a analgesia pré-operatória.
  5. Entubar o rato com o cateter de seda amarrado 22 G15. Usando uma lâmpada de inflação, confirme a intubação bem sucedida ao notar o aumento bilateral do peito sobre o aperto da lâmpada.
  6. Fixar o cateter de intubação amarrando a sutura de seda 2-0 ao redor do focinho do rato (ver Figura 1B).
  7. Coloque o mouse sobre o suporte cirúrgico aquecido e posicione-o no decúbito lateral direito para expor o tórax esquerdo.
  8. Conecte o ventilador ao cateter de intubação.
  9. Certifique-se de ventilação controlada e estável no ventilador e, em seguida, reduza o isofluorano para 3%. No início do procedimento e periodicamente durante toda a duração do procedimento, avalie a adequação da anestesia realizando um teste de beliscão do dedo do pé.
  10. Utilizando fita adesiva, cranialmente e caudally fixar os membros dianteiros e traseiros, respectivamente, ao estágio cirúrgico aquecido. Coloque outro pedaço de fita ao longo do comprimento das costas do mouse para maximizar a exposição ao campo cirúrgico (ver Figura 1C).
  11. Abra todos os instrumentos cirúrgicos sob o capô para a preservação da esterilidade.
  12. Esterilize o local cirúrgico por uma generosa aplicação de antisséptico na pele do rato.
  13. Usando fórceps, levante a pele e faça uma incisão circular de ~10 mm, ~7 mm à esquerda do esterno e ~7 mm superior à margem subcostal(Figura 1D).
  14. Identifique cuidadosamente quaisquer naves principais. Se a divisão dos vasos for necessária, cauterize em ambas as extremidades com a caneta eletrocauteria para manter a hemostase.
  15. Extireta o tecido mole sobrevoando as costelas.
  16. Eleve acostela 6ou 7 com fórceps. Utilizando uma única lâmina da tesoura de micro-dissecação contundente, o lado arredondado em direção ao pulmão, perfura cuidadosamente o músculo intercostal entre ascostelas 6 e 7 para entrar no espaço intratorácico(Figura 1E).
  17. Descarga delicadamente de recipiente de ar comprimido no defeito para colapsar o pulmão e separá-lo da parede torácica. Dispare o ar comprimido em rajadas curtas para evitar lesões pulmonares iatrogênicas.
  18. Coloque o soco da biópsia sobre a ferramenta de corte(Figura Suplementar 1) e manoque cuidadosamente a base da ferramenta de corte através da incisão intercostal(Figura 1F).
  19. Oriente a base da ferramenta de corte de tal forma que seja paralela à parede do peito. Perfurar um orifício circular de 5 mm através da caixa torácica(Figura 1G).
    NOTA: Certifique-se de que o tecido pulmonar exposto é rosa, sem sinais de danos.
  20. Usando a sutura de seda 5-0, crie um ponto de corda de bolsa ~1 mm do orifício, circunferencialmente, entrelaçando com as costelas(Figura 1H).
  21. Posicione a estrutura da janela de tal forma que as bordas do defeito circular se alinhem dentro da ranhura da janela (ver Figura 1I).
  22. Bloqueie firmemente a janela implantada amarrando firmemente a sutura de seda 5-0.
  23. Carregue 100 μL de adesivo de gel cianoacrilato na seringa de 1 mL.
  24. Seque o pulmão aplicando um fluxo suave de ar comprimido para ~10-20 s(Figura 1J).
  25. Usando fórceps para segurar a estrutura da janela pela borda externa, levante suavemente para garantir a separação do pulmão da superfície inferior da estrutura da janela.
  26. Dispense uma fina camada de adesivo de cianoacrilato ao longo da superfície inferior do quadro óptico da janela(Figura 1K).
  27. Aumente a pressão final positiva (PEEP) no ventilador para inflar o pulmão.
  28. Segurando por 10-20 s, aplique pressão suave, mas firme para fixar a estrutura óptica da janela no tecido pulmonar(Figura 1L).
  29. Dispense uma gota de 5 mm do adesivo de gel cianoacrilato restante em um deslizamento de tampa retangular.
  30. Pegue a tampa de 5 mm usando captadores de vácuo. Mergulhe a superfície inferior da tampa no adesivo e, em seguida, raspe o excesso de adesivo três vezes contra o lado da mancha retangular, de talão de talão muito fina(Figura 1M).
  31. Posicione cuidadosamente a mancha de cobertura para caber dentro do recesso no centro da estrutura óptica da janela e é mantida acima do tecido pulmonar em um ângulo. Fixar brevemente o ventilador para gerar pressão positiva, hiper-inflando o pulmão. Usando um movimento rotativo, oriente a mancha de cobertura paralela ao tecido pulmonar para criar uma apposição direta entre a superfície do pulmão e a superfície inferior da mancha de cobertura. Mantenha a pressão suave, permitindo que o adesivo de cianoacrilato seja definido (~25 s).
  32. Use os fórceps para separar o deslizamento das captações de vácuo(Figura 1N).
  33. Usando sutura de seda 5-0, crie novamente um ponto de corda de bolsa, desta vez <1 mm circunferencialmente a partir da borda cortada da incisão da pele. Coloque qualquer excesso de pele sob a borda externa da moldura da janela antes de amarrá-la firmemente com nós de bloqueio.
  34. Para garantir um vedação a ar-apertado entre o deslizamento de tampa e a moldura da janela, dispense uma pequena quantidade de cianoacrilato líquido na interface metal-vidro (ver Figura 1O).
  35. Coloque uma agulha estéril em uma seringa de insulina de 1 mL. Insira a agulha abaixo do processo xifoide, avançando em direção ao ombro esquerdo, entrando na cavidade torácica através do diafragma. Puxe suavemente para trás na seringa para remover qualquer ar residual da cavidade torácica (ver Figura 1P).
  36. Remova a fita do mouse.
  37. Desligue isoflurane.
  38. Continue a ventilação com 100% de oxigênio até que o mouse pareça pronto para acordar.
  39. Corte cuidadosamente a sutura de seda 2-0 ao redor do focinho do rato e extuba o rato.
  40. Transfira o mouse para uma gaiola limpa e monitore até que esteja totalmente recuperado. Eutanize o rato se houver sinais de dificuldade em respirar.
  41. Forneça analgesia pós-operatória injetando subcutâneamente 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluída em 90 μL de solução tamponada fosfato estéril (PBS).

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Resultados

As etapas do procedimento cirúrgico descrito neste protocolo são resumidas e ilustradas na Figura 1. Resumidamente, antes da cirurgia, os camundongos são anestesiados e o cabelo sobre o tórax esquerdo é removido. Os camundongos são entubados e mecanicamente ventilados para permitir a sobrevivência após o rompimento da cavidade torácica. O tecido mole que sobrevoa as costelas é extirpado, e um pequeno defeito circular é criado, abrangendo ascostelas 6 e 7. O quadro óptic...

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Discussão

Em locais de metástase distante, como o pulmão, imagens ópticas de alta resolução fornecem uma visão da dinâmica elaborada da metástase celular tumoral. Ao permitir a visualização in vivo de células cancerígenas únicas e suas interações com o tecido hospedeiro, a imagem intravital de alta resolução tem se mostrado fundamental para entender os mecanismos subjacentes à metástase.

Descrito aqui é um protocolo cirúrgico melhorado para a implantação torácica permanente de uma janela óptica...

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Divulgações

Os autores não revelam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center e seu Programa Integrado de Imagem, e Jane A. e Myles P. Dempsey. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagem Analítica (AIF) da Faculdade de Medicina einstein pelo apoio à imagem.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução a 1% (p/v) de detergente ativo enzimáticoAlconox IncN/A  detergente aniônico concentrado com enzima protease para limpeza manual e ultrassônica
2 µ m microesferas fluorescentesInvitrogenF8827
lamínula de 5 mmMicroscopia Eletrônica Sciences72296-05
solução de hidróxido de sódio a 5% (p/v)Sigma-AldrichS8045
Isoflurano a 5%Henry Schein, Inc29405
Seda trançada 5-0 com agulha de corte RB-1Ethicon, Inc.774B
Solução de ácido cítrico a 7% (p/v)Sigma-Aldrich251275
Moldura de janela de aço inoxidável de 8 mmN/AN/AGravata de seda personalizada, Suplementar Figura 2
9 cm 2-0 Ethicon, Inc.LA55G
de 5 mmIntegra  33-35-SH
Tesoura de micro-dissecação sem corteRobozRS-5980
Suporte de ferramenta de janela de latãoN/AN/AFigura suplementar feita sob medida, Figura 3
BuprenorfinaHospira0409-2012-32
Caneta de cauterizaçãoBraintree ScientificGEM 5917
Gluconato de clorexidina  Becton, Dickinson and Company260100ChloraPrep Swabstick único 1.75 mL
Recipiente de ar comprimidoFalconDPSJB-12
Adesivo de cianoacrilatoAdesivos HenkelLOC1363589
Iluminador de fibra ópticaO.C. White CompanyFL3000
Esterilizador de contasCellPoint ScientificGER  5287-120VGerminador 500
pinças GraefeRobozRS-5135
Lâmpada de calor infravermelhoBraintree ScientificHL-1
Vaporizador Becton Dickinson329424
IsofluranoSurgiVetVCT302
Porta-agulha Jacobson com travaKalson SurgicalT1-140
Aplicadores de ponta de algodão longoMedline IndustriesMDS202055
NairChurch & Dwight Co., Inc.
Neomicina/polimixina B/bacitracinaJohnson & Johnson501373005pomada antibiótica Pomada
oftálmicaDechra Produtos Veterinários17033-211-38
Fita de papelFisher ScientificS68702
Ventilador murinoKent ScientificPS-02PhysioSuite
Vidro de cobertura retangularCorning2980-225
Suportede intubação de roedoresBraintree ScientificRIS 100
Bulbo de inflação de pulmão para pequenos animaisHarvard Apparatus72-9083
Ferramenta de corte de aço inoxidávelN/AN/AFeito sob medida, Suplementar Figura 1
Sulfametoxazol e antibiótico oral TrimetoprimHi-Tech Pharmacal Co.50383-823-16
Plataforma Cirúrgica Multifuncional SurgiSuite para Camundongos, com AquecimentoKent ScientificSURGI-M02Plataforma cirúrgica aquecida
Cateter traquealExelint International26746Cateter de 22 G
Sonda de metal com sistema de captação a vácuoTed Pella, Inc.Rolamento 528-112
Punção de biópsia descartável Seringas de insulina 40002957

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