Otimizando a configuração e as condições do eletrorretinograma ex vivo para estudar a função da retina em olhos pequenos e grandes

Resumo

A modificação do equipamento de matriz de multieletrodos ou patch clamp existente torna o eletrorretinograma ex vivo mais amplamente acessível. Métodos aprimorados para registrar e manter respostas à luz ex vivo facilitam o estudo da função fotorreceptora e das células ON-bipolar na retina saudável, modelos animais de doenças oculares e retinas de doadores humanos.

Resumo

As medições das respostas à luz neuronal da retina são críticas para investigar a fisiologia da retina saudável, determinar alterações patológicas em doenças da retina e testar intervenções terapêuticas. O eletrorretinograma ex vivo (ERG) permite a quantificação de contribuições de tipos celulares individuais na retina isolada por adição de agentes farmacológicos específicos e avaliação de alterações tecidual intrínsecas independentemente de influências sistêmicas. As respostas à luz da retina podem ser medidas usando um suporte de amostra ERG ex vivo especializado e uma configuração de gravação, modificada a partir do equipamento existente de patch clamp ou microeletrodos. Particularmente, o estudo das células ON-bipolares, mas também dos fotorreceptores, tem sido dificultado pelo declínio lento, mas progressivo, das respostas à luz no ERG ex vivo ao longo do tempo. O aumento da velocidade de perfusão e o ajuste da temperatura do perfusato melhoram a função retiniana ex vivo e maximizam a amplitude e a estabilidade da resposta. O ERG ex vivo permite exclusivamente o estudo de tipos individuais de células neuronais da retina. Além disso, melhorias para maximizar as amplitudes de resposta e a estabilidade permitem a investigação de respostas luminosas em amostras de retina de animais de grande porte, bem como em olhos de doadores humanos, tornando o ERG ex vivo uma adição valiosa ao repertório de técnicas utilizadas para investigar a função retiniana.

Introdução

A eletrorretinografia mede a função retiniana em resposta à luz¹. É essencial para estudar a fisiologia e fisiopatologia da retina e medir o sucesso das terapias para doenças da retina. O ERG in vivo é amplamente utilizado para avaliar a função retiniana em organismos intactos, mas apresenta limitações significativas ^2,3. Dentre estes, a análise quantitativa de tipos individuais de células da retina no ERG in vivo é dificultada, uma vez que registra a soma das possíveis alterações e, portanto, sobrepondo as respostas, de todas as células da retina aos estímulos luminosos⁴. Além disso, não permite prontamente a adição de drogas à retina, é vulnerável a influências sistêmicas e tem uma relação sinal-ruído relativamente baixa. Essas desvantagens são eliminadas no ERG ex vivo que investiga a função da retina isolada 2,3,5,6. O ERG ex vivo permite o registro de respostas grandes e estáveis de tipos específicos de células da retina por adição de inibidores farmacológicos e fácil avaliação de agentes terapêuticos, que podem ser adicionados ao superfusato. Ao mesmo tempo, remove influências de efeitos sistêmicos e elimina o ruído fisiológico (por exemplo, batimentos cardíacos ou respiração).

No ERG ex vivo, as retinas ou amostras de retina são isoladas e montadas do lado fotorreceptor na cúpula do suporte do espécime ^3,5. O suporte da amostra é montado, conectado a um sistema de perfusão que fornece à retina meios aquecidos e oxigenados e colocado no palco de um microscópio, que foi modificado para fornecer estímulos de luz controlados por computador. Para registrar as respostas provocadas pela luz, o suporte do espécime é conectado a um amplificador, digitalizador e sistema de gravação (Figura 1). Esta técnica permite o isolamento de respostas de fotorreceptores de bastonetes e cones, células ON-bipolares e glia de Müller, alterando os parâmetros dos estímulos de luz e adicionando agentes farmacológicos.

Uma configuração existente de patch clamp ou multi-electrode array (MEA) pode ser convertida para registrar ERG ex vivo, em conjunto com um adaptador ERG ex vivo comercialmente disponível ou um suporte de amostra usinado por controle numérico computadorizado (CNC) de policarbonato personalizado, para medir as respostas à luz em retinas de pequenos modelos animais, como camundongos. Esta modificação aumenta a acessibilidade do ERG ex vivo, minimizando a necessidade de equipamentos especializados. O desenho do suporte do corpo de prova simplifica a técnica de montagem e integra eletrodos, eliminando a necessidade de manipulação de microeletrodos em comparação com os métodos ERG transretinais ex vivo relatados anteriormente⁷. A taxa de perfusão e a temperatura dentro do suporte da amostra são fatores importantes que afetam as propriedades de resposta dos fotorreceptores e das células ON-bipolares. Ao ajustar essas condições, o ERG ex vivo pode ser registrado de forma confiável a partir da retina isolada do camundongo por períodos prolongados de tempo. Condições experimentais otimizadas permitem registros ex vivo de ERG em socos de retina de retinas maiores, incluindo olhos de animais de grande porte e olhos de doadores humanos⁸.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram conduzidos de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Estudos em Animais da Universidade de Utah. Olhos de porco para demonstração deste vídeo foram obtidos post-mortem do matadouro (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Os olhos foram obtidos de doadores humanos após morte cerebral ou cardíaca com consentimento para uso em pesquisa através do Utah Lions Eye Bank, do San Diego Eye Bank ou Lifesharing, que são totalmente credenciados pela FDA, pela Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) e pela Eye Banks of America Association. O uso de olhos de doadores humanos teve status de isenção na Universidade de Utah (IRB no. 00106658) e ScrippsHealth IRB (IRB no. 16-6781).

1. Criação do ERG ex vivo

1. Para converter uma configuração de matriz de vários eletrodos, conecte o suporte de amostra ERG ex vivo através de um estágio principal a um amplificador diferencial, que é conectado à entrada analógica da placa de interface do sistema de matriz de multieletrodos. Use o software de gravação para a matriz de vários eletrodos para gravar e armazenar os dados de entrada do ERG ex vivo. Defina o ganho do amplificador diferencial para 100 e adicione uma amplificação de tensão adicional de 10x , dependendo das especificações do digitalizador. Defina o filtro passa-baixas para 100 Hz.
2. Para converter uma configuração de braçadeira de patch, conecte o suporte de amostra ERG ex vivo através de um estágio de cabeça a um amplificador diferencial, que é conectado ao estágio principal do amplificador de grampo de patch. Use o software e o digitalizador do sistema de grampo de patch para registrar e armazenar os dados de entrada do ERG ex vivo. Ajuste o ganho do amplificador diferencial para 100 e aplique uma amplificação de tensão adicional de 10x através do estágio de cabeça da braçadeira de patch. Defina o filtro passa-baixas para 100 Hz.
3. Conecte os LEDs com os comprimentos de onda apropriados (por exemplo, aproximadamente 530 nm para provocar fotorreceptores de haste e respostas de células ON-bipolares) ao microscópio. Controle os LEDs com um software de gravação que permite o acionamento de estímulos de luz. Para controlar os estímulos de luz, use um driver de LED controlado por saídas analógicas de um digitalizador.
4. Calibre a saída de luz dos LEDs na posição da retina no suporte da amostra usando um fotodiodo. Se necessário, insira filtros de densidade neutra no caminho da luz para diminuir a intensidade da luz.
5. Use um suporte de espécime ERG ex vivo comercialmente disponível ou personalizado.
   NOTA: Desenhos para usinagem CNC a partir de policarbonato podem ser obtidos dos autores mediante solicitação.
6. Para preparar o eletrodo, insira um eletrodo de pellet Ag/AgCl em um conector luer roscado. Preencha o interior do conector luer com cola quente e insira um soquete de 2 mm na cola quente do lado não roscado. Solde um fio de prata do eletrodo EP1 ao soquete de 2 mm. Parafusar o eléctrodo acabado, com um o-ring na rosca, nas portas do eléctrodo do suporte da amostra ERG ex vivo.
   NOTA: Os eletrodos podem ser usados por um longo tempo. Se a superfície do pellet acumular sujeira e/ou escurecer (isso pode causar alta tensão de deslocamento e/ou desvio elétrico), ela pode ser "polida" usando lixa fina.
7. Pelo menos 1 dia antes da experimentação, cole papéis de filtro nas cúpulas do suporte de amostra ERG ex vivo usando cola epóxi, garantindo que a cola não obstrua o canal do eletrodo (ver ³ para vídeo).

2. Preparação animal

1. Animais escuros adaptam por pelo menos 6 h ou durante a noite.

3. Preparação do equipamento

1. Preencha a linha de perfusão do ERG ex vivo com o meio de Ames borbulhado com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. Ligue a linha de perfusão a um elemento de aquecimento com uma fonte de corrente CC ou um controlador de calor perto do suporte da amostra para aquecer o meio de Ames, de modo a que a retina seja mantida a aproximadamente 35-38 °C.
2. Encha ambas as metades do suporte da amostra ERG ex vivo com solução de eléctrodo, sele a linha de perfusão com rolhas luer, ligue os eléctrodos e monte o suporte da amostra com quatro parafusos (ver ^{vídeo 3}).
3. Verifique a resistência e a tensão de deslocamento entre os eletrodos no suporte da amostra montada inserindo as sondas do multímetro nos eletrodos.
   NOTA: Se não houver bloqueios e os eletrodos estiverem em boas condições, a resistência deve ser inferior a 100 kΩ e a tensão de deslocamento inferior a 5 mV.
4. Conecte o suporte do espécime montado à linha de perfusão e coloque no palco de um microscópio configurado para fornecer flashes de luz. Certifique-se de que o suporte da amostra e a linha de perfusão não contêm bolhas de ar.

4. Preparação de tecidos

1. Sacrificar o animal com CO₂ e enuclear imediatamente os olhos, ou obter grandes olhos de doadores animais ou humanos.
2. Limpe o globo do tecido conjuntivo restante e dos músculos extraoculares. Corte o nervo óptico.
3. Em papel de filtro, coloque cuidadosamente uma pequena incisão com uma lâmina de barbear ao longo da ora serrata, a aproximadamente 1 mm do limbo no olho do rato. Insira uma tesoura fina de vannas na incisão e corte ao longo do limbo para remover a porção anterior do olho com a lente.
4. Mova o copo para os olhos em um prato contendo o meio de Ames. Segure a esclera com fórceps fina, tomando cuidado para não tocar na retina. Insira a tesoura vannas entre a retina e a esclera e corte a esclera da parte periférica em direção à parte central. Tome cuidado para não tocar ou danificar a retina.
5. Imobilize a esclera segurando um lado da incisão com uma tesoura vannas contra o fundo do prato de dissecção. Segure a esclera com fórceps do outro lado da incisão. Remova a esclera sem tocar ou danificar a retina, separando a esclera em ambos os lados da incisão para permitir o isolamento da retina com danos mínimos ao tecido.
6. Remova o segmento anterior com a lente do olho e armazene o copo do olho à temperatura ambiente na solução de Ames borbulhada com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.
   NOTA: As respostas funcionais à luz dos olhos armazenados desta forma podem ser obtidas durante várias horas.
7. Em olhos grandes, incluindo olhos de doadores humanos, limpe o globo do tecido conjuntivo restante e remova o segmento anterior e a lente, de forma semelhante ao procedimento descrito para o olho do rato. Use um bisturi para fazer um corte a aproximadamente 3 mm do limbo. Insira uma tesoura de dissecção curva na incisão e corte ao longo do limbo para remover a porção anterior do olho com a lente. Obter amostras de retina para eletrorretinografia ex vivo com um punch de biópsia descartável de 3-6 mm.

5. Montagem do tecido no suporte do provete

1. Coloque a metade inferior do suporte do espécime em uma placa de Petri grande e preencha com o meio oxigenado de Ames para que a cúpula do suporte do espécime fique apenas submersa.
2. Agarre cuidadosamente a borda da retina com pinça fina e transfira a retina para a cúpula do suporte da amostra ex vivo , o lado do fotorreceptor voltado para cima.
3. Levante o suporte da amostra da solução de Ames, tomando cuidado para que a retina permaneça no lugar.
4. Seque completamente a placa do suporte da amostra para minimizar o ruído, o crosstalk elétrico e o desvio de sinal.
5. Monte ambas as metades do suporte do corpo de prova com quatro parafusos e conecte a linha de perfusão. Secar o eléctrodo na metade inferior do suporte da amostra e ligar o cabo do ânodo ao lado interno da retina e o cabo do cátodo ao lado do fotorreceptor.
6. Perfundir o suporte do espécime com pelo menos 1 mL/min de meio oxigenado de Ames por 10-20 min para dar tempo para que as respostas à luz se estabilizem.

6. Gravação da função das células neuronais da retina

1. Registre as famílias de resposta expondo a retina a flashes de luz de intensidade crescente. Por exemplo, registre famílias de resposta fotorreceptora de bastonetes de camundongos com intensidades de luz variando de aproximadamente 10 a 1.000 fótons/μm 2 e aquelas de células ON-bipolares de camundongos com intensidades de luz variando de aproximadamente 0,6 a 20 fótons/μm².
2. Medir as respostas de luz fotorreceptora (onda a) na presença de cloreto de bário de 100 μM, que bloqueia os canais de potássio nas células gliais de Müller, e DL-AP4 de 40 μM, que bloqueia a transmissão do sinal glutamatérgico para as células ON-bipolares (Figura 2B).
3. Para isolar a onda b, que se origina da função das células ON-bipolares, primeiro registre as respostas combinadas à luz de células fotorreceptoras e ON-bipolares na presença de cloreto de bário isolado (Figura 2A). Em seguida, perfundir por 5-10 min com o meio de Ames contendo cloreto de bário, bem como DL-AP4, e registrar as respostas fotorreceptoras aos mesmos estímulos de luz de antes (Figura 2B). Subtraia as respostas fotorreceptoras das respostas combinadas das células fotorreceptoras e ON-bipolares, calculando-se assim apenas as respostas à luz das células ON-bipolar (Figura 2C).

7. Otimizando a função celular ON-bipolar

NOTA: A onda b, que se origina das células ON-bipolares, é altamente sensível à temperatura no suporte da amostra e à taxa de perfusão.

1. Mantenha uma taxa de perfusão de pelo menos 0,5 mL/min para obter a onda b.
   NOTA: Uma taxa de perfusão mais elevada de 1-2 ml/min é preferível para manter uma resposta grande e estável das células ON-bipolares.
2. Certifique-se de que, para uma determinada taxa de perfusão, a temperatura no suporte da amostra perto da retina esteja próxima da temperatura corporal (ou seja, aproximadamente 35-38 °C).
   NOTA: É importante ajustar a temperatura do perfusato, que é aquecido antes de atingir o suporte da amostra ERG ex vivo , de modo que esteja dentro da faixa de temperatura ideal na retina.
3. Armazene copos oculares para experimentação posterior protegidos da luz e em meio oxigenado de Ames à temperatura ambiente para manter as ondas a e b normais por várias horas.

Resultados

Ex vivo O ERG permite o registro de fotorreceptores reprodutíveis e estáveis e respostas de luz de células ON-bipolares, por exemplo, da retina do camundongo (Figura 2A-C). O registro das respostas fotorreceptoras das retinas dos doadores humanos é possível com até 5 h de atraso post-mortem da enucleação (Figura 2D) e das respostas das células ON-bipolares com um atraso de enucleação de <20 min (...

Discussão

Originalmente desenvolvido em 1865 por Holmgren para medir as respostas de luz da retina a partir da retina do anfíbio¹⁰, restrições técnicas inicialmente impediram que o ERG fosse amplamente utilizado. No entanto, estudos seminais de Ragnar Granit e outros identificaram as origens celulares do ERG e mediram as respostas fotorreceptoras e celulares ON-bipolar ex vivo^11,12,13. Desde então, métodos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soquete de 2 mm	WPI	2026-10	materiais para preparar eletrodo
Ag/AgCl Eletrodo	World Precision Instruments	EP1	materiais para preparar eletrodo
Meio Ames	Sigma Aldrich	A1420	meio de perfusão
cloreto de bário	Sigma Aldrich	B0750	bloqueador de canais de potássio
DL-AP4	Tocris	0101	antagonista glutamatérgico de amplo espectro
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG suporte de amostra
Conector luer rosqueado	McMaster-Carr	51525K222 ou 51525K223	materiais para preparar eletrodo