Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Resumo

A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.

Resumo

A identificação de patógenos bacterianos emergentes é fundamental para a saúde e segurança humana. A adesão bacteriana às células hospedeiras é um passo essencial em infecções bacterianas e constitui uma marca de ameaça potencial. Portanto, examinar a adesão de bactérias às células hospedeiras pode ser usado como um componente da avaliação de ameaças bacterianas. Um método padrão para enumerar a adesão bacteriana às células hospedeiras é co-incubar bactérias com células hospedeiras, colher as bactérias aderentes, emplacar as células colhidas em meios sólidos e, em seguida, contar as unidades de formação de colônias resultantes (UFC). Alternativamente, a adesão bacteriana às células hospedeiras pode ser avaliada usando abordagens baseadas em microscopia de imunofluorescência. No entanto, as estratégias convencionais para a implementação dessas abordagens são demoradas e ineficientes. Aqui, um método de imagem baseado em microscopia de fluorescência automatizada recentemente desenvolvido é descrito. Quando combinado com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística, o método permite quantificação rápida de bactérias que aderem às células hospedeiras. Duas espécies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa gram-negativa e monocytogenes listeria gram-positiva e controles negativos correspondentes, foram testadas para demonstrar o protocolo. Os resultados mostram que essa abordagem enumera de forma rápida e precisa as bactérias aderentes e reduz significativamente as cargas de trabalho experimentais e cronogramas.

Introdução

A adesão bacteriana é um processo pelo qual as bactérias se ligam a outras células ou superfícies. O estabelecimento bem-sucedido de infecção por patógenos bacterianos requer adesão às células hospedeiras, colonização de tecidos e, em alguns casos, invasão de células hospedeiras^1,2,3. As doenças infecciosas emergentes constituem grandes ameaças à saúde pública, como evidenciado pela recente pandemia COVID-19^4,5,6. É importante ressaltar que patógenos novos ou emergentes podem não ser facilmente discernidos usando abordagens genômicas, especialmente nos casos em que o patógeno foi projetado para escapar da detecção ou não contém assinaturas genômicas que o identificam como patogênico. Portanto, a identificação de potenciais patógenos utilizando métodos que avaliam diretamente marcas de patogenicidade, como a adesão bacteriana às células hospedeiras, pode desempenhar um papel crítico na identificação de patógenos.

A adesão bacteriana às células hospedeiras tem sido usada para avaliar mecanismos de patogênese bacteriana há décadas^1,7. A imagem microscópica^8,9 e a enumeração da unidade formadora de colônias bacterianas (UFC)^10,11,12,13 por revestimento pós-infecção são dois métodos laboratoriais bem desenvolvidos para testar a adesão microbiana e/ou infecção das células hospedeiras¹⁴. Considerando o tamanho da escala de micrômetros das células bacterianas, a enumeração das células bacterianas aderentes geralmente requer o uso de técnicas avançadas de microscopia de alta ampliação, bem como abordagens de imagem de alta resolução, incluindo microscopia eletrônica, microscopia de expansão (ExM)^15,16e imagem tridimensional¹⁷ . Alternativamente, a enumeração de bactérias vinculadas ou internalizadas dentro das células hospedeiras pode ser realizada emplacando a série de diluição de bactérias colhidas em ágar sólido e contando as CFUs resultantes^10,12,13. Este método é trabalhoso e inclui muitas etapas manuais, o que introduz dificuldades no estabelecimento de um procedimento padronizado ou automatizado necessário para análises de alto rendimento^18,19. Portanto, o desenvolvimento de novos métodos para avaliar o anexo de células hospedeiras abordaria as limitações atuais no campo.

Um desses métodos é descrito aqui que utiliza microscopia automatizada de alto rendimento, combinada com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística. Para demonstrar a abordagem, foram realizados experimentos com diversos patógenos bacterianos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista de humanos, animais e plantas^14,20, que é frequentemente encontrado para colonizar o trato respiratório de pacientes com funções de defesa hospedeiras prejudicadas. Essa abordagem otimou o processo de imagem microscópica descrito em estudos anteriores^14,20. A detecção de imagens foi simplificada por células hospedeiras e bactérias rotuladas por fluorescência para rastrear rapidamente a proximidade delas, o que reduziu drasticamente a carga de trabalho de microscopia para obter imagens de alta resolução para distinguir bactérias. Além disso, a análise estatística automatizada de imagens na contagem de células hospedeiras e bactérias substituiu o experimento manual de revestimento de CFU bacteriano para estimar a razão da contagem bacteriana aderente por célula hospedeira. Para confirmar a compatibilidade deste método, também foram testadas múltiplas cepas bacterianas e tipos de células hospedeiras, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, bem como células endotelias de veia umbilicais humanas (HUVECs), e os resultados apoiam a diversidade e eficácia do método.

Protocolo

1. Cultura celular A549

1. Mantenha a linha celular A549 em meio F-12K suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e incubar a 37 °C, 5% DE CO₂.
2. Mude o meio a cada 3-4 dias e passagem em 85%-95% de confluência.
3. Brevemente, enxágue as células com 1 x soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS, pH 7.4, a menos que indicado de outra forma) e trate com 1 ml de 0,25% trypsin-0,53 mM solução de ácido ethylenodiaminatotracético (EDTA) (submergir a camada celular) por cerca de 2 min a 37 °C.
4. Adicione 6 mL adicionais de meio de crescimento completo (meio F-12K + 10% FBS) para interromper a atividade de protease. Em seguida, plaque as células em um frasco de cultura tecidual estéril T-75 a uma proporção de subcultivação de 1:3-1:8. O volume final da cultura é de 12 mL.
5. Semente aproximadamente 1 x 10⁴ células A549 (concentração celular: ~1 x 10⁵ células/mL) em cada poço de uma placa de 96 poços um dia antes dos ensaios de adesão.

2. Crescimento bacteriano e coloração

1. Realize todos os trabalhos bacterianos em um gabinete de biossegurança, laboratório de Biossegurança Nível 2.
2. Inocular todas as culturas bacterianas, incluindo P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes, e B. subtilis, etc., do estoque de glicerol congelado e cultivá-los em Broto de Soja Tripptic (TSB, 3 mL) em uma incubadora de tremor a 37 °C durante a noite mantida a 250 rpm.
3. No dia seguinte, use uma diluição de 1:100 da cultura da noite para inocular uma subcultura e cultuá-las em TSB (1 mL) por 3h à fase exponencial, medir o OD em 600 nm (OD₆₀₀) para confirmar. Certifique-se de que o OD₆₀₀ está na faixa de 0,4-0.6.
4. Antes de realizar o ensaio de adesão do hospedeiro de bactérias, as diluições em série de placas de suspensão bacteriana em placas de ágar TSB, incubam-nas durante a noite a 37 °C e, em seguida, estabelecem as CFUs bacterianas do número de colônias. Para P. aeruginosa, um OD₆₀₀ de 1,0 corresponde a 2 x 10⁸ células bacterianas viáveis/mL, e para L. monocytogenes,um OD₆₀₀ de 1,0 corresponde a 9 x 10⁸ células bacterianas viáveis/mL.
5. Colher as culturas bacterianas em fase exponencial por centrifugação a 13.000 x g por 2 min a temperatura ambiente (RT), depois lave-as uma vez usando 1x PBS (1 mL). Resuspenda as pelotas bacterianas em 1 mL de 1x PBS e determine as concentrações medindo OD₆₀₀ de suspensões bacterianas. Por exemplo, P. aeruginosa com OD₆₀₀ de 0,5 representa uma concentração de 1 x 10⁸ células bacterianas/mL.
6. Manche a suspensão bacteriana usando um corante verde ou vermelho fluorescente em RT por 30 minutos com rotação suave no escuro. Para isso, adicione 2 μL do corante concentrado de coloração de estoque concentrado de 500 vezes em 1 mL de suspensão bacteriana para diluir o corante 1 vezes. Para lavar o corante de coloração, centrifugar as bactérias manchadas a 13.000 x g por 2 min e resuspensar a pelota em 1 mL de 1x PBS por três vezes.
   NOTA: Se as bactérias marcadas pela fluorescência (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) forem usadas no experimento, pule esta etapa de coloração bacteriana. GFP-tagged P. aeruginosa e vermelho fluorescente corante manchado L. monocytogenes foram usados neste protocolo.
7. Coletar as células bacterianas manchadas ou bactérias marcadas por GFP por centrifugação a 13.000 x g por 2 min. Resuspenque em médio F-12K fresco (1 mL) e meça o OD₆₀₀ de cada cultura. Posteriormente diluir as culturas às concentrações desejadas com base na multiplicidade de infecção (MOI) e concentração de células hospedeiras. O volume final utilizado neste experimento é de 500 μL.
   NOTA: Por exemplo, se a concentração de células hospedeiras contada usando a coloração do Trypan Blue for de 1 x 10⁵ células/mL, a concentração desejada de células bacterianas em um MOI de 100 será de 1 x 10⁷ células/mL. Concentração de P. aeruginosa a 0,5 OD₆₀₀ é 1 x 10⁸/mL. Para obter a concentração desejada, diluir a cultura P. aeruginosa 10 vezes, adicionar 50 μL de cultura resuspended a 450 μL de médio F-12K fresco.

3. Adesão bacteriana e coloração de células hospedeiras

1. Primeiro, lave as monocamadas celulares A549 semeadas três vezes com pbs 1x quente. Para cada lavagem, adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço, delicadamente pipeta para cima e para baixo três vezes, descarte 1x PBS ou espere por 10 s após a adição e, em seguida, aspirar para remover 1x PBS. Para determinar a cinética da associação bacteriana, sobreponha as células com 100 μL de concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes MEIs (0, 1, 10 e 100). Gire as bactérias a 200 x g por 10 minutos e incuba as células A549 infectadas a 37 °C, 5% de CO₂ por mais 1h.
   NOTA: Neste experimento, cada condição tinha um triplicado técnico.
2. Remova as bactérias desvinculadas lavando as monocamadas cinco vezes com 1x de PBS quente, conforme descrito acima. Adicione 100 μL de 4% de formaldeído (em 1x PBS) em cada poço das placas de 96 poços para fixar as células. Deixe as placas sentarem no gelo por 15 minutos e depois lave a solução de fixação usando 1x PBS três vezes.
3. Para colori-los, adicione 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e incuba-o por 10 min na RT. Após a incubação, lave os poços três vezes usando 1x PBS. Cubra as células A549 infectadas com 100 μL de PBS 1x para evitar a secagem. Processe para a próxima etapa ou armazene a placa a 4 °C por até 2 dias no escuro.

4. Imagem, processamento e análise automatizadas de fluorescência

1. Para manter a integridade dos dados, escolha aleatoriamente e manualmente cinco locais de cada poço para capturar as imagens com ampliação de 20x. Capture as imagens fluorescentes de células A549 e bactérias sob canais DAPI e GFP, respectivamente. Use o canal PE-Cy5 para as bactérias manchadas pelo corante fluorescente vermelho.
2. Para ter uma melhor resolução, processe todas as imagens para achatamento de fundo e desconvolução. Defina os parâmetros como 68 μm de diâmetro da bola rolante para suavizar e medir automaticamente a função de propagação de ponto (PSF) da desconvolução de imagem com base no objetivo.
3. Para contar todas as células e bactérias qualificadas, meça a intensidade de fluorescência das células e bactérias hospedeiras e defina a intensidade de fluorescência mais fraca das células hospedeiras e bactérias como os limiares para a contagem celular. Conte todas as bactérias próximas a uma célula hospedeira a uma distância de 15 μm, pois a bactéria aderente, pois o diâmetro da célula A549 é de 10,59-14,93 μm²¹.
   NOTA: Uma configuração padrão no sistema de imagem conta seletivamente as células hospedeiras com diâmetros que variam de 5 a 100 μm e bactérias que variam de 0,2-5 μm de tamanho (largura e comprimento).
4. Com base nos resultados de processamento manual de imagem acima mencionados, aplique os parâmetros de suavização de imagem, desconvolução, tamanhos de objetos, distância e intensidades de fluorescência ao resto das imagens automatizadas. Após a análise automatizada, considere leituras críticas, como contagem total de células hospedeiras, tamanhos e formas das células, contagem total de bactérias e a contagem bacteriana média por célula hospedeira, que foi o indicador mais importante, para determinar a adesão bacteriana.
5. Exportação de dados e análise estatística
   1. Exportar os resultados analisados de todas as imagens para uma planilha (por exemplo, formato 'xlsx'). O sistema automatizado gera dois conjuntos de resultados: 1) a contagem bacteriana média aderente de cada imagem; 2) os dados informativos de cada célula hospedeira, como bactérias aderentes, contam com uma única célula, tamanho do hospedeiro e a intensidade média de fluorescência de células hospedeiras e bactérias, a partir da imagem correspondente.
   2. Calcule o número médio e o desvio padrão das contagens bacterianas aderentes de todas as imagens para representar o nível de adesão bacteriana em comparação com controles negativos. Neste método, E. coli e B. subtilis serviram como controles negativos no teste de adesão bacteriana Gram-negativa e Gram-positiva, respectivamente. Realize ANOVAs bidireis para testar uma variação significativa entre os pontos de dados em todo o tratamento para três experimentos independentes.

Resultados

Para desenvolver o ensaio de adesão bacteriana baseada em imagem de fluorescência, p. aeruginosa cepa PAO1 e sua contraparte de adesão negativa E. coli foram usados para testar a eficácia do protocolo, uma vez que a adesão dessas bactérias às células A549 havia sido relatada^14,20,22. Primeiro, a GFP, rotulada P. aeruginosa (PAO1) e E. coli, rotulada por GFP, foram co-incubadas com uma linha de...

Discussão

O protocolo descreve uma abordagem automatizada para enumerar o apego bacteriano às células hospedeiras. A abordagem descrita tem várias vantagens atraentes em relação aos métodos convencionais. Em primeiro lugar, essa abordagem permite a quantificação precisa do número de células de patógenos microbianas que estão ligadas a células hospedeiras individuais. É importante ressaltar que essa quantificação pode ser realizada sem a necessidade de colheita bacteriana laboriosa, diluições seriais, revestimento em mídia sólida e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Corante de coloração de célula hospedeira
96 poços	placa Corning	3882	Meia área bem, fundo plano
claro A549 células ATCC		CCL 185	Linha celular de mamíferos
BactoView Live Red	Biotium	40101	Centrífuga de corante de bactérias
Eppendorf	5810R
CFSE rastreador de divisão celular	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Leitor multimodo de imagem celular
E. coli			Estoque de laboratório
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC meio de cultura de células
EHEC			NIST coleta
F-12k medium	ATCC	302004	A549 meio de cultura de células Soro
fetal bovino	Corning	35-016-CV
HUVEC			Estoque de laboratório
L. monocytogenes			Coleções NIST
OD600 Dilufotômetro	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows estoque de laboratório
P. aeruginosa Δ pilA			Dr. Lori Burrows estoque de laboratório
S. agalactiae			Coleções NIST
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus Δ saeR	BEI	NR-48164
Coleções de S. rubidaea			NIST
Caldo de soja típico	Growcells	MBPE-4040